كدمه أصابه الحبل الشوكي عن طريق استئصال الصفيحة الجراحية المجهرية في Axolotl التجديدي

Summary

تعرض هذه المخطوطة البروتوكولات الخاصة بإلحاق إصابات النخاع الشوكي الحاده والحاده المتحكم بها جراحيا إلى قنفذ التجديدي (المكسيكوما المكسيكية).

Abstract

والغرض من هذه الدراسة هو إنشاء نموذج موحده وقابله للتكرار التجدد أصابه الحبل الشوكي حاده في قنفذ (امستوما المكسيكي). معظم إصابات النخاع الشوكي السريرية تحدث كصدمات حاده الطاقة العالية ، ويحفز إصابات كدمه. ومع ذلك ، أجريت معظم الدراسات في الحبل الشوكي قنفذ مع صدمات حاده. التالي ، تهدف هذه الدراسة إلى إنتاج نموذج تجديدي أكثر ملاءمة سريريا. نظرا لقدرتها الرائعة علي تجديد اي نسيج تقريبا ، يتم استخدام axolotls علي نطاق واسع كنماذج في الدراسات التجديدية وقد استخدمت علي نطاق واسع في الدراسات أصابه الحبل الشوكي (SCI). في هذا البروتوكول ، يتم تخدير الaxolotls بالغمر في محلول بنزوكايين. تحت المجهر ، يتم اجراء شق الزاوي ثنائيا علي مستوي الذيليه فقط إلى الأطراف الخلفية. من هذا الشق ، فمن الممكن لتشريح وفضح العمليات الشائكة. باستخدام ملقط ومقص ، يتم اجراء استئصال الصفيحة علي مستويين ، مما يعرض الحبل الشوكي. يتم إنشاء جهاز الصدمات المخصصة التي تتكون من قضيب السقوط في اسطوانه ، ويستخدم هذا الجهاز للحث علي أصابه كدمه في الحبل الشوكي. ثم يتم خياطه الشقوق ، ويتعافى الحيواني من التخدير. النهج الجراحي ناجح في تعريض الحبل الشوكي. يمكن ان تنتج اليه الصدمات إصابات كدمه في النخاع الشوكي ، كما تؤكد ذلك الانسجه ، والتصوير بالرنين المغناطيسي ، والفحص العصبي. وأخيرا ، يجدد الحبل الشوكي من الاصابه. الخطوة الحاسمة في البروتوكول هي أزاله العمليات الشائكة دون إلحاق الضرر بالحبل الشوكي. وتتطلب هذه الخطوة التدريب لضمان اجراء أمن. وعلاوة علي ذلك ، إغلاق الجرح يعتمد إلى حد كبير علي عدم إلحاق اضرار لا لزوم لها علي الجلد اثناء الشق. تم تنفيذ البروتوكول في دراسة معشاه من 12 الحيوانية.

Introduction

وكان الهدف العام لهذه الدراسة لإنشاء طريقه الجراحية الدقيقة التي تسيطر عليها واستنساخها للحاق الخيال العلمي الحاد والحاد إلى قنفذ (امستوما المكسيكي) ، وإنتاج نموذج التجدد أصابه الحبل الشوكي.

الخيال العلمي هو حاله خطيره ان, اعتمادا علي مستوي ومدي, يلحق الاعاقه العصبية إلى الأطراف جنبا إلى جنب مع ضعف المثانة والأمعاء السيطرة^1,2,3. معظم الخيال العلمي هي نتيجة لصدمات حاده الطاقة العالية مثل حوادث المرور ويسقط^4,5. الإصابات الحاده نادره جدا. ولذلك ، فان النوع الأكثر شيوعا أصابه المجهري هو كدمات.

الجهاز العصبي المركزي الثدييات (CNS) هو نسيج غير التجديدية ، التالي لا استعاده الانسجه العصبية بعد الخيال العلمي وينظر^6،7،8. من ناحية أخرى ، بعض الماشية لديها قدره مثيره للاهتمام لتجديد الانسجه ، بما في ذلك الانسجه العصبية. واحده من هذه الكائنات هي axolotl. ويستخدم علي نطاق واسع في دراسات البيولوجيا التجديدية وهو من الفائدة في تجديد الحبل الشوكي ، لأنه هو فقاري^{9،10،11،12}.

يتم اجراء معظم الدراسات العلمية في قنفذ اما بتر الذيل بأكمله أو الاجتثاث من جزء أكبر من الحبل الشوكي^9,10,11,12. في الاونه الاخيره ، تم نشر دراسة جديده علي إصابات حاده¹³ ان يحاكي الحالات السريرية أفضل. في حين ان البتر الزائد الكامل في قنفذ يؤدي إلى التجديد الكامل ، فان بعض الظواهر التجديدية غير القائمة علي البتر تعتمد علي عيب الحجم الحرج (المصلحة العامة)^14،15. وهذا يعني ان الإصابات التي تتجاوز عتبه حرجه لا تجدد. لتطوير نموذج التجدد مع القيمة السريرية اعلي الانتقالية ، والتحقيق في هذه الدراسة ما إذا كان 2 مم صدمه حاده تتجاوز الحد الأقصى للجنة التنمية المستدامة.

هذا الأسلوب هو ذات الصلة للباحثين العاملين علي تجديد الحبل الشوكي في نماذج الحيوانية الصغيرة ، وخاصه في axolotl. وعلاوة علي ذلك ، قد يكون من المصلحة العامة ، لأنه يسلك وسيله لاستخدام المعدات المختبرية القياسية لتطوير اليه الصدمات الحاده التي هي مناسبه للاستخدام في الماشية الصغيرة بشكل عام.

Protocol

وقد اتبعت خلال هذه الدراسة جميع الانظمه المؤسسية والحكومية المعمول بها فيما يتعلق بالاستخدام الأخلاقي للحيوانات. وأجريت الدراسة ببموجب رقم الموافقة: 2015-15-0201-0061 من جانب المفتشيه الدانمركية لتجربه الماشية. وكانت الكائنات المكسيكية axolotls (أمبولي المكسيكوما، ويعني كتله الجسم ± STD: 12.12 غرام ± 1.25 g).

1-الاعداد

1. اعداد قنفذ للتخدير.
   1. استخدام عاليه الجودة غير المعالجة كيميائيا ماء الصنبور. إذا لم تكن متوفرة ، استخدم 40% Holtfreter الحل.
   2. ذوب 200 ملغ من ايثيل 4-امينوبنينزواتي (بنزوكايين) في 3 مل من الأسيتون. حل هذا الحل في 1 لتر من مياه الصنبور أو 40% Holtfreter للحل.
2. استخدام طبق بيتري القياسية (100 مم في القطر) وضعت تحت مجهر ستيريو كجدول الجراحية. ضع قطعه قماش النسيج الجراحية علي طبق بيتري.
   ملاحظه: استخدام طبق بيتري كمنطقه جراحيه تمكن من تحريك ودوران الحيوانية دون لمسها ، وضمان استقرار العمود الفقري اثناء الجراحة.
3. اعداد جميع الاداات الجراحية المجهرية المعقمة (مثل المقص والملقط التشريحي).

2-التخدير

1. ضع قنفذ في وعاء مع محلول البنكوكين لمده 45 دقيقه تقريبا لضمان التخدير العميق والمستقر.
   ملاحظه: تركيز معين من البنكوكين سوف يسبب التخدير في جميع الاحجام من axolotls.
2. البحث عن علامات التخدير العام في غضون 30-45 دقيقه. وتشمل هذه الحالات الافتقار الكامل لحركات الجيل ، والمنعكس اليميني ، أو الاستجابة لمحفزات لمسيه أو مؤلمه (قرص لطيف من اصبع القدم علي شبكه الإنترنت).
3. للحفاظ علي التخدير ، والتفاف الكائنات في المناشف الورقية المبللة في محلول التخدير. بلل هذه بانتظام مع هذا الحل خلال العملية الجراحية لضمان الحفاظ علي الجلد والخياشيم رطبه.
4. استعاده الحيوانية بعد الجراحة عن طريق وضعها في وعاء يحتوي علي مياه الصنبور الطازجة. لاحظ علامات الانتعاش ، مثل حركه الجيل واستعاده منعكس اليمين ، في غضون 1 ح¹⁶.

3. استئصال الصفيحة الجراحية المجهرية

ملاحظه: يتم اجراء استئصال الصفيحة تحت مجسم فراغي.

1. وضع الحيوانية في موقف المعرضة علي طبق بيتري. التفاف عليه في المناشف الورقية بحيث يتعرض الذيل.
   ملاحظه: المناشف الورقية ممتازة لضمان الاستقرار طوال العملية.
2. تحديد الأطراف الخلفية. جعل الشق الأول مجرد الذيليه لهم.
   1. مع زوج من المقصات الصغيرة ، قم باجراء شق عمودي من العارضة حتى يتم الشعور بالبروز العظمي للعمليات الشائكة.
      ملاحظه: كن حذرا جدا عند استيعاب العارضة والجلد مع ملقط ، لان هذه تلحق بسهوله الضرر علي الجلد الحساس.
   2. تمديد قطع أفقيا ، التالي فان الشق يخترق عرض كامل من الذيل.
   3. فهم عمليه سبينوس مع ملقط لضمان العمق الصحيح.
   4. توسيع الشقوق العمودية 1 ملم تحت العملية الشائكة علي كلا الجانبين.
3. ضع الحيوانية علي جانب واحد لاجراء شقوق بطنيه وافقيه كما هو مبين أدناه.
   1. مع زوج من المقص الصغير ، بدءا من النقطة البطنية لشق عمودي ، وجعل شق أفقي من حوالي 15 ملم للحيوانات 10-20 غرام في الوزن. جعل الشق أطول للحيوانات الكبيرة ، وأقصر للحيوانات الصغيرة.
   2. باستخدام المقص ، تشريح الوسيط من خلال شق أفقي حتى يشعر العمود الفقري في خط الوسط.
   3. كرر الخطوات 3.3 ، 3-3-1 ، و 3-3-2 علي الجانب الآخر من الحيوانية.
4. بعد تشريحها في الطائرة الوسطي العميقة من كلا الجانبين ، تشريح من خلال خط الوسط ، التالي ربط الشقين الأفقي.
   1. تحريك قطعه حره من الذيل وعارضه إلى جانب واحد ، وفضح العمليات سبينوس (الشكل 1).
   2. Fixate قطعه الذيل باستخدام المناشف الورقية الرطب.
5. وضع الحيوانية في موقف المعرضة مره أخرى مع الراس الذي يواجه الجانب الجراح غير المهيمنة.
   1. مع زوج من الملقط ، وفهم العمليات سبينوس فقط الذيليه إلى أطرافه الخلفية. تطبيق رفع لطيف علي حد سواء صعودا ونحو راس الحيوانية.
   2. ضع شفرات زوج من المقص الصغير الأفقي حول العملية واقطعها برفق. الرفع علي العملية يضمن ان يتم الآن ازالته ، وتعريض الحبل الشوكي.
   3. فهم العملية الشائكة فقط الذيليه إلى واحد التي تم ازالتها فقط وكرر الخطوات 1 ، 3-5 و 3.5.2.
      ملاحظه: وهذا ينبغي ان يترك الحبل الشوكي المكشوفة المقابلة لمستويين الفقري. عند اجراء استئصال الصفيحة الفقرية ، غالبا ما يظهر إفراز رغوي ابيض. يتم تحديد الحبل الشوكي بسهوله من خلال تالقه المميز ، إلى جانب السفينة التي تعمل علي طول الخط الأوسط.
   4. اعتمادا علي حجم الحيوانية ، فان المنطقة المعرضة قد لا تكون واسعه بما فيه الكفاية. باستخدام زوجين من الملقط ، وفهم الصفيحة علي جانبي الحبل الشوكي وتطور هذه أفقيا مع حركه لطيف.

4. إدخال أصابه نوع الكدمة (الشكل 2)

1. الحفاظ علي الحيوانية في موقف المعرضة.
2. استخدام طبق بيتري لنقل الحيوانية إلى وحده الصدمات.
3. وقد مساعد تالق مصباح يدوي علي الحبل الشوكي.
4. ضع اسطوانه وحده صدمات الكدمة فوق الحبل الشوكي المكشوف باستخدام المتحكمين في الوحدة. الهدف من خلال الاسطوانه.
5. خفض الاسطوانه حتى يكون المستوي مع الصفائي.
6. نعلق قضيب السقوط علي المغناطيس الكهربائي. ضع اسطوانه تعديل الارتفاع المطلوبة علي وحده الصدمات.
7. ضع قضيب السقوط في الاسطوانه.
   ملاحظه: لدراسة اعمي ، يجب علي الجراح الآن مغادره الغرفة دون معرفه ما إذا كان سيتم تعيين الحيوانية لأصابه أو مجموعه الجراحة الصورية.
8. أطفئ المغناطيس الكهربائي يقع القضيب علي الحبل الشوكي المكشوف.
9. استخدام المسمار تعديل الارتفاع لرفع قضيب من الحبل الشوكي.
10. تاكيد الاصابه من خلال النظر في الحبل الشوكي من خلال المجهر. سيظهر الموقع المصاب أكثر قتامة ، سيكون النزيف من السفينة الوسطي واضحا.

5. إدخال أصابه حاده

ملاحظه: تنفيذ هذه الخطوات بعد 3.5.4.

1. مع زوج من مقص صغير قطع الحبل الشوكي في قطع عمودي الكمال.
2. كرر قطع 2 مم إلى الجانب الذيليه من الجسم.
   ملاحظه: يمكن تعديل طول القطعة المزالة من الحبل الشوكي وفقا لمتطلبات الدراسة. ومع ذلك ، فان قطع 2 مم يكون regenerable¹⁰.
3. تاكد من اكتمال التخفيضات. عند الانتهاء ، ويشعر ريش مقص كشط علي طول الجزء البطني من القناة الشوكية.
4. رفع الجزء 2 مم من الحبل الشوكي من القناة الشوكية.

6. إغلاق الجرح الجراحي

1. أعاده الحيوانية إلى الجدول الجراحي. في دراسة اعمي ، وأعاده وضع عارضه حتى الحبل الشوكي غير مرئية للجراح.
2. الحفاظ علي الحيوانية في موقف المعرضة.
   1. بدء وضع الغرز النايلون 10.0 من الجزء الأكثر الذيليه من الشق الأفقي. اغلق الجروح في طبقه واحده.
      ملاحظه: لا تفهم الجلد ضيق جدا ، لأنه سوف يسبب نخر.
   2. العمل نحو الجزء العمودي من الشق.
   3. عند الوصول إلى الزاوية ، قم بتشغيل طبق بيتري وخياطه الشق الأفقي الآخر.
   4. اضبط الغرز علي الشقوق العمودية.
   5. لا تضع الغرز في الجزء العلوي من العارضة ، لان الجلد هنا لن تكون قادره علي الاستمرار.

7. أعاده الحيوانية إلى الحل الخالي من المخدرات

1. رفع طبق بيتري مع الحيوانية والغمر علي حد سواء برفق جدا في المياه العذبة فقط 5 سم العميق والسماح للحيوان الشريحة قباله.
   ملاحظه: عمق المياه الضحلة يضمن ان الحيوانية لن تحاول السباحة إلى السطح للتنفس.
2. لا تقم بتغيير الماء خلال الأسبوع الأول.
3. عند إطعام الماشية ، تاكد من وضع الطعام بالقرب من راس الحيوانية.
   ملاحظه: والغرض من هذه التدابير هو تجنب أكبر قدر ممكن من الحركة خلال الأسبوع الأول.

8. الموجات فوق الصوتية بعد الجراحة

1. قبل إنهاء التخدير ، استخدم نظام الموجات فوق الصوتية عاليه التردد للحصول علي صور للاصابه التي يمكن استخدامها لبناء صور ثلاثية الابعاد لموقع الخيال العلمي.
2. إرفاق محول إلى الجزئية ويفضل ان يحكمها عصا التحكم عن بعد.
3. دمج الحيوانية تخدير في موقف المعرضة في وعاء صغير مليئه محلول مخدر.
   ملاحظه: إصلاح الحيوانية مع أكياس الرمل مصغره أو غيرها من المعدات لتجنب الحركة اثناء تسلسل المسح الضوئي.
4. محاذاة غيض من محول مع محور طول الحيوانية وتحت دمجها في محلول بنزوكايين حتى انها ليست سوي بضعة ملليمترات فوق العارضة وراء الأطراف الخلفية للحيوان.
5. تحديد موقع الخيال العلمي.
   ملاحظه: يمكن التعرف علي موقع الاصابه بسهوله بسبب العمليات الشائكة المفقودة مباشره فوق الخيال العلمي.
6. تحسين الصورة عن طريق ضبط إعدادات الموجات فوق الصوتية. تاكد من ان موقع الخيال العلمي في وسط الصورة. اضبط مجال العرض (اي عمق الصورة وأزاحه العمق وعرض الصورة) لتغطيه موقع SCI والانسجه الصحية المجاورة. اضبط المكسب ثنائي الابعاد لتحسين تباين الصورة.
7. من خلال كنس محول الموجات فوق الصوتية عبر موقع الخيال العلمي مع الاداره الجزئية التي تعمل الكترونيا ، والحصول علي الصور الوضع B تغطي موقع الخيال العلمي في عده مواقع شريحة متعددة القطاعات السهمي ، مع شرائح متتالية مع فاصل بين الشرائح من 50 μm. الحصول علي الصور السينمائية التي تحتوي علي 500 إطارات مع معدل اطار من ~ 50 إطارات/ثانيه وتردد محول من 40 ميغاهيرتز.
   ملاحظه: يتطلب هذا الاعداد التفصيلية الكترونيه التي تحكمها عصا التحكم عن بعد (الخطوة 8.2).
8. بعد الانتهاء من المسح تسلسل العودة إلى الخطوة 7.

النتائج

والغرض من البروتوكول هو إنتاج الخيال العلمي الذي سيشل السيارات والوظائف الحسية الذيليه إلى الاصابه. لان قنفذ هو تجديد-المختصة فانه يستعيد وظيفة في غضون أسابيع ، مما يسمح للباحثين لدراسة التجدد CNS خلال فتره زمنيه قصيرة.

تم توفير التخدير لمده 45 دقيقه لجميع الكائنات ، ولم تشهد...

Discussion

لان خطر الاصابه بالحبل الشوكي مهم ، فان الخطوات الحاسمة للبروتوكول هي أزاله العمليات الحاده وتوسيع الوصول العظمي إلى القناة الشوكية إذا لزم الأمر. وكما ذكر في البروتوكول ، ينصح بشده بازاله معظم عمليه الجمجمة أولا. وهذا يعني ان العمليات أكثر الذيليه حماية الحبل الشوكي من التعرض للضرب من ق?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
25 g custom falling rod	custom home made
30 mm PVC pipe	custom home made
Acetone	Sigma-Aldrich	67-64-1	Propanone
Axolotl (Ambystoma mexicanum)	Exoterra GmbH	N/A	12-22 cm and 10 g - 80 g, All strains (wildtype, melanoid, white, albino, transgenic white with GFP)
Benzocain	Sigma-Aldrich	94-09-7	ethyl 4-aminobenzoate
Electromaget	custom home made
Excel 2010	Microsoft	N/A	Excel 2010 or newer
ImageJ	National Institutes of Health		ImageJ 1.5e or newer. Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, https://imagej.nih.gov/ij/, 1997-2016.
Kimwipes
Microsurgical instruments	N/A	N/A	Forceps and scissors
MS550s	Fujifilm, Visualsonics	MS550s	40 MHz center frequency, transducer
MS700	Fujifilm, Visualsonics	MS700	50 MHz center frequency, transducer
Petri dish	any maker
Soft cloth	N/A	N/A	Any piece of soft cloth measuring approximately 70 x 55 cm2 e.g. a dish towel
Stereo microscope
Vevo 2100	Fujifilm, Visualsonics	Vevo 2100	High frequency ultrasound system