Ушиб спинного мозга травма с помощью микрохирургической ламинэктомии в регенеративной аксолотл

Резюме

Данная рукопись представляет протоколы для хирургически inflicting контролируемые туповые и острые повреждения спинного мозга к регенеративному аксолоту(Ambystoma mexicanum).

Аннотация

Цель этого исследования заключается в создании стандартизированных и воспроизводимых регенеративных тупой спинного мозга травмы модели в аксолотле (Ambystoma mexicanum). Большинство клинических травм спинного мозга происходят как высокая энергия тупые травмы, вызывая ушиб травмы. Тем не менее, большинство исследований в аксолотле спинного мозга были проведены с острыми травмами. Таким образом, это исследование направлено на создание более клинически регенеративной модели. Из-за их впечатляющей способности регенерировать почти любую ткань, аксолотлы широко используются в качестве моделей в регенеративных исследованиях и широко использовались в исследованиях травм спинного мозга (SCI). В этом протоколе аксолотлы обезболиваются путем погружения в раствор бензокаина. Под микроскопом, угловой разрез делается на двусторонней основе на уровне только caudal к задним конечностям. Из этого разреза можно вскрыть и разоблачить спиннородные процессы. Используя щипцы и ножницы, проводится двухуровневая ламинэктомия, обнажая спинной мозг. Изготовлено специальное травматическое устройство, состоящее из падающего стержня в цилиндре, и это устройство используется для индуцирования ушиба спинного мозга. Затем разрезы зашиваются, и животное восстанавливается после наркоза. Хирургический подход успешно в разоблачении спинного мозга. Травматический механизм может привести к ушибу спинного мозга, что подтверждается гистологией, МРТ и неврологическим обследованием. Наконец, спинной мозг регенерирует от травмы. Критическим шагом протокола является удаление спинномозговых процессов без нанесения повреждений спинного мозга. Этот шаг требует обучения для обеспечения безопасной процедуры. Кроме того, закрытие раны в высокой степени зависит от не нанесения ненужного повреждения коже во время разреза. Протокол был выполнен в рандомизированном исследовании 12 животных.

Введение

Общая цель этого исследования заключается в создании контролируемого и воспроизводимого микрохирургического метода для нанесения тупой и резкий SCI аксолотл (Ambystoma mexicanum), производя регенеративной модели травмы спинного мозга.

SCI является тяжелым состоянием, которое, в зависимости от уровня и степени, наносит неврологическую инвалидность конечностей наряду с нарушениями мочевого пузыря и кишечника управления^1,2,3. Большинство SCI являются результатом высокой энергии тупой травмы, такие как дорожно-транспортных происшествий и падает^4,5. Острые травмы очень редки. Таким образом, наиболее распространенным макроскопическим типом травмявляется контуция.

Центральная нервная система млекопитающих (ЦНС) является нерегенеративной ткани, следовательно, не восстановление неврологических тканей после SCI видел^6,7,8. С другой стороны, некоторые животные обладают интригующей способностью к регенерации тканей, в том числе тканей ЦНС. Одним из таких животных является аксолотль. Он широко используется в исследованиях регенеративной биологии и представляет интерес в регенерации спинного мозга, потому что это позвоночный^9,10,11,12.

Большинство исследований SCI в аксолотле выполняются как либо ампутация всего хвоста или абляции большей части спинного мозга^9,10,11,12. Недавно было опубликовано новое исследование о тупых травмах^13, которое лучше имитирует клинические ситуации. В то время как полная ампутация придатка в аксолле приводит к полной регенерации, некоторые регенеративные явления, не связанные с ампутацией, зависят от дефекта критического размера (CSD)^14,15. Это означает, что травмы, превышающие критический порог, не регенерируются. Для разработки регенеративной модели с более высоким клиническим переводческим значением, это исследование исследовало ли 2 мм тупой травмы будет превышать предел CSD.

Этот метод актуален для исследователей, работающих над регенерацией спинного мозга в небольших моделях животных, особенно в аксолотле. Кроме того, он может представлять более общий интерес, поскольку он демонстрирует способ использования стандартного лабораторного оборудования для разработки механизма тупой травмы, который подходит для использования в мелких животных в целом.

протокол

В ходе этого исследования были приняты все применимые институциональные и правительственные нормы, касающиеся этического использования животных. Исследование проводилось в соответствии с идентификатором одобрения: 2015-15-0201-0061 Датской инспекцией по эксперименту на животных. Звери были мексиканскими аксолотлами(Ambystoma mexicanum,средняя масса тела и ЗППП: 12,12 г и 1,25 г).

1. Подготовка

1. Приготовьте аксолотл к анестезии.
   1. Используйте высококачественную нехимически обработанную водопроводную воду. Если он недоступен, используйте 40% решения Holtfreter.
   2. Растворите 200 мг этилового 4-аминобензоата (бензокаина) в 3 мл ацетона. Растворите этот раствор в 1 л водопроводной воды или 40% раствора Holtfreter.
2. Используйте стандартное блюдо Петри (100 мм в диаметре), помещенное под стереомикроскоп в качестве хирургического стола. Поместите хирургическую текстильную ткань на блюдо Петри.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Использование чашки Петри в качестве хирургической области позволяет двигаться и вращение животного, не касаясь его, обеспечивая устойчивость позвоночника во время операции.
3. Приготовьте все стерильные микрохирургические инструменты (т.е. ножницы и анатомические щипцы).

2. Анестезия

1. Поместите аксолотл в контейнер с раствором бензокаина примерно на 45 мин, чтобы обеспечить глубокую и стабильную анестезию.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Данная концентрация бензокаина вызовет анестезию во всех размерах аксолотлов.
2. Проверьте наличие признаков общей анестезии в течение 30-45 мин. К ним относятся полное отсутствие жаберных движений, исправления рефлекс, или ответ на либо тактильные или болезненные раздражители (мягкий щипать палец паутины).
3. Для поддержания анестезии оберните животных бумажными полотенцами, смачиваемыми в анестезируемом растворе. Влажные эти регулярно с этим раствором во время хирургической процедуры, чтобы убедиться, что кожа и жабры остаются влажными.
4. Восстановить животное после операции, поместив его в контейнер, содержащий пресную водопроводную воду. Наблюдайте признаки восстановления, такие как движение жаберных и восстановленный испуг рефлекс, в пределах 1 ч¹⁶.

3. Микрохирургическая ламинэктомия

ПРИМЕЧАНИЕ: Ламинэктомия проводится под стереомикроскопом.

1. Поместите животное в склонное положение на чашку Петри. Оберните его в бумажные полотенца так, чтобы хвост подвергается.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Бумажные полотенца отлично подходят для обеспечения стабильности на протяжении всей процедуры.
2. Определите задние конечности. Сделать первый разрез просто caudal к ним.
   1. С парой микроскиссоров, выполнять вертикальный разрез от киля, пока костлявые известность спинных процессов ощущаются.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте очень осторожны при захвате киля и кожи с щипками, потому что они легко нанести ущерб нежной кожи.
   2. Расширьте разрез боковой, чтобы разрез пересекал всю ширину хвоста.
   3. Возьмитесь за спинной процесс с щипками, чтобы обеспечить правильную глубину.
   4. Расширьте вертикальные разрезы на 1 мм ниже спинное процесса с обеих сторон.
3. Поместите животное на одну сторону для выполнения брюшных и горизонтальных разрезов, как указано ниже.
   1. С парой микросциссоров, начиная с брюшной точки вертикального разреза, делают горизонтальный разрез примерно 15 мм для животных весом 10-20 г. Сделайте разрез длиннее для более крупных животных и короче для мелких животных.
   2. Используя ножницы, вскрыть среднесрочный через горизонтальный разрез, пока позвоночный столб ощущается в средней линии.
   3. Повторите шаги 3.3, 3.3.1 и 3.3.2 на другой стороне животного.
4. Рассечение в глубокой медиальной плоскости с обеих сторон, вскрыть через среднюю линию, тем самым соединяя два горизонтальных разреза.
   1. Переместите свободный кусок хвоста и киля в одну сторону, подвергая спинное процессы(рисунок 1).
   2. Зафиксировать кусок хвоста с помощью мокрых бумажных полотенец.
5. Поместите животное в положение склонного снова с головой перед хирургом не доминирующей стороны.
   1. С парой щипцы, понять спиннородные процессы просто caudal к задним конечностям. Нанесите нежный лифт как вверх, так и к голове животного.
   2. Поместите лопасти пары микроскиссоров горизонтально вокруг процесса и аккуратно разрежьте его. Подъемник на процессе гарантирует, что он теперь удаляется, подвергая спинного мозга.
   3. Возьмитесь за спинной процесс просто caudal к тому, который был только что удален и повторить шаги 3.5.1 и 3.5.2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это должно оставить открытый спинной мозг, соответствующий двум уровням позвоночника. При выполнении ламинэктомии, белый пенистый секреции часто появляется. Спинной мозг легко идентифицируется по его отличительной блеск, наряду с сосудом, идущим вдоль средней линии.
   4. В зависимости от размера животного, облучение области не может быть достаточно широким. Используя две пары щипцы, схватить ламинас с обеих сторон спинного мозга и крутить их боковой с нежным движением.

4. Введение ушиба типа контузии(рисунок 2)

1. Держите животное в положении склонного.
2. Используйте чашку Петри, чтобы перевести животное в травматологическое отделение.
3. У помощника светит фонарик на спинном мозге.
4. Поместите контузионный блок травмы цилиндра над открытым спинным мозгом с помощью микрорегуляторов на устройство. Цель через цилиндр.
5. Опустите цилиндр до тех пор, пока он не сравняется с ламинами.
6. Прикрепите падающий стержень к электромагниту. Поместите желаемый цилиндр регулировки высоты падения на травматический блок.
7. Поместите падающий стержень в цилиндр.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для ослепленного исследования, хирург должен теперь покинуть комнату, не зная, если животное будет назначенна травма или фиктивной группы хирургии.
8. Выключите электромагнит. Удилище падает на открытый спинной мозг.
9. Используйте винт регулировки высоты, чтобы поднять стержень из спинного мозга.
10. Подтвердите травму, глядя на спинной мозг через микроскоп. Поврежденный участок будет выглядеть темнее, и кровотечение из средней линии судна будет очевидно.

5. Введение резкой травмы

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните эти шаги после 3.5.4.

1. С парой микросциссоров вырезать спинной мозг в идеальный вертикальный разрез.
2. Повторите разрез 2 мм на каудальной стороне тела.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Длина удаленного куска спинного мозга может быть скорректирована в рамках требования исследования. Тем не менее, 2 мм разрез будет regenerable¹⁰.
3. Убедитесь, что разрезы завершены. По завершении, почувствовать лезвия ножниц соскабливания вдоль брюшной части позвоночного канала.
4. Поднимите 2 мм кусок спинного мозга из позвоночного канала.

6. Закрытие хирургической раны

1. Верните животное на хирургический стол. В ослепленном исследовании, изменить положение киля, чтобы спинной мозг не виден хирургу.
2. Держите животное в положении склонного.
   1. Начните размещение 10,0 нейлоновых швов из самой хвостальной части горизонтального разреза. Закройте раны одним слоем.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не схватить кожу слишком туго, потому что это нанесет некроз.
   2. Работайте в направлении вертикальной части разреза.
   3. Достигнув угла, поверните чашку Петри и шов другой горизонтальный разрез.
   4. Установите швы на вертикальные разрезы.
   5. Не помещайте швы в верхнюю часть киля, так как кожа здесь не сможет удержаться.

7. Возвращение животного к безанестезиозному решению

1. Поднимите чашку Петри с животным и погрузите обоих очень осторожно в пресную воду только 5 см глубиной и дайте животному соскользнуть.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Глубина мелкой воды гарантирует, что животное не будет пытаться выплыть на поверхность, чтобы дышать.
2. Не меняйте воду в течение первой недели.
3. При кормлении животных убедитесь, что пища находится рядом с головой животного.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Цель этих мер состоит в том, чтобы избежать как можно больше движения в течение первой недели.

8. Послеоперационное УЗИ

1. До прекращения анестезии используйте высокочастотную ультразвуковую систему для получения изображений травмы, которые могут быть использованы для построения трехмерных изображений сайта SCI.
2. Прикрепите преобразователь к микроманипулятору, предпочтительно управляемый дистанционным джойстиком.
3. Погрузите обезожнее в положение лежа в небольшой контейнер, наполненный анестезируемым раствором.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Исправьте животное миниатюрными мешками с песком или другим оборудованием, чтобы избежать движения во время сканирующей последовательности.
4. Выровняйте кончик преобразователя с оси длины животного и погрузите его в раствор бензокаина, пока он не будет всего на несколько миллиметров выше киля за задними конечностями животного.
5. Определите сайт SCI.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Место травмы легко узнаваемо из-за отсутствующих спинеобразных процессов непосредственно над SCI.
6. Оптимизируйте изображение, регулируя настройки ультразвука. Убедитесь, что сайт SCI находится в центре изображения. Отрегулируйте поле зрения (т.е. глубину изображения, смещение глубины и ширину изображения) для покрытия участка SCI и прилегающей здоровой ткани. Отрегулируйте двухмерный выигрыш, чтобы оптимизировать контрастность изображения.
7. Путем подметать преобразователь ультразвука через место SCI с электронны управляемым микроманипулятором, приобретаете изображения B-режима покрывая место SCI на множественных sagittal поперечных местах ломтика, с последовательными ломтиками с межслойным интервалом 50 мкм. Приобрести cine-изображения, содержащие 500 кадров со скоростью кадров 50 кадров/с и частотой преобразователя 40 МГц.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для этой установки требуется электронный микроманипулятор, управляемый дистанционным джойстиком (шаг 8.2).
8. После окончания сканирующей последовательности вернитесь к шагу 7.

Результаты

Цель протокола заключается в том, чтобы произвести SCI, который будет парализовать двигатель и сенсорные функции caudal к травме. Поскольку аксолотл является регенерационным, он восстанавливает функцию в течение нескольких недель, что позволяет исследователям изучать регенерацию ЦНС в те...

Обсуждение

Поскольку риск повреждения спинного мозга является значительным, критические шаги протокола удаления спинномозговых процессов и расширения костного доступа к спинному каналу, если это необходимо. Как уже упоминалось в протоколе, удаление наиболее черепного процесса в первую очередь...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
25 g custom falling rod	custom home made
30 mm PVC pipe	custom home made
Acetone	Sigma-Aldrich	67-64-1	Propanone
Axolotl (Ambystoma mexicanum)	Exoterra GmbH	N/A	12-22 cm and 10 g - 80 g, All strains (wildtype, melanoid, white, albino, transgenic white with GFP)
Benzocain	Sigma-Aldrich	94-09-7	ethyl 4-aminobenzoate
Electromaget	custom home made
Excel 2010	Microsoft	N/A	Excel 2010 or newer
ImageJ	National Institutes of Health		ImageJ 1.5e or newer. Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, https://imagej.nih.gov/ij/, 1997-2016.
Kimwipes
Microsurgical instruments	N/A	N/A	Forceps and scissors
MS550s	Fujifilm, Visualsonics	MS550s	40 MHz center frequency, transducer
MS700	Fujifilm, Visualsonics	MS700	50 MHz center frequency, transducer
Petri dish	any maker
Soft cloth	N/A	N/A	Any piece of soft cloth measuring approximately 70 x 55 cm2 e.g. a dish towel
Stereo microscope
Vevo 2100	Fujifilm, Visualsonics	Vevo 2100	High frequency ultrasound system