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要約

インビトロ実験を行い、可能な限り十分な生体内の状態を反映することは容易な作業ではありません。一次細胞培養物の使用は、生物全体の細胞生物学を理解するための重要なステップです。提供されたプロトコルは、正常に成長し、胚性マウス小脳ニューロンを培養する方法を概説します。

要約

一次細胞培養物の使用は、インビトロで神経系を研究するための主要なツールの一つとなっています。この簡略化されたモデルシステムを使用する究極の目標は、制御された微小環境を提供し、高い生存率と解失性ニューロンおよび非ニューロン細胞の自然な特徴を、インビトロ条件下で可能な限り維持することです。この記事では、発達中のマウス小脳から一次ニューロンを分離し、インビトロ環境に配置し、その成長を確立し、その生存率と分化を数週間監視する方法を示す。この方法は、12~18日の胚の間に小脳から解離した胚性ニューロンに適用可能である。

概要

数十年にわたり、細胞株は前臨床研究や生物学的研究において高スループットツールとして広く使用されてきました。費用対効果、急速な成長、および生きている動物の使用の減少は、これらの細胞を使用するいくつかの利点です。しかしながら、遺伝的変化およびフェノタイプ変化は、インビトロ1のいくつかの通路の後に蓄積する。細胞株の誤認と原発細胞からの遺伝的非類似性は、再現不可能な実験および誤った結論につながる可能性があります2,3,4,5.したがって、ニューロンなどの分化細胞(例えば、神経伝達物質、イオンチャネル、受容体、および他のニューロン特異的タンパク質)に対するいくつかの類似性にもかかわらず、ニューロン細胞株はニューロンの完全な表現型を複製することができません。成熟したニューロンを使用することは別のオプションです。しかしながら、これらの細胞は、培養中に伝播することが困難な非分裂後細胞である。また、細胞周期への再突入は、アポトーシス6を沈殿させ得る。

三次元(3D)細胞培養、オルガノチピックスライス培養、オルガノイド培養物は、細胞がインビボ設定を模倣する3D形態に配置できる環境を提供するために開発されました。従って、細胞間通信、遊走、周囲組織への腫瘍細胞の浸潤、及び血管新生を研究することができる7。しかし、エキストラセルラーマトリックス(ECM)タンパク質または合成ヒドロゲルを寝具として使用する追加コスト、イメージングの難しさ、および高スループットスクリーニング機器との互換性は、3D細胞培養の大きな欠点です。組織組織スライス培養の主な欠点は、多数の動物の使用と軸索の標的および成長因子のアクセス不能につながる軸索の悪影響であり、その結果、神経死8。

したがって、細胞株の問題、成熟細胞の増殖の難しさ、および組織の複雑さを回避する代替アプローチは、未熟な一次細胞のインビトロ成熟である。一次細胞は、ヒトまたは動物組織から直接誘導され、酵素および/または機械的方法9を使用して解離される。培養培地における単離、播種、および維持の主な原則は、組織源に関係なく類似している。しかしながら、増殖および成熟を促進するために必要な栄養因子は、非常に細胞特異的6である。

各小脳細胞型の「生年月日」を知ることは、一次培養実験を設計するための前提条件です。一般に、プルキンエ細胞(PC)および小脳核(CN)のニューロンは、インターニューロン(例えば、バスケット、星細胞)および顆粒細胞を含む小さな細胞の前に生まれる。マウスでは、PCは胚の日(E)10-E13の間に出現し、CNニューロンはおよそE9-E1210で出現する。

他の小脳ニューロンはずっと後に生まれる。例えば、マウスでは、細胞間ニューロンのゴルジ亜集団はVZ(〜E14−E18)から生成され、分子層に位置する残りのインターニューロン(バスケット細胞および星状細胞)は、初期の間に白色物質中の前駆細胞を分割することから出現する出生後 (P)0–P711.顆粒細胞は、ロストラル菱形唇に由来する二次生殖帯(EGZ)から生成され、出生後に末端分裂を経る。しかし、彼らの前駆体がE13-E16の菱形唇から生じる前に、細胞はすでに小脳の肛門の後ろ面に細胞の薄い層を作るためにピア表面に沿ってロストリカルに移行している。心室神経上皮に由来するアストロサイトやオリゴデンドロサイトなどの非神経細胞は、それぞれE13.5-P0およびP0−P7で11、12、13、14で生まれる、15.ミクログリアは、E8-E10間の黄黄嚢原始的な骨髄前駆細胞に由来し、中枢神経系に侵入した後、E916によってマウス脳内で検出することができる。

本稿で提示する方法は、ウィスターラットセレベラ由来のプルキンジェ細胞の一次培養に最適化された古谷ら、17、18、18、すなわち、古谷ら、17、18が開発したものに基づいている。我々は今、この方法を適応させ、マウス小脳ニューロン19の成長を研究するために慎重にそれを変更しました。私たちの新しいプロトコルとは異なり、コールド解剖媒体は、古谷のプロトコル17に播種媒体を追加する前に解離および解離ステップ中に使用される主な洗浄バッファである。この緩衝液は、前述のステップ中に細胞の成長と生存をサポートするために必要な栄養、成長因子、およびホルモン(ダルベッコの改変イーグル培地:栄養混合物F-12[DMEM/F12]のすべて)を欠いている。さらに、マウス一次小脳培養に関する豊富な経験に基づき、各ウェル(1mLではなく)で500μLの培養培地を使用し、神経細胞の成長を改善するトライヨードサイロニン濃度を0.5ng/mLに増加させました。特にプルキンエ細胞表現型のものを有し、培養中の樹状枝の増殖を促進する。この記事で取り上げられている主な方法は、胚発生中に他の小さなげっ歯類(例えば、リスやハムスター)に広く適用することができ、様々な胚期における小脳神経新生と分化を研究するために使用することができます。種間で異なる。

プロトコル

すべての動物の手順は、制度的な規制とカナダ動物ケア協議会の実験動物のケアと使用に関するガイドに従って行われ、地元当局によって承認されています(「バンナティンキャンパス動物ケア」委員会")。使用される動物の数と苦しみを最小限に抑えるために、すべての努力がなされました。麻酔の十分な深さは、操作およびつま先ピンチまたは角膜反射に関連する呼吸数に変化がないことを観察することによって確認された。

1. 準備

注:ポストコンセプトE12-E18の研究計画に基づいて、タイミング妊娠マウスの提供をスケジュールします。タイミングの選択は、所望の細胞特性に依存する(下記参照)。実験の少なくとも2日前にカバースリップとプレートを準備します。ポリL-オルニチンは、カバースリップへの細胞付着を増強するコーティング材料として使用されます。

  1. カバーをコートして、細胞分離の2日前にスリップします。
    1. ラウンドカバースリップを24ウェルプレートに置き、生体安全キャビネット内の滅菌条件下に置きます。汚染を避けるために、各カバースリップの間に隙間を残します。
    2. 各カバースリップの中心に90μLのポリL-オルニチン(PLO、500 μg/mL)を加えます。キャップを閉じ、37 °C/5% CO2インキュベーターに2日間ゆっくりとプレートを置きます。
      メモ:インキュベーション中にカバースリップから大きなボリュームがこぼれる場合があります。カバースリップは、ドロップを配置した後、PLOで完全に覆われる必要はありません。夜間インキュベーション中、PLOはカバースリップの端に均等に分配します。
  2. 細胞単離の1日前に、培養培地I(プトレシン100μMを含有するDMEM/F-12、セレニトナトリウム30nM、L-グルタミン3.9mM、ゲンタマイシン3.5μg/mL、トリヨウヨドサイロニン(T3)0.5ng/mL、N3サプリメント[プロゲスターテン40,m0m,インスリン20m,s0mm.mm.mm.mmトランスフェリン20mg/mL])及び播種培地(培養培地I[N3及びT3を含まない]10%ウシ血清[FBS])を含有し、それらを4°Cに保存する。トリプシン作業ソリューションの準備 (0.25%)DMEM/F12で、4°Cに保ちます。
    注: メディア構成は表 1に示されています。
  3. 細胞単離の日には、培養培地Iと播種培地を37°Cのインキュベーターに入れる。
    注:小脳の分離を開始する前に、すべての工具と作業面が無菌であることを確認してください。
  4. カバースリップを洗います。
    1. インキュベーターから24ウェルプレートを取り出します。
    2. 24ウェルプレート3xのカバースリップを、滅菌条件下のバイオセーフティキャビネットで二重蒸留水(DDW)で洗浄します。毎回カバーが吸引を開始する前に5分間DDWに浸漬させてください。
    3. カバースリップは、少なくとも2時間は完全に乾燥するためにバイオセーフティキャビネットに残します。

2. 小脳コレクション

  1. 氷冷1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を充填した10cm滅菌プラスチックペトリ皿3個、氷冷1xハンクのバランス塩溶液(HBSS)で満たされた3ペトリ皿、および氷冷解剖培地(1x HBSS)で満たされた約5ペトリ皿を準備するゲンタマイシン10μg/mL)を含有する。氷の上に置いておきなさい。
  2. 40%のイソフルランでE18 CD1妊娠中のマウスを麻酔する。マウスで子宮頸部脱臼を行います。70%エタノール溶液で腹部を殺菌します。
  3. はさみを使用して、陰部交神経からキシホイドプロセスへの皮膚切開を行います。その後、鉗子で皮膚を保持し、腹腔を開きます。
  4. 鉗子で子宮の角を取り出し、氷の上の氷冷1x PBSでそれらを3x洗浄します。
    注:代謝率を最小限に抑え、組織や細胞の損傷を防ぐために、以下の手順をすべて氷上で行う必要があります。

3. 小脳の解剖

  1. 最後の洗浄工程の後、1x HBSSで子宮から胚を分離し、氷冷解剖培地に移す微細な鉗子のペアを使用する。解剖培地で、胚をはさみで切り落とします。組織をきれいな解剖媒体に入れ。
    メモ:マイクロディセクションにステレオ顕微鏡を使用することはオプションです。
  2. 細かい鉗子で頭蓋骨を保持し、頭蓋骨の側面から、頭蓋のマグナムから外的な音響肉と軌道腔の下側の境界までのラインで小さなはさみでカルバリウムを切断します。
    注:このステップを取ると、頭蓋骨の基部のレベルで頭蓋腔が露出し、脳を除去することが容易になります。
  3. 細かい鉗子のペアを使用して、頭蓋骨の基部を取り除き、頭蓋骨を脳から剥がします。
  4. 中小脳ペダンクルとポンの横面から始めて、小脳の髄痛を慎重に取り除きます。
  5. 小脳のペダンクルを両方切り、脳の残りの部分から小脳を分離します(図1)。
  6. 直ちに採取したセレベラを、14 mLのDMEM/F12を氷上に充填した滅菌15mL円錐チューブに入れます。
  7. チューブを1,000 x g、4°Cで1分間、3倍に遠心分離します。毎回ピペットで上清をそっと取り除き、新鮮な氷冷DMEM/F12でペレットを再サスペンドします。
    メモ:サンプルを失うことを避けるため、キャビネットの吸引はできるだけ少なくしてください。

4. 小脳解離

  1. ステップ3.7からペレットに2mLのトプシン(37°)を加え、十分な混合のために穏やかにピペットを加えます。
  2. チューブを37°水浴に12分間置きます。
  3. インキュベーション後、チューブをバイオセーフティキャビネットに持ち込み、DMEM/F12を10mL加えてトリプシンを不活性化します。
  4. 混合物を1,200 x gで5分間遠心分離します。3x を繰り返します。
  5. DMEM/F12で滅菌プラスチック転写ピペットをプリウェット。
  6. 洗浄と最終遠心分離後、3.5mLのDNase作業溶液(DNase I原液の1 mL[0.05%DNase + 12 mM MgSO4 + 1x HBSS]を500μLの熱不活性化FBSと2mLのDMEM/F12)を同じチューブ内のペレットに追加します。
  7. 混合物が均質な乳白色になるまで、少なくとも30倍のピペットで組織をトリチュレートする。

5. 細胞回収

  1. 混合物に10 mLの氷冷DMEM/F12を加えます。
  2. 試料を1,200 x gで遠心分離し、4°Cで5分間行う。
  3. ペレットを邪魔することなく、慎重に上清を取り除いてください。
  4. インキュベーターから播種培地を取り除きます。
  5. 500°Lの前温播培地をペレットに加え、ピペットを使って細胞を再サスペンドします。
  6. ヘモサイトメーターを使用して細胞を数えます。
  7. 播種培地で細胞懸濁液を5x105細胞/mLの密度に希釈します。
  8. バイオセーフティキャビネットの下で、薄めた混合物の90°Lをカバースリップの中央の各ウェルに加えます。
    注: DNase で中断しなかったパーティクルはロードしないでください。
  9. 3−4時間のインキュベーターにプレートを置きます。
  10. インキュベーション後、500μLの前温培養培地Iを各ウェルに加え、プレートをインキュベーター(37°)に戻します。

6. 回収細胞の治療

  1. 7日後、古培地を新鮮培養培地IIに置き換える(培養培地iはシトシンアラビノシド[Ara-C,4 μM]および100μg/mLウシ血清アルブミン[BSA]を補う;表1参照)。
    注:このステップは、非神経細胞の増殖を避けるために重要です。
  2. 培養培地を1日1回監視します。pHが変化した場合(通常は黄色い色の著しい変化によって示されます)、すべてのウェルから古い培地の半分(ほぼ250°L)を取り除き、それらのそれぞれに300μLの予備培養培地Iを加えて栄養損失を避けます。
    注:培養培地中のフェノールレッドは、培地のpHおよび細胞の活性の良好な指標である。細胞のインキュベーター状態からの暴露時間を最小限に抑えるようにしてください。これにより、生存率に影響を与える可能性のあるストレスを防ぐことができます。

7. 細胞の収集と固定

注:実験計画に応じて、細胞はいつでも、任意の日に収集することができます。

  1. 対応する数値組織を持つ別の24ウェルプレートを準備し、各ウェルに4%パラホルムアルデヒド(PFA)の100°Lを追加します。
  2. 所望の日に細胞を収穫するには(実験プロトコルに応じて)、元の培養プレートのウェルからカバースリップを軽く取り除き、PFA充填プレートの対応するウェルに入れます。
  3. カバースリップを完全に浸すために井戸にPFAを追加します。
    メモ:カバースリップからセルが取り外されないようにするには、カバースリップにPFAを直接追加しないでください。
  4. PFAプレートは30−120分間4°Cに保ちます。
  5. インキュベーション後、プレートを室温に戻します。
  6. カバースリップを1x PBSで5分間軽く洗います。
  7. 免疫染色プロセスに進みます。
    注:本研究では、カメラを搭載した蛍光顕微鏡を用いて画像を撮像し、画像編集ソフトウェアアプリケーションを用いてモンタージュに組み立てた。

結果

小脳における神経サブタイプの異なる生年月日に基づいて、E12−E18マウス胚からの培養物は異なる細胞型を生み出した。CNニューロン(E9-E12)やPC(E10-E13)などの大きな突起ニューロンは、小脳の発達中に早期に出現した。マウスでは、顆粒細胞とゴルジ細胞は~E13-E18の間に生じ、出生後第4週まで末端分裂を受けた。

古い培地Iをインビトロ(DIV)7の日に新鮮な培地IIに置き換え?...

ディスカッション

一次培養物の使用は、すべてのタイプのニューロン17、18、19に適用可能なよく知られた方法である。提示されたプロトコルでは、小脳ニューロンを分離し、最大3週間の体外で最適な生存を有する生存率を維持する方法を説明する。E15-E18で単離された小脳細胞の一次培養は、PC、ゴルジ細胞、およびCNの3つのクラスの大き?...

開示事項

著者たちは何も開示する必要はない。

謝辞

これらの研究は、自然科学・工学研究評議会(HM:NSERCディスカバリー補助金#RGPIN-2018-06040)、マニトバ州小児病院研究所(HM:グラント#320035)、およびALSカナダ脳カナダアーサーJからの助成金によって支えられました。ハドソントランスレーショナルチームグラント(JK、HM)。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Adobe Photoshop CS5 Version 12Adobe Inc
Anti-Sodium Channel (SCN)PN4 (Nav1.6)SigmaS04383 μg/mL
Bovine Serum AlbuminMillipore SigmaA3608
CALB1Swant Swiss Antibodies (Polyclonal)CB381/5000 dilution
CALB1Swant Swiss Antibodies (Monoclonal)3001/1000 dilution
Cytosine β-D-arabinofuranoside or Cytosine Arabinoside (Ara-C)Millipore SigmaC1768
DNase I from bovine pancreasRoche11284932001
Dressing ForcepsDelascoDF-45
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM-F12)Lonza12-719F
Fisherbrand Cover Glasses: Circlesfisher scientific12-545-81
GentamicinGibco15710-064
Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS)Gibco14185-052
Insulin from bovine pancreasMillipore sigmaI5500, I6634, I1882, and I4011
Large ScissorStoelting52134-38
L-glutamineGibco25030-081
Metallized HemacytometerHausser Bright-Line3100
Microdissection ForcepsMerlan624734
Pattern 5 TweezerDixon291-9454
Phosphate Buffered Saline (PBS)Fisher BioReagentsBP399-26
Poly-L-OrnithineMillipore SigmaP4638
Progesteron (P4)Millipore sigmaP8783
PVALBSwant Swiss Antibodies2351/1500 dilution
Samll ScissorWPI Swiss Scissors, 9cm504519
Sodium SeleniteMillipore SigmaS9133
TransferrinMillipore SigmaT8158
Tri-iodothyronine (T3)Millipore SigmaT2877
TrypsinGibco15090-046
Zeiss Fluorescence microscopeZeissZ2 Imager

参考文献

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