Contusion Spinal Cord Injury via a Microsurgical Laminectomy in the Regenerative Axolotl

Résumé

Ce manuscrit présente des protocoles pour infliger chirurgicalement des lésions de la moelle épinière émoussées et pointues contrôlées à un axolotl régénérateur (Ambystoma mexicanum).

Résumé

Le but de cette étude est d'établir un modèle normalisé et reproductible de lésions médullaires émoussées régénératrices dans l'axolotl (Ambystoma mexicanum). La plupart des dommages cliniques de moelle épinière se produisent comme traumas émoussés d'énergie élevée, induisant des dommages de contusion. Cependant, la plupart des études dans la moelle épinière axolotl ont été menées avec des traumatismes pointus. Par conséquent, cette étude vise à produire un modèle régénérateur plus pertinent sur le plan clinique. En raison de leur capacité impressionnante à régénérer presque n'importe quel tissu, les axolotls sont largement utilisés comme modèles dans les études régénératives et ont été largement utilisés dans les études sur les lésions de la moelle épinière (SCI). Dans ce protocole, les axolotls sont anesthésiés par submersion dans une solution de benzocaïne. Sous le microscope, une incision angulaire est faite bilatéralement à un niveau juste caudal aux membres postérieurs. De cette incision, il est possible de disséquer et d'exposer les processus spinous. À l'aide de forceps et de ciseaux, une laminctomie à deux niveaux est effectuée, exposant la moelle épinière. Un dispositif de trauma sur mesure composé d'une tige tombante dans un cylindre est construit, et ce dispositif est utilisé pour induire une blessure de contusion à la moelle épinière. Les incisions sont ensuite sutures, et l'animal se remet de l'anesthésie. L'approche chirurgicale réussit à exposer la moelle épinière. Le mécanisme de trauma peut produire des dommages de contusion à la moelle épinière, comme confirmé par l'histologie, L'IRM, et l'examen neurologique. Enfin, la moelle épinière se régénère à partir de la blessure. L'étape critique du protocole est d'enlever les processus de pieux sans infliger des dommages à la moelle épinière. Cette étape nécessite une formation pour assurer une procédure sûre. En outre, la fermeture des plaies dépend fortement de ne pas infliger de dommages inutiles à la peau pendant l'incision. Le protocole a été exécuté dans une étude randomisée de 12 animaux.

Introduction

L'objectif global de cette étude était d'établir une méthode microchirurgicale contrôlée et reproductible pour infliger le SCI émoussé et pointu à l'axolotl (Ambystoma mexicanum), produisant un modèle régénérateur de lésions de la moelle épinière.

SCI est une condition grave qui, selon le niveau et l'étendue, inflige une incapacité neurologique aux extrémités ainsi que la vessie altérée et le contrôle de l'intestin^1,2^,3. La plupart des SCI sont le résultat de traumatismes émoussés à haute énergie tels que les accidents de la circulation et les chutes^4,5. Les blessures graves sont très rares. Par conséquent, le type de blessure macroscopique le plus commun est contusions.

Le système nerveux central des mammifères (SNC) est un tissu non régénérateur, donc aucune restauration de tissu neurologique suivant SCI est vu^6,7,8. D'autre part, certains animaux ont une capacité intrigante de régénérer les tissus, y compris les tissus du SNC. L'un de ces animaux est l'axolotl. Il est largement utilisé dans les études de biologie régénérative et est d'intérêt dans la régénération de la moelle épinière, parce qu'il est un vertébré^9,10,11^,12.

La plupart des études SCI dans l'axolotl sont effectuées soit comme l'amputation de la queue entière ou l'ablation d'une plus grande partie de la moelle épinière^9,10^,11,12. Récemment, une nouvelle étude a été éditée sur des dommages émoussés¹³ qui imite mieux des situations cliniques. Alors que l'amputation complète de l'appendice dans l'axolotl entraîne une régénération complète, certains phénomènes régénératifs non basés sur l'amputation dépendent du défaut critique de taille (CSD)^14,15. Cela signifie que les blessures dépassant un seuil critique ne sont pas régénérées. Pour développer un modèle régénérateur avec une valeur translationnelle clinique plus élevée, cette étude a étudié si un traumatisme émoussé de 2 mm dépasserait la limite de CSD.

Cette méthode est pertinente pour les chercheurs travaillant sur la régénération de la moelle épinière chez les petits modèles animaux, en particulier dans l'axolotl. En outre, il peut être d'intérêt plus général, car il montre une façon d'utiliser l'équipement de laboratoire standard pour développer un mécanisme de traumatisme contondant qui est approprié pour une utilisation chez les petits animaux en général.

Protocole

Tous les règlements institutionnels et gouvernementaux applicables concernant l'utilisation éthique des animaux ont été suivis au cours de cette étude. L'étude a été menée sous l'autorisation id: 2015-15-0201-0061 par l'Inspection danoise des expériences animales. Les animaux étaient des axolotls mexicains(Ambystoma mexicanum, masse corporelle moyenne - MST : 12,12 g et 1,25 g).

1. Préparation

1. Préparer l'axolotl pour l'anesthésie.
   1. Utilisez de l'eau du robinet non traitée chimiquement de haute qualité. Si vous n'êtes pas disponible, utilisez la solution Holtfreter de 40 %.
   2. Dissoudre 200 mg d'éthyle 4-aminobenzoate (benzocaïne) dans 3 ml d'acétone. Dissoudre cette solution dans 1 L d'eau du robinet ou 40% de la solution de Holtfreter.
2. Utilisez un plat Petri standard (100 mm de diamètre) placé sous un microscope stéréo comme table chirurgicale. Placez un tissu textile chirurgical sur le plat Petri.
   REMARQUE: L'utilisation d'un plat Petri comme zone chirurgicale permet le déplacement et la rotation de l'animal sans le toucher, assurant la stabilité de la colonne vertébrale pendant la chirurgie.
3. Préparer tous les instruments microchirurgicaux stériles (c.-à-d. ciseaux et forceps anatomiques).

2. Anesthésie

1. Placer l'axolotl dans un récipient avec une solution de benzocaïne pendant environ 45 min pour assurer une anesthésie profonde et stable.
   REMARQUE: La concentration donnée de benzocaïne provoquera une anesthésie dans toutes les tailles d'axolotls.
2. Vérifiez s'il y a des signes d'anesthésie générale dans les 30-45 minutes. Il s'agit notamment d'un manque total de mouvements branchiaux, réflexe de redressement, ou la réponse à des stimuli tactiles ou douloureux (pincement doux de la toile d'orteil).
3. Pour maintenir l'anesthésie, enveloppez les animaux dans des essuie-tout mouillés dans la solution anesthésique. Mouillez-les régulièrement avec cette solution pendant la procédure chirurgicale pour s'assurer que la peau et les branchies sont maintenues humides.
4. Récupérer l'animal après la chirurgie en le plaçant dans un récipient contenant de l'eau du robinet fraîche. Observez les signes de rétablissement, tels que le mouvement des branchies et le réflexe de redressement retrouvé, dans un délai de 1 h¹⁶.

3. Laminectomy microchirurgical

REMARQUE: La laminectomie est réalisée sous un stéréomicroscope.

1. Placer l'animal en position couchée sur le plat Petri. Enveloppez-le dans des essuie-tout afin que la queue soit exposée.
   REMARQUE: Les serviettes en papier sont excellentes pour assurer la stabilité tout au long de la procédure.
2. Identifiez les membres postérieurs. Faire la première incision juste caudal pour eux.
   1. Avec une paire de microscissors, effectuer une incision verticale de la quille jusqu'à ce que la proéminence osseuse des processus spinous se font sentir.
      REMARQUE: Soyez très prudent lorsque vous saisissez la quille et la peau avec des forceps, car ceux-ci infligent facilement des dommages à la peau délicate.
   2. Étendre la coupe latéralement, de sorte que l'incision traverse toute la largeur de la queue.
   3. Saisissez le processus de pointe avec des forceps pour assurer la bonne profondeur.
   4. Étendre les incisions verticales 1 mm au-dessous du processus de pointe des deux côtés.
3. Placez l'animal d'un côté pour effectuer des incisions ventrales et horizontales comme indiqué ci-dessous.
   1. Avec une paire de microscissors, à partir du point ventral de l'incision verticale, faire une incision horizontale d'environ 15 mm pour les animaux 10-20 g de poids. Rendre l'incision plus longue pour les animaux plus grands, et plus courte pour les petits animaux.
   2. À l'aide des ciseaux, disséquer médialement à travers l'incision horizontale jusqu'à ce que la colonne vertébrale soit ressentie dans la ligne médiane.
   3. Répétez les étapes 3.3, 3.3.1 et 3.3.2 de l'autre côté de l'animal.
4. Après avoir disséqué dans le plan médial profond des deux côtés, disséquer à travers la ligne médiane, reliant ainsi les deux incisions horizontales.
   1. Déplacez le morceau libre de la queue et de la quille d'un côté, exposant les processus pieux (Figure 1).
   2. Fixer le morceau de queue à l'aide d'essuie-tout humide.
5. Placez l'animal dans la position couchée à nouveau avec la tête face au côté non dominant du chirurgien.
   1. Avec une paire de forceps, saisissez les processus spinous juste caudal aux membres postérieurs. Appliquer un léger ascenseur à la fois vers le haut et vers la tête de l'animal.
   2. Placez les lames d'une paire de microscissors horizontalement autour du processus et coupez-le doucement. L'ascenseur sur le processus assure qu'il est maintenant enlevé, exposant la moelle épinière.
   3. Saisissez le processus spinous juste caudal à celui qui vient d'être enlevé et répéter les étapes 3.5.1 et 3.5.2.
      REMARQUE: Ceci devrait laisser une moelle épinière exposée correspondant à deux niveaux vertébraux. Lors de l'exécution de la laminectomy, une sécrétion mousseuse blanche apparaît souvent. La moelle épinière est facilement identifiée par son éclat distinctif, avec un vaisseau qui longe la ligne médiane.
   4. Selon la taille de l'animal, la zone exposée peut ne pas être assez large. À l'aide de deux paires de forceps, saisissez les lamelles des deux côtés de la moelle épinière et les tordez latéralement avec un mouvement doux.

4. Introduction d'une blessure de type de contusion (figure 2)

1. Gardez l'animal en position couchée.
2. Utilisez le plat Petri pour transférer l'animal à l'unité de traumatologie.
3. Demandez à un assistant de faire briller une lampe de poche sur la moelle épinière.
4. Placez le cylindre de l'unité de traumatologie de contusion au-dessus de la moelle épinière exposée à l'aide des micro-ajusteurs de l'unité. Visez à travers le cylindre.
5. Abaissez le cylindre jusqu'à ce qu'il soit à niveau avec le laminage.
6. Fixez la tige tombante à l'électroaimant. Placez le cylindre d'ajustement de la hauteur de chute désiré sur l'unité de traumatologie.
7. Placez la tige qui tombe dans le cylindre.
   REMARQUE: Pour une étude aveugle, le chirurgien doit maintenant quitter la pièce sans savoir si l'animal sera affecté à une blessure ou à un groupe de chirurgie fictive.
8. Éteignez l'électroaimant. La tige tombe sur la moelle épinière exposée.
9. Utilisez la vis d'ajustement de hauteur pour soulever la tige de la moelle épinière.
10. Confirmez la blessure en regardant la moelle épinière à travers le microscope. Le site blessé apparaîtra plus sombre, et des saignements du vaisseau de la ligne médiane seront apparents.

5. Présentation d'une blessure brutale

REMARQUE: Effectuez ces étapes après 3.5.4.

1. Avec une paire de microscissors couper la moelle épinière dans une coupe verticale parfaite.
2. Répéter la coupe de 2 mm sur le côté caudal du corps.
   REMARQUE: La longueur du morceau de moelle épinière enlevé peut être ajustée selon l'exigence de l'étude. Cependant, une coupe de 2 mm sera régenerable¹⁰.
3. Assurez-vous que les coupures sont terminées. Une fois terminé, sentir les lames des ciseaux gratter le long de la partie ventrale du canal rachidien.
4. Soulevez le morceau de moelle épinière de 2 mm du canal rachidien.

6. Fermeture de la plaie chirurgicale

1. Remettre l'animal à la table chirurgicale. Dans une étude aveuglée, repositionner la quille de sorte que la moelle épinière n'est pas visible pour le chirurgien.
2. Gardez l'animal en position couchée.
   1. Commencez à placer 10,0 sutures en nylon de la partie la plus caudale de l'incision horizontale. Fermez les plaies en une seule couche.
      REMARQUE: Ne saisissez pas la peau trop serrée, car elle infligera la nécrose.
   2. Travaillez vers la partie verticale de l'incision.
   3. Lorsque vous atteignez l'angle, tournez le plat Petri et suturez l'autre incision horizontale.
   4. Définir des sutures sur les incisions verticales.
   5. Ne placez pas les sutures dans la partie supérieure de la quille, parce que la peau ici ne sera pas en mesure de tenir.

7. Retour de l'animal à la solution sans anesthésie

1. Soulevez le plat Petri avec l'animal et plongez les deux très doucement dans l'eau douce à seulement 5 cm de profondeur et laissez l'animal glisser.
   REMARQUE: La faible profondeur de l'eau garantit que l'animal ne tentera pas de nager jusqu'à la surface pour respirer.
2. Ne changez pas l'eau pendant la première semaine.
3. Lorsque vous nourrissez les animaux, assurez-vous que la nourriture est placée près de la tête de l'animal.
   REMARQUE: Le but de ces mesures est d'éviter autant de mouvement que possible au cours de la première semaine.

8. Ultrasons postopératoires

1. Avant la fin de l'anesthésie, utilisez un système d'échographie à haute fréquence pour acquérir des images de la blessure qui peuvent être utilisées pour la construction d'images tridimensionnelles du site SCI.
2. Attachez le transducteur à un micromanipulateur de préférence régi par un joystick à distance.
3. Immerger l'animal anesthésié en position couchée dans un petit récipient rempli de solution anesthésique.
   REMARQUE: Fixez l'animal avec des sacs de sable miniatures ou d'autres équipements pour éviter le mouvement pendant la séquence de balayage.
4. Alignez la pointe du transducteur avec l'axe de longueur de l'animal et plongez-le dans la solution de benzocaïne jusqu'à ce qu'elle ne soit qu'à quelques millimètres au-dessus de la quille derrière les membres postérieurs de l'animal.
5. Identifier le site SCI.
   REMARQUE: Le site de la blessure est facilement reconnaissable en raison des processus de pieux manquants directement au-dessus de la SCI.
6. Optimisez l'image en ajustant les réglages de l'échographie. Assurez-vous que le site SCI est au centre de l'image. Ajuster le champ de vision (c.-à-d. profondeur d'image, décalage de profondeur et largeur d'image) pour couvrir le site SCI et les tissus sains adjacents. Ajustez le gain bidimensionnel pour optimiser le contraste d'image.
7. En balayant le transducteur d'ultrasons à travers le site SCI avec un micromanipulateur à commande électronique, acquérir des images en mode B couvrant le site SCI à plusieurs emplacements de tranches transversales sagittales, avec des tranches consécutives avec un intervalle intertranche de 50 m. Acquérir des images ciné contenant 500 images avec un taux d'image de 50 images/s et une fréquence de transducteur de 40 MHz.
   REMARQUE: Cette configuration nécessite un micromanipulateur électronique régi par un joystick à distance (étape 8.2).
8. Après avoir terminé la séquence de numérisation retour à l'étape 7.

Résultats

Le but du protocole est de produire un SCI qui paralysera le moteur et les fonctions sensorielles caudales à la blessure. Parce que l'axolotl est régénération-compétent, il restaure la fonction en quelques semaines, permettant aux chercheurs d'étudier la régénération du SNC pendant une courte période de temps.

L'anesthésie a été fournie pour 45 min à tous les animaux, et aucun épisode de rétablissement prématuré n'a été éprouvé. Tous les animaux récupérés dans l'heure ...

Discussion

Puisque le risque de blessure à la moelle épinière est significatif, les étapes critiques du protocole sont enlevant les processus pieux et l'élargissement de l'accès osseux au canal spinal si nécessaire. Comme mentionné dans le protocole, l'élimination du processus le plus crânien d'abord est fortement recommandé. Cela signifie que plus les processus caudaux protègent la moelle épinière contre les ciseaux. Il est recommandé d'assurer un accès chirurgical suffisant, c'est-à-dire de ne pas faire une incis...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
25 g custom falling rod	custom home made
30 mm PVC pipe	custom home made
Acetone	Sigma-Aldrich	67-64-1	Propanone
Axolotl (Ambystoma mexicanum)	Exoterra GmbH	N/A	12-22 cm and 10 g - 80 g, All strains (wildtype, melanoid, white, albino, transgenic white with GFP)
Benzocain	Sigma-Aldrich	94-09-7	ethyl 4-aminobenzoate
Electromaget	custom home made
Excel 2010	Microsoft	N/A	Excel 2010 or newer
ImageJ	National Institutes of Health		ImageJ 1.5e or newer. Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, https://imagej.nih.gov/ij/, 1997-2016.
Kimwipes
Microsurgical instruments	N/A	N/A	Forceps and scissors
MS550s	Fujifilm, Visualsonics	MS550s	40 MHz center frequency, transducer
MS700	Fujifilm, Visualsonics	MS700	50 MHz center frequency, transducer
Petri dish	any maker
Soft cloth	N/A	N/A	Any piece of soft cloth measuring approximately 70 x 55 cm2 e.g. a dish towel
Stereo microscope
Vevo 2100	Fujifilm, Visualsonics	Vevo 2100	High frequency ultrasound system