Ferimento da medula espinal da contusão através de um Laminectomy Microsurgical no Axolotl regenerative

Resumo

Este manuscrito apresenta protocolos para infestar cirùrgica ferimentos de medula espinal controlados e afiados a um Axolotl regenerativo (mexicanum de Ambystoma).

Resumo

O objetivo deste estudo é estabelecer um modelo de lesão medular sem corte regenerativa padronizada e reprodutível no Axolotl (Ambystoma mexicanum). A maioria das lesões clínicas da medula espinhal ocorrem como traumas contundentes de alta energia, induzindo lesões de contusão. Entretanto, a maioria de estudos na medula espinal do Axolotl foram conduzidos com traumas afiados. Assim, este estudo tem como objetivo produzir um modelo regenerativo mais clinicamente relevante. Devido à sua impressionante capacidade de regenerar quase todos os tecidos, axolotls são amplamente utilizados como modelos em estudos regenerativos e têm sido amplamente utilizados em estudos de lesão medular (SCI). Neste protocolo, os axolotls são anestesiados por submersão em solução de benzocaína. o microscópio, uma incisão angular é feita bilateralmente em um nível apenas caudal para os membros posteriores. A partir desta incisão, é possível dissecar e expor os processos espinhoso. Usando fórceps e tesouras, um laminectomy de dois níveis é executado, expondo a medula espinal. Um dispositivo feito encomenda do traumatismo que consiste em uma haste de queda em um cilindro é construído, e este dispositivo é usado para induzir um ferimento da contusão à medula espinal. As incisões são então suturadas, e o animal se recupera da anestesia. A aproximação cirúrgica é bem sucedida em expor a medula espinal. O mecanismo do traumatismo pode produzir os ferimentos da contusão à medula espinal, como confirmado pela histologia, pelo MRI, e pelo exame neurológico. Finalmente, a medula espinhal se regenera da lesão. A etapa crítica do protocolo é remover os processos espinhoso sem causar dano à medula espinal. Esta etapa requer treinamento para garantir um procedimento seguro. Além disso, o fechamento da ferida é altamente dependente de não infestar danos desnecessários à pele durante a incisão. O protocolo foi realizado em estudo randomizado de 12 animais.

Introdução

O objetivo geral deste estudo foi estabelecer um método microcirúrgico controlado e reprodutível para infestar o Sci Blunt e afiado ao Axolotl (mexicanum de Ambystoma), produzindo um modelo regenerativa da lesão da medula espinal.

A LM é uma condição grave que, dependendo do nível e da extensão, inflige incapacidade neurológica às extremidades, juntamente com comprometimento da bexiga e do controle intestinal^1,2,3. A maioria de Sci são o resultado do traumatismo sem corte da alta energia tal como acidentes de tráfego e quedas^4,5. Os ferimentos afiados são muito raros. Portanto, o tipo de lesão macroscópica mais comum é contusões.

O sistema nervoso central de mamíferos (SNC) é um tecido não regenerativo,^{portanto, não}é observada restauração do tecido neurológico após a LM^6,7,8. Por outro lado, alguns animais têm uma capacidade intrigante de regenerar os tecidos, incluindo o tecido do SNC. Um desses animais é o Axolotl. É amplamente utilizado em estudos de biologia regenerativa e é de interesse na regeneração da medula^{espinhal, pois}é um vertebrado^9,10,11^,12.

A maioria dos estudos de Sci no Axolotl são realizadas como amputação de toda a cauda ou ablação de uma parte maior da medula espinhal^9,10,11,12. Recentemente, um novo estudo foi publicado em lesões contundentes¹³ que imita situações clínicas melhor. Considerando que a amputação completa do apêndice no Axolotl resulta em regeneração total, alguns fenômenos regenerativos não baseados na amputação dependem do defeito^{crítico de tamanho}(CSD)^14,15. Isto significa que as lesões que excedem um limiar crítico não são regeneradas. Para desenvolver um modelo regenerativo com maior valor translacional clínico, este estudo investigou se um trauma contundente de 2 mm excederia o limite da CSD.

Este método é relevante para pesquisadores que trabalham na regeneração da medula espinhal em pequenos modelos animais, especialmente no Axolotl. Além disso, pode ser de interesse mais geral, porque apresenta uma maneira de usar o equipamento de laboratório padrão para desenvolver um mecanismo sem corte do traumatismo que seja apropriado para o uso em animais pequenos geralmente.

Protocolo

Todos os regulamentos institucionais e governamentais aplicáveis ao uso ético dos animais foram seguidos durante este estudo. O estudo foi conduzido o ID de aprovação: 2015-15-0201-0061 pela Inspetoria da experimentação animal dinamarquesa. Os animais foram axolotls mexicanos (Ambystoma mexicanum, massa corporal média ± dst: 12,12 g ± 1,25 g).

1. preparação

1. Prepare o Axolotl para a anestesia.
   1. Use água de torneira não-quimicamente tratada de alta qualidade. Se não estiver disponível, use 40% da solução de Holtfreter.
   2. Dissolver 200 mg de etil 4-aminobenzoato (Benzocaína) em 3 mL de acetona. Dissolva esta solução em 1 L de água da torneira ou 40% de solução de Holtfreter.
2. Use um prato de Petri padrão (100 milímetros no diâmetro) coloc um microscópio estereofónico como uma tabela cirúrgica. Coloc um pano de matéria têxtil cirúrgico no prato de Petri.
   Nota: Usar uma placa de Petri como uma área cirúrgica permite o movimento e a rotação do animal sem tocá-la, assegurando a estabilidade espinal durante a cirurgia.
3. Prepare todos os instrumentos microcirúrgicos estéreis (isto é, tesouras e fórceps anatômicos).

2. anestesia

1. Coloc o Axolotl em um recipiente com solução do benzocaína por aproximadamente 45 minutos para assegurar a anestesia profunda e estável.
   Nota: A concentração dada de benzocaína causará anestesia em todos os tamanhos de axolotls.
2. Verifique se há sinais de anestesia geral dentro de 30-45 min. Estes incluem uma completa falta de movimentos branquiais, reflexo de endireitando, ou resposta a estímulos táteis ou dolorosos (beliscar suave da teia do dedo do pé).
3. Para manter a anestesia, envolva os animais em papel toalha umedtado na solução anestésica. Molhe estes regularmente com esta solução durante o procedimento cirúrgico para assegurar-se de que a pele e as brânquias sejam mantidas húmidas.
4. Recupere o animal após a cirurgia, colocando-o em um recipiente contendo água da torneira fresca. Observe os sinais de recuperação, como o movimento das guelras e o reflexo de endireitando, dentro de 1 h¹⁶.

3. laminectomia microcirúrgica

Nota: O laminectomy é executado um stereomicroscope.

1. Coloque o animal na posição prona na placa de Petri. Enrole-o em toalhas de papel de modo que a cauda é exposta.
   Nota: As toalhas de papel são excelentes para assegurar a estabilidade durante todo o procedimento.
2. Identifique os membros posteriores. Faça a primeira incisão apenas caudal para eles.
   1. Com um par de Microtesoura, realize uma incisão vertical da quilha até que a proeminência óssea dos processos espessas sejam sentidos.
      Nota: Tenha muito cuidado ao agarrar a quilha e pele com fórceps, porque estes facilmente infligir danos à pele delicada.
   2. Estender o corte lateralmente, de modo que a incisão atravessa toda a largura da cauda.
   3. Agarre o processo espinhoso com fórceps para assegurar a profundidade direita.
   4. Estenda as incisões verticais 1 mm abaixo do processo espícuo em ambos os lados.
3. Coloc o animal em um lado para executar incisões ventral e horizontais como indicado abaixo.
   1. Com um par de Microtesoura, a partir do ponto ventral da incisão vertical, fazer uma incisão horizontal de aproximadamente 15 mm para os animais 10-20 g em peso. Faça a incisão mais longa para animais maiores, e menor para animais menores.
   2. Usando a tesoura, dissecar medialmente através da incisão horizontal até que a coluna vertebral é sentida na linha média.
   3. Repita os passos 3,3, 3.3.1 e 3.3.2 do outro lado do animal.
4. Tendo dissecado no plano medial profundo de ambos os lados, dissecar através da linha média, conectando assim as duas incisões horizontais.
   1. Mova o pedaço de cauda e a quilha livres para um lado, expondo os processos espívoros (Figura 1).
   2. Fixate a parte da cauda usando toalhas de papel molhadas.
5. Coloque o animal na posição propensa novamente com a cabeça virada para o lado não dominante do cirurgião.
   1. Com um par de fórceps, segure os processos espinhoso apenas caudal aos membros traseiros. Aplique um elevador suave tanto para cima como para a cabeça do animal.
   2. Coloque as lâminas de um par de Microtesoura horizontal ao redor do processo e gentilmente cortá-la. O elevador no processo assegura-se de que esteja removido agora, expondo a medula espinal.
   3. Agarre o processo espinhoso apenas caudal a esse que foi removido apenas e repita etapas 3.5.1 e 3.5.2.
      Nota: Isso deve deixar uma medula espinhal exposta correspondente a dois níveis vertebrais. Ao executar o laminectomy, uma secreção espumosa branca aparece frequentemente. A medula espinhal é facilmente identificada pelo seu brilho distintivo, juntamente com uma embarcação que corre ao longo da linha média.
   4. Dependendo do tamanho do animal, a área exposta pode não ser suficientemente larga. Usando dois pares de fórceps, segure as lâminas em ambos os lados da medula espinal e torça estes lateralmente com um movimento delicado.

4. introdução de um ferimento tipo contusão (Figura 2)

1. Mantenha o animal na posição prona.
2. Use o prato de Petri para transferir o animal para a unidade de trauma.
3. Ter um assistente brilhar uma lanterna na medula espinhal.
4. Coloc o cilindro da unidade do traumatismo da contusão acima da medula espinal expor usando os microajustadores na unidade. Mire no cilindro.
5. Abaixe o cilindro até que esteja nivelado com os laminae.
6. Prenda a haste de queda ao electroímã. Coloque o cilindro de ajuste de altura de queda desejado na unidade de trauma.
7. Coloque a haste de queda no cilindro.
   Nota: Para um estudo cego, o cirurgião deve agora sair da sala sem saber se o animal será atribuído a uma lesão ou um grupo de cirurgia Sham.
8. Desligue o eletroímã. A vara cai para a medula espinhal exposta.
9. Use o parafuso de ajuste de altura para levantar a haste da medula espinhal.
10. Confirme a lesão observando a medula espinhal através do microscópio. O local ferido aparecerá mais escuro, e o sangramento da embarcação da linha média será aparente.

5. apresentando um ferimento afiado

Nota: Execute estas etapas após 3.5.4.

1. Com um par de Microtesoura cortar a medula espinhal em um corte vertical perfeito.
2. Repita o corte 2 mm para o lado caudal do corpo.
   Nota: O comprimento da parte removida da medula espinal pode ser ajustado como por a exigência do estudo. No entanto, um corte de 2 mm será regenerável¹⁰.
3. Assegure-se de que os cortes estejam completos. Após a conclusão, sentir as lâminas da tesoura raspando ao longo da parte ventral do canal espinhal.
4. Levante o pedaço de medula espinhal de 2 mm do canal espinhal.

6. fechando a ferida cirúrgica

1. Devolva o animal para a mesa cirúrgica. Em um estudo cego, reposicione a quilha para que a medula espinhal não seja visível para o cirurgião.
2. Mantenha o animal na posição prona.
   1. Começar a colocar 10,0 suturas de náilon da parte mais caudal da incisão horizontal. Feche as feridas em uma camada.
      Nota: Não segure a pele muito apertado, porque ele vai infligir necrose.
   2. Trabalhe para a parte vertical da incisão.
   3. Ao atingir o ângulo, gire a placa de Petri e sutura a outra incisão horizontal.
   4. Definir suturas nas incisões verticais.
   5. Não coloque suturas na parte superior da quilha, porque a pele aqui não será capaz de segurar.

7. devolver o animal à solução livre de anestésico

1. Levante o prato de Petri com o animal e mergulhe muito suavemente em água fresca apenas 5 cm de profundidade e deixe o animal deslizar.
   Nota: A profundidade da água rasa assegura-se de que o animal não tentará nadar à superfície para respirar.
2. Não mude a água durante a primeira semana.
3. Ao alimentar os animais, certifique-se de que o alimento é colocado perto da cabeça do animal.
   Nota: O objetivo destas medidas é evitar o máximo de movimento possível durante a primeira semana.

8. ultrassonografia pós-operatória

1. Antes da terminação da anestesia, use um sistema de ultra-som de alta freqüência para adquirir imagens da lesão que pode ser usado para a construção de imagens tridimensionais do site SCI.
2. Fixe o transdutor a um micromanipulador, de preferência regido por um joystick remoto.
3. Submergir o animal anestesiado na posição prona em um pequeno recipiente preenchido com solução anestésica.
   Nota: Fixe o animal com sacos de areia em miniatura ou outro equipamento para evitar movimentos durante a sequência de digitalização.
4. Alinhe a ponta do transdutor com o eixo de comprimento do animal e mergulhe-o na solução de benzocaína até que seja apenas alguns milímetros acima da quilha atrás dos membros posteriores do animal.
5. Identifique o site SCI.
   Nota: O local do ferimento é facilmente reconhecível devido aos processos espinhoso faltantes diretamente acima do Sci.
6. Otimize a imagem ajustando as configurações de ultrassom. Assegure-se de que o site SCI esteja no centro da imagem. Ajuste o campo de visão (ou seja, a profundidade da imagem, o deslocamento de profundidade e a largura da imagem) para cobrir o local de SCI e o tecido saudável adjacente. Ajuste o ganho bidimensional para otimizar o contraste da imagem.
7. Varrendo o transdutor do ultra-som através do local do Sci com um micromanipulador eletronicamente operado, adquira imagens do B-modo que cobrem o local do Sci em posições transversais sagital múltiplas da fatia, com fatias consecutivas com um intervalo do a de 50 μm. adquira Cine-imagens contendo 500 frames com uma taxa de quadros de ~ 50 frames/s e uma freqüência do transdutor de 40 megahertz.
   Nota: Esta configuração requer um micromanipulador eletrônico regido por um joystick remoto (etapa 8,2).
8. Depois de terminar a sequência de digitalização, retorne para a etapa 7.

Resultados

O objetivo do protocolo é produzir uma SCI que irá paralisar as funções motoras e sensoriais caudais à lesão. Porque o Axolotl é regeneração-competente restaura a função dentro das semanas, permitindo que os investigadores estudem a regeneração do CNS durante um intervalo de tempo curto.

A anestesia foi fornecida para 45 min a todos os animais, e nenhum episódio de recuperação pré-termo foi experimentado. Todos os animais recuperados dentro de uma hora e não mostraram sinais ...

Discussão

Porque o risco de ferimento à medula espinal é significativo, as etapas críticas do protocolo estão removendo os processos espinhoso e o alargamento do acesso ósseo ao canal espinal se necessário. Como mencionado no protocolo, a remoção do processo mais craniano primeiro é altamente recomendável. Isto significará que os processos mais caudais protegem a medula espinal de ser batido pela tesoura. Recomenda-se assegurar o suficiente acesso cirúrgico, significando não fazer demasiado pequeno uma incisão prelim...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
25 g custom falling rod	custom home made
30 mm PVC pipe	custom home made
Acetone	Sigma-Aldrich	67-64-1	Propanone
Axolotl (Ambystoma mexicanum)	Exoterra GmbH	N/A	12-22 cm and 10 g - 80 g, All strains (wildtype, melanoid, white, albino, transgenic white with GFP)
Benzocain	Sigma-Aldrich	94-09-7	ethyl 4-aminobenzoate
Electromaget	custom home made
Excel 2010	Microsoft	N/A	Excel 2010 or newer
ImageJ	National Institutes of Health		ImageJ 1.5e or newer. Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, https://imagej.nih.gov/ij/, 1997-2016.
Kimwipes
Microsurgical instruments	N/A	N/A	Forceps and scissors
MS550s	Fujifilm, Visualsonics	MS550s	40 MHz center frequency, transducer
MS700	Fujifilm, Visualsonics	MS700	50 MHz center frequency, transducer
Petri dish	any maker
Soft cloth	N/A	N/A	Any piece of soft cloth measuring approximately 70 x 55 cm2 e.g. a dish towel
Stereo microscope
Vevo 2100	Fujifilm, Visualsonics	Vevo 2100	High frequency ultrasound system