通过再生轴虫中通过显微外科拉米切口进行损伤的脊髓损伤

摘要

这份手稿提出了手术治疗方案，用于对再生轴虫（Ambystoma墨西哥）造成控制性钝和尖锐的脊髓损伤。

摘要

本研究的目的是在axolotl（墨西哥阿姆比托马）中建立一个标准化和可重复的再生钝脊髓损伤模型。大多数临床脊髓损伤都发生高能量钝性创伤，导致挫伤。然而，大多数研究在轴线脊髓已经进行了尖锐的创伤。因此，本研究旨在产生一种更具有临床相关性的再生模型。由于其令人印象深刻的再生能力，几乎任何组织，轴球被广泛用作模型在再生研究，并已广泛用于脊髓损伤（SCI）研究。在此协议中，异体通过浸入苯甲酸溶液进行麻醉。在显微镜下，一个角切口是双边的，正好对后肢有一个切口。从这个切口，有可能解剖和暴露的旋转过程。使用钳子和剪刀，进行两级拉平切除术，暴露脊髓。构建了一个由圆柱体中落杆组成的定制创伤装置，该装置用于诱导脊髓的挫伤。切口然后缝合，动物从麻醉中恢复。手术方法成功地暴露了脊髓。创伤机制可以产生脊髓的挫伤，由动物学、MRI和神经学检查证实。最后，脊髓从损伤中再生。该协议的关键步骤是去除旋转过程，而不会对脊髓造成损伤。此步骤需要培训以确保安全的程序。此外，伤口封闭高度依赖于在切口期间不对皮肤造成不必要的损伤。该协议是在对12只动物的随机研究中进行的。

引言

本研究的总体目标是建立一种可控和可重复的显微外科方法，用于将钝和尖锐的SCI施加到axolotl（墨西哥的Ambystoma），从而产生一个再生脊髓损伤模型。

SCI是一个严重的条件，根据水平和程度，造成神经残疾的四肢以及受损的膀胱和肠道控制1，2，3。大多数SCI是高能量钝性创伤的结果，如交通事故和^{跌倒4，5。}剧烈的损伤非常罕见。因此，最常见的宏观损伤类型是挫伤。

哺乳动物中枢神经系统（CNS）是一种非再生组织，因此在SCI之后神经组织没有恢复，另一方面，一些动物有一个有趣的能力，以再生组织，包括中枢神经系统组织。这些动物之一是弓形虫。它被广泛用于再生生物学的研究，并有兴趣在脊髓再生，因为它是脊椎动物9，10，11，12。

在轴线中，大多数SCI研究要么截肢整个尾巴，要么使脊髓的较大部分^消融9，10，11，12。最近，一项新的研究发表在钝^损伤13，模仿临床情况更好。虽然完全附属截肢在轴异体导致完全再生，一些非截肢为基础的再生现象依赖于临界尺寸缺陷（CSD）^14，15。这意味着超过临界阈值的伤害不会再生。为了开发一种具有较高临床转化价值的再生模型，本研究调查了2毫米钝性创伤是否会超过CSD极限。

这种方法与研究小动物模型脊髓再生的研究人员相关，特别是在异种动物模型中。此外，它可能更普遍的利益，因为它展示了一种使用标准实验室设备来开发一种钝性创伤机制的方法，这种机制一般适用于小动物。

研究方案

本研究遵循了关于动物伦理使用的所有适用的体制和政府条例。这项研究在批准ID下进行:2015-15-0201-0061由丹麦动物实验监察局进行。动物是墨西哥的斧头 （墨西哥阿姆比斯托马，平均身体质量 = STD: 12.12 g = 1.25 g）。

1. 准备

1. 准备麻醉用的轴药。
   1. 使用高质量的非化学处理自来水。如果不可用，请使用 40% 霍尔特弗雷特的解决方案。
   2. 在3mL的丙酮中溶解200毫克乙基4-氨基苯甲酸酯（苯甲酸酯）。将溶液溶解在1升自来水或40%霍尔特弗雷特溶液中。
2. 使用放置在立体显微镜下的标准培养皿（直径100毫米）作为手术台。在培养皿上放置一个手术纺织布。
   注:使用培养皿作为手术区域，使动物在不接触的情况下移动和旋转，确保手术期间的脊柱稳定性。
3. 准备所有无菌显微手术器械（即剪刀和解剖钳）。

2. 麻醉

1. 将阿索洛特放入装有苯甲酸溶液的容器中约 45 分钟，以确保深度和稳定的麻醉。
   注:苯甲酸的给定浓度会导致麻醉，在所有大小的阿索洛特。
2. 检查30-45分钟内是否有一般麻醉的迹象。这些包括完全缺乏刺运动，正确的反射，或反应触觉或痛苦的刺激（温柔捏脚趾网）。
3. 为了保持麻醉，用纸巾包裹动物，用麻醉液湿润。在手术过程中定期用这种溶液润湿这些，以确保皮肤和刺保持湿润。
4. 手术后，将动物放入装有新鲜自来水的容器中，恢复动物。观察恢复的迹象，如刺运动和恢复正确的反射，在1^小时16。

3. 显微外科拉米切除术

注:层切除术是在立体显微镜下进行的。

1. 将动物放在培养皿的易发位置。用纸巾包起来，使尾巴露出来。
   注:纸巾是优秀的，以确保整个程序的稳定性。
2. 识别后肢。做第一个切口只是对他们。
   1. 用一把微剪刀，从龙骨上进行垂直切口，直到感觉到旋转过程的骨突出。
      注:用钳子抓住龙骨和皮肤时要非常小心，因为这些很容易对娇嫩的皮肤造成伤害。
   2. 横向延伸切口，使切口穿过整个尾部宽度。
   3. 用钳子抓住旋转过程，以确保正确的深度。
   4. 将垂直切口在两侧的旋转工艺下方延伸 1 mm。
3. 将动物放在一侧，执行心室和水平切口，如下所述。
   1. 用一对微剪刀，从垂直切口的腹点开始，为动物做一个约15毫米的水平切口，重量为10-20克。使大动物的切口变长，对较小的动物缩短。
   2. 使用剪刀，通过水平切口进行内切解剖，直到在中线感觉到椎柱。
   3. 在动物的另一侧重复步骤 3.3、3.3.1 和 3.3.2。
4. 从两侧在深中平面上解剖，通过中线解剖，从而连接两个水平切口。
   1. 将自由一块尾巴和龙骨移到一侧，露出旋转过程（图1）。
   2. 用湿纸巾固定尾片。
5. 再次将动物置于易发位置，头部朝向外科医生的非主导侧。
   1. 用一对钳子，抓住旋转过程，只是对后肢的扭曲。轻轻抬起，然后朝动物头部提起。
   2. 将一对微剪刀的刀片水平放在加工过程中，轻轻切割。过程中的提升确保现在将其移除，露出脊髓。
   3. 抓住旋转的过程，只是对刚删除的过程进行重复，并重复步骤 3.5.1 和 3.5.2。
      注:这应该留下一个暴露的脊髓对应于两个椎骨水平。进行层切除术时，经常出现白色泡沫分泌。脊髓很容易识别其独特的光泽，以及沿着中线运行的血管。
   4. 根据动物的大小，暴露区域可能不够宽。使用两对钳子，抓住脊髓两侧的层压，然后用温和的动作横向扭曲。

4. 引入结化型损伤 （图 2）

1. 保持动物处于易发位置。
2. 使用培养皿将动物转移到创伤室。
3. 让助手在脊髓上用手电筒照射。
4. 使用装置上的微调节器将挫伤创伤单元圆柱体置于外露脊髓上方。瞄准气缸。
5. 降低气缸，直到与层压水平。
6. 将下降杆连接到电磁铁上。将所需的下降高度调节油缸放在创伤单元上。
7. 将下降杆放入气缸中。
   注:对于一个失明的研究，外科医生现在应该离开房间，不知道动物是否会被分配到一个受伤或假手术组。
8. 关闭电磁铁。杆落在暴露的脊髓上。
9. 使用高度调节螺钉将杆从脊髓提起。
10. 通过显微镜观察脊髓确认损伤。受伤部位将显得较暗，中线血管出血明显。

5. 介绍锐伤

注:在 3.5.4 之后执行这些步骤。

1. 用一把微剪刀将脊髓切割成完美的垂直切口。
2. 将切口 2 mm 重复到车身的牛侧。
   注:可根据研究要求调整切除的脊髓的长度。然而，2毫米的切割将是可再^创10。
3. 确保切割已完成。完成后，感觉剪刀的刀片沿脊髓管的腹腔刮擦。
4. 从脊髓管提起 2 毫米的脊髓。

6. 关闭手术伤口

1. 把动物送回手术台。在失明的研究中，重新定位龙骨，使外科医生看不到脊髓。
2. 保持动物处于易发位置。
   1. 开始放置10.0尼龙缝合线从水平切口的最缝合部分。把伤口合上一层。
      注:不要抓住皮肤太紧，因为它会造成坏死。
   2. 朝切口的垂直部分努力。
   3. 达到角度时，转动培养皿并缝合另一个水平切口。
   4. 在垂直切口上设置缝合线。
   5. 不要将缝合线放在龙骨的上部，因为这里的皮肤无法保持。

7. 将动物送回无麻醉溶液

1. 提起与动物的培养皿，将两者轻轻地浸入只有5厘米深的淡水中，让动物滑出。
   注:浅水深度确保动物不会试图游到水面呼吸。
2. 第一周不要换水。
3. 喂食动物时，确保食物放在动物头部附近。
   注:这些措施的目的是避免在第一周尽可能多地移动。

8. 术后超声

1. 在麻醉终止之前，使用高频超声系统获取损伤图像，可用于构建 SCI 站点的三维图像。
2. 将传感器连接到微操作器，最好由远程操纵杆控制。
3. 将麻醉动物浸入易发位置，放入装满麻醉溶液的小容器中。
   注:用微型沙袋或其他设备固定动物，以避免在扫描过程中移动。
4. 将传感器的尖端与动物的长度轴对齐，并将其浸入苯甲酸溶液中，直到它仅比动物后肢后面的龙骨高出几毫米。
5. 识别 SCI 站点。
   注:由于 SCI 正上方缺少旋转过程，损伤部位很容易识别。
6. 通过调整超声波设置优化图像。确保 SCI 站点位于图像的中心。调整视场（即图像深度、深度偏移和图像宽度），以覆盖 SCI 站点和相邻的健康组织。调整二维增益以优化图像对比度。
7. 通过使用电子操作的微操作器扫描整个 SCI 站点的超声波传感器，获取覆盖 SCI 站点的 B 模式图像，该位置位于多个射手横截面切片位置，具有连续切片间隔50 μm.获取包含 500 帧的 cine 图像，帧速率为 +50 帧/秒，传感器频率为 40 MHz。
   注:此设置需要由远程操纵杆（步骤 8.2）管理的电子微操作器。
8. 完成扫描序列后返回步骤 7。

结果

该协议的目的是产生一个SCI，将瘫痪的电机和感觉功能对损伤。由于axolotl具有再生能力，它可以在几周内恢复功能，使研究人员能够在短时间内研究CNS再生。

麻醉为所有动物提供45分钟，没有经历早产的发作。所有动物在一小时内恢复，在接下来的星期^十三、十六日，没有因麻醉而受损的迹象。

层切除术在所?...

讨论

由于脊髓损伤的风险很大，协议的关键步骤是去除脊柱过程，并根据需要扩大对脊髓管的骨质访问。如协议所述，强烈建议首先删除最颅骨过程。这将意味着更多的牛加工保护脊髓免受剪刀的击中。建议确保足够的手术治疗，这意味着不要使过小的主要切口。此外，当用钳子抓住任何东西时，必须始终考虑所施加的拉力方向。在抓地力失效和仪器滑移时，从脊髓上轻轻拉出，将保护脊髓。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
25 g custom falling rod	custom home made
30 mm PVC pipe	custom home made
Acetone	Sigma-Aldrich	67-64-1	Propanone
Axolotl (Ambystoma mexicanum)	Exoterra GmbH	N/A	12-22 cm and 10 g - 80 g, All strains (wildtype, melanoid, white, albino, transgenic white with GFP)
Benzocain	Sigma-Aldrich	94-09-7	ethyl 4-aminobenzoate
Electromaget	custom home made
Excel 2010	Microsoft	N/A	Excel 2010 or newer
ImageJ	National Institutes of Health		ImageJ 1.5e or newer. Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, https://imagej.nih.gov/ij/, 1997-2016.
Kimwipes
Microsurgical instruments	N/A	N/A	Forceps and scissors
MS550s	Fujifilm, Visualsonics	MS550s	40 MHz center frequency, transducer
MS700	Fujifilm, Visualsonics	MS700	50 MHz center frequency, transducer
Petri dish	any maker
Soft cloth	N/A	N/A	Any piece of soft cloth measuring approximately 70 x 55 cm2 e.g. a dish towel
Stereo microscope
Vevo 2100	Fujifilm, Visualsonics	Vevo 2100	High frequency ultrasound system