Lesión de la médula espinal de la contusión a través de una laminectomía microquirúrgica en el Axolotl regenerativo

Resumen

Este manuscrito presenta protocolos para infligir quirúrgicamente lesiones de médula espinal controladas y afiladas a un axolotl regenerativo (Ambystoma mexicanum).

Resumen

El propósito de este estudio es establecer un modelo estandarizado y reproducible de lesión de la médula espinal contundente regenerativa en el axolotl (Ambystoma mexicanum). La mayoría de las lesiones clínicas de la médula espinal se producen como traumatismos contundentes de alta energía, lo que induce lesiones por contusión. Sin embargo, la mayoría de los estudios en la médula espinal axolotl se han realizado con traumas agudos. Por lo tanto, este estudio tiene como objetivo producir un modelo regenerativo más relevante clínicamente. Debido a su impresionante capacidad para regenerar casi cualquier tejido, los axolotls son ampliamente utilizados como modelos en estudios regenerativos y se han utilizado ampliamente en estudios de lesión de la médula espinal (SCI). En este protocolo, los axolotls son anestesiados por inmersión en una solución de benzocaína. Bajo el microscopio, se realiza una incisión angular bilateralmente a un nivel justo caudal a las extremidades posteriores. A partir de esta incisión, es posible diseccionar y exponer los procesos espinosos. Usando fórceps y tijeras, se realiza una laminectomía de dos niveles, exponiendo la médula espinal. Se construye un dispositivo de trauma personalizado que consiste en una varilla que cae en un cilindro, y este dispositivo se utiliza para inducir una lesión de contusión en la médula espinal. Las incisiones se suturan y el animal se recupera de la anestesia. El enfoque quirúrgico es exitoso en la exposición de la médula espinal. El mecanismo de traumatismo puede producir lesiones por contusión en la médula espinal, como lo confirma la histología, la resonancia magnética y el examen neurológico. Finalmente, la médula espinal se regenera a partir de la lesión. El paso crítico del protocolo es eliminar los procesos espinosos sin infligir daño a la médula espinal. Este paso requiere capacitación para garantizar un procedimiento seguro. Además, el cierre de la herida depende en gran medida de no infligir daños innecesarios a la piel durante la incisión. El protocolo se realizó en un estudio aleatorizado de 12 animales.

Introducción

El objetivo general de este estudio fue establecer un método microquirúrgico controlado y reproducible para infligir SCI contundente y agudo al axolotl (Ambystoma mexicanum), produciendo un modelo de lesión regenerativa de la médula espinal.

El Lico de SCI es una afección grave que, dependiendo del nivel y la extensión, inflige discapacidad neurológica a las extremidades junto con deterioro de la vejiga y el control intestinal^1,2,3. La mayoría de sCI son el resultado de traumas contundentes de alta energía como accidentes de tráfico y caídas^4,5. Las lesiones bruscadas son muy raras. Por lo tanto, el tipo de lesión macroscópica más común son las contusiones.

El sistema nervioso central de los mamíferos (SNC) es un tejido no regenerativo, por lo tanto no se ve restauración del tejido neurológico después de SCI^6,7,8. Por otro lado, algunos animales tienen una capacidad intrigante para regenerar tejidos, incluyendo el tejido del SNC. Uno de estos animales es el axolotl. Es ampliamente utilizado en estudios de biología regenerativa y es de interés en la regeneración de la médula espinal, ya que es un vertebrado^9,10,11,12.

La mayoría de los estudios de SCI en el axolotl se realizan como amputación de toda la cola o ablación de una mayor parte de la médula espinal^9,10,11,12. Recientemente, se publicó un nuevo estudio sobre lesiones contundentes¹³ que imita mejor las situaciones clínicas. Mientras que la amputación completa del apéndice en el axolotl da lugar a una regeneración completa, algunos fenómenos regenerativos no basados en la amputación dependen del defecto de tamaño crítico (CSD)^14,15. Esto significa que las lesiones que superan un umbral crítico no se regeneran. Para desarrollar un modelo regenerativo con un mayor valor traslacional clínico, este estudio investigó si un traumatismo contundente de 2 mm superaría el límite de DSA.

Este método es relevante para los investigadores que trabajan en la regeneración de la médula espinal en modelos animales pequeños, especialmente en el axolotl. Además, puede ser de mayor interés general, ya que exhibe una forma de utilizar equipos de laboratorio estándar para desarrollar un mecanismo de trauma contundente que sea adecuado para su uso en animales pequeños en general.

Protocolo

Durante este estudio se siguieron todas las reglamentaciones institucionales y gubernamentales aplicables relativas al uso ético de los animales. El estudio fue realizado bajo el id de aprobación: 2015-15-0201-0061 por la Inspección Danesa de Experimentos Animales. Los animales eran axolotls mexicanos(Ambystoma mexicanum, masa corporal media : STD: 12.12 g a 1.25 g).

1. Preparación

1. Prepare axolotl para la anestesia.
   1. Utilice agua del grifo no tratada químicamente de alta calidad. Si no está disponible, utilice la solución de Holtfreter al 40%.
   2. Disolver 200 mg de etil 4-aminobenzoato (benzocaína) en 3 ml de acetona. Disolver esta solución en 1 L de agua del grifo o 40% de la solución de Holtfreter.
2. Utilice una placa Petri estándar (100 mm de diámetro) colocada bajo un microscopio estéreo como mesa quirúrgica. Coloque un paño textil quirúrgico en el plato Petri.
   NOTA: El uso de un plato de Petri como área quirúrgica permite el movimiento y la rotación del animal sin tocarlo, asegurando la estabilidad de la columna vertebral durante la cirugía.
3. Preparar todos los instrumentos microquirúrgicos estériles (es decir, tijeras y fórceps anatómicos).

2. Anestesia

1. Colocar el axolotl en un recipiente con solución de benzocaína durante aproximadamente 45 minutos para garantizar una anestesia profunda y estable.
   NOTA: La concentración dada de benzocaína causará anestesia en todos los tamaños de axolotls.
2. Compruebe si hay signos de anestesia general en un plazo de 30-45 min. Estos incluyen una falta completa de movimientos de las branquias, reflejo de enderece, o respuesta a estímulos táctiles o dolorosos (pellizco suave de la tela del dedo del dedo del dedo del dedo del tiempo).
3. Para mantener la anestesia, envuelva los animales en toallas de papel humedecidas en la solución anestésica. Humedezca regularmente con esta solución durante el procedimiento quirúrgico para asegurarse de que la piel y las branquias se mantengan húmedas.
4. Recuperar al animal después de la cirugía colocándolo en un recipiente que contiene agua fresca del grifo. Observar signos de recuperación, como movimiento de las branquias y reflejo de derecho recuperado, dentro de 1 h¹⁶.

3. Laminectomía microquirúrgica

NOTA: La laminectomía se realiza bajo un estereomicroscopio.

1. Coloque el animal en posición propensa en el plato Petri. Envuélvalo en toallas de papel para que la cola quede expuesta.
   NOTA: Las toallas de papel son excelentes para garantizar la estabilidad durante todo el procedimiento.
2. Identifique las extremidades posteriores. Haz la primera incisión que sea caudal para ellos.
   1. Con un par de microtijeras, realice una incisión vertical desde la quilla hasta que se sienta la prominencia ósea de los procesos espinosos.
      NOTA: Tenga mucho cuidado al agarrar la quilla y la piel con fórceps, ya que estos causan fácilmente daño a la delicada piel.
   2. Extienda el corte lateralmente, de modo que la incisión atraviese todo el ancho de la cola.
   3. Sujete el proceso espinoso con fórceps para asegurar la profundidad correcta.
   4. Extienda las incisiones verticales 1 mm por debajo del proceso espinoso en ambos lados.
3. Coloque el animal en un lado para realizar incisiones ventrales y horizontales como se indica a continuación.
   1. Con un par de microtijeras, a partir del punto ventral de la incisión vertical, haga una incisión horizontal de aproximadamente 15 mm para animales de 10-20 g de peso. Haga la incisión más larga para los animales más grandes, y más corta para los animales más pequeños.
   2. Usando las tijeras, diseccione medialmente a través de la incisión horizontal hasta que la columna vertebral se sienta en la línea media.
   3. Repita los pasos 3.3, 3.3.1 y 3.3.2 en el otro lado del animal.
4. Habiendo diseccionado en el plano medio profundo de ambos lados, diseccionar a través de la línea media, conectando así las dos incisiones horizontales.
   1. Mueva la pieza libre de cola y quilla a un lado, exponiendo los procesos espínes(Figura 1).
   2. Fije la pieza de cola con toallas de papel húmedas.
5. Coloque el animal en la posición propensa de nuevo con la cabeza mirando hacia el lado no dominante del cirujano.
   1. Con un par de fórceps, agarra los procesos espinosos a solo caudal a las extremidades posteriores. Aplicar una elevación suave tanto hacia arriba como hacia la cabeza del animal.
   2. Coloque las cuchillas de un par de microtijeras horizontales alrededor del proceso y córtelo suavemente. La elevación en el proceso asegura que ahora se retira, exponiendo la médula espinal.
   3. Sujete el proceso espinoso simplemente caudal al que acaba de eliminar y repita los pasos 3.5.1 y 3.5.2.
      NOTA: Esto debe dejar una médula espinal expuesta correspondiente a dos niveles vertebrales. Al realizar la laminectomía, a menudo aparece una secreción blanca espumosa. La médula espinal se identifica fácilmente por su brillo distintivo, junto con un recipiente que corre a lo largo de la línea media.
   4. Dependiendo del tamaño del animal, el área expuesta puede no ser lo suficientemente ancha. Usando dos pares de fórceps, agarra las láminas a ambos lados de la médula espinal y gíralas lateralmente con un movimiento suave.

4. Introducción de una lesión de tipo de contusión (Figura 2)

1. Mantenga al animal en posición propensa.
2. Utilice el plato Petri para transferir al animal a la unidad de trauma.
3. Pida a un asistente que encienda una linterna en la médula espinal.
4. Coloque el cilindro de la unidad de trauma de contusión por encima de la médula espinal expuesta utilizando los microajustadores de la unidad. Apunta a través del cilindro.
5. Baje el cilindro hasta que esté nivelado con las láminas.
6. Fije la varilla que cae al electroimán. Coloque el cilindro de ajuste de altura de caída deseado en la unidad de trauma.
7. Coloque la varilla que cae en el cilindro.
   NOTA: Para un estudio ciego, el cirujano ahora debe salir de la habitación sin saber si el animal será asignado a una lesión o a un grupo de cirugía falsa.
8. Apague el electroimán. La varilla cae a la médula espinal expuesta.
9. Utilice el tornillo de ajuste de altura para levantar la varilla de la médula espinal.
10. Confirme la lesión mirando la médula espinal a través del microscopio. El sitio lesionado aparecerá más oscuro, y el sangrado del vaso de la línea media será evidente.

5. Introducción de una lesión aguda

NOTA: Realice estos pasos después de 3.5.4.

1. Con un par de microtijeras cortar la médula espinal en un corte vertical perfecto.
2. Repita el corte de 2 mm al lado caudal del cuerpo.
   NOTA: La longitud de la pieza de la médula espinal extraída se puede ajustar según el requisito de estudio. Sin embargo, un corte de 2 mm será regenerado¹⁰.
3. Asegúrese de que los cortes estén completos. Al finalizar, siente las cuchillas de las tijeras raspando a lo largo de la parte ventral del canal espinal.
4. Levante la pieza de 2 mm de la médula espinal del canal espinal.

6. Cierre de la herida quirúrgica

1. Devuelva al animal a la mesa quirúrgica. En un estudio ciego, cambie la posición de la quilla para que la médula espinal no sea visible para el cirujano.
2. Mantenga al animal en posición propensa.
   1. Comience a colocar 10.0 suturas de nylon de la parte más caudal de la incisión horizontal. Cierre las heridas en una capa.
      NOTA: No agarre la piel demasiado apretada, porque infligirá necrosis.
   2. Trabajar hacia la parte vertical de la incisión.
   3. Al llegar al ángulo, gire la placa Petri y sutura la otra incisión horizontal.
   4. Ajuste las suturas en las incisiones verticales.
   5. No coloque suturas en la parte superior de la quilla, porque la piel aquí no será capaz de sostener.

7. Devolver el animal a la solución libre de anestesia

1. Levante el plato Petri con el animal y sumerja ambos muy suavemente en agua dulce de sólo 5 cm de profundidad y deje que el animal se deslice.
   NOTA: La profundidad de aguas poco profundas asegura que el animal no intentará nadar a la superficie para respirar.
2. No cambie el agua durante la primera semana.
3. Cuando alimente a los animales, asegúrese de que el alimento se coloca cerca de la cabeza del animal.
   NOTA: El propósito de estas medidas es evitar tanto movimiento como sea posible durante la primera semana.

8. Ultrasonido postoperatorio

1. Antes de la terminación de la anestesia, utilice un sistema de ultrasonido de alta frecuencia para adquirir imágenes de la lesión que se pueden utilizar para la construcción de imágenes tridimensionales del sitio sCI.
2. Conecte el transductor a un micromanipulador preferiblemente gobernado por un joystick remoto.
3. Sumerja el animal anestesiado en la posición propensa en un recipiente pequeño lleno de solución anestésica.
   NOTA: Fije al animal con sacos de arena en miniatura u otro equipo para evitar el movimiento durante la secuencia de escaneo.
4. Alinee la punta del transductor con el eje de longitud del animal y sumerja en la solución de benzocaína hasta que esté sólo unos pocos milímetros por encima de la quilla detrás de las extremidades posteriores del animal.
5. Identifique el sitio de SCI.
   NOTA: El sitio de lesiones es fácilmente reconocible debido a los procesos espinosos que faltan directamente por encima del SCI.
6. Optimice la imagen ajustando los ajustes de ultrasonido. Asegúrese de que el sitio SCI esté en el centro de la imagen. Ajuste el campo de visión (es decir, profundidad de la imagen, desplazamiento de profundidad y anchura de la imagen) para cubrir el sitio de SCI y el tejido sano adyacente. Ajuste la ganancia bidimensional para optimizar el contraste de la imagen.
7. Al barrer el transductor de ultrasonido a través del sitio de SCI con un micromanipulador operado electrónicamente, adquiera imágenes en modo B que cubran el sitio de SCI en múltiples ubicaciones de cortes transversales sagitales, con rodajas consecutivas con un intervalo intercortado de 50 m. Adquirir imágenes cine-insituadas que contengan 500 fotogramas con una velocidad de fotogramas de 50 fotogramas/s y una frecuencia de transductor de 40 MHz.
   NOTA: Esta configuración requiere un micromanipulador electrónico gobernado por un joystick remoto (paso 8.2).
8. Después de terminar la secuencia de escaneo, vuelva al paso 7.

Resultados

El propósito del protocolo es producir un SCI que paralizará las funciones motoras y sensoriales caudales a la lesión. Debido a que el axolotl es competente para la regeneración, restaura la función en cuestión de semanas, lo que permite a los investigadores estudiar la regeneración del SNC durante un corto período de tiempo.

Se proporcionó anestesia durante 45 minutos a todos los animales, y no se experimentaron episodios de recuperación prematura. Todos los animales se recuperaron ...

Discusión

Debido a que el riesgo de lesión en la médula espinal es significativo, los pasos críticos del protocolo son la eliminación de los procesos espinosos y el ensanchamiento del acceso óseo al canal espinal si es necesario. Como se mencionó en el protocolo, se recomienda eliminar primero el proceso más craneal. Esto significará que cuantos más procesos caudales protejan la médula espinal de ser golpeada por las tijeras. Se recomienda asegurar suficiente acceso quirúrgico, lo que significa no hacer una incisión pr...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
25 g custom falling rod	custom home made
30 mm PVC pipe	custom home made
Acetone	Sigma-Aldrich	67-64-1	Propanone
Axolotl (Ambystoma mexicanum)	Exoterra GmbH	N/A	12-22 cm and 10 g - 80 g, All strains (wildtype, melanoid, white, albino, transgenic white with GFP)
Benzocain	Sigma-Aldrich	94-09-7	ethyl 4-aminobenzoate
Electromaget	custom home made
Excel 2010	Microsoft	N/A	Excel 2010 or newer
ImageJ	National Institutes of Health		ImageJ 1.5e or newer. Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, https://imagej.nih.gov/ij/, 1997-2016.
Kimwipes
Microsurgical instruments	N/A	N/A	Forceps and scissors
MS550s	Fujifilm, Visualsonics	MS550s	40 MHz center frequency, transducer
MS700	Fujifilm, Visualsonics	MS700	50 MHz center frequency, transducer
Petri dish	any maker
Soft cloth	N/A	N/A	Any piece of soft cloth measuring approximately 70 x 55 cm2 e.g. a dish towel
Stereo microscope
Vevo 2100	Fujifilm, Visualsonics	Vevo 2100	High frequency ultrasound system