재생 액소틀의 미세 외과 적 중수 절제술을 통한 타박상 척수 손상

요약

이 원고는 외과적으로 제어 된 무딘 날카로운 척수 손상을 재생 성 축술(Ambystoma 멕시코)에가하는 프로토콜을 제공합니다.

초록

이 연구의 목적은 액소로틀(Ambystoma 멕시코)에서표준화되고 재현 가능한 재생 성 무딘 척수 손상 모델을 확립하는 것입니다. 대부분의 임상 척수 손상은 높은 에너지 무딘 외상으로 발생, 타박상 부상을 유도. 그러나, axolotl 척수에 있는 대부분의 연구 결과는 날카로운 외상으로 실시되었습니다. 따라서, 이 연구는 더 임상적으로 관련 있는 재생 모델을 생산 하는 것을 목표로. 거의 모든 조직을 재생하는 인상적인 능력으로 인해 액소로톨은 재생 연구에서 모델로 널리 사용되며 척수 손상 (SCI) 연구에서 광범위하게 사용되었습니다. 이 프로토콜에서, 액소로틀은 벤조카인 용액에 침수시킴으로써 마취된다. 현미경의 밑에, 각 절개는 뒷다리에 다만 꼬리치는 수준에서 양측으로 만들어집니다. 이 절개에서 가소 성 프로세스를 해부하고 노출 할 수 있습니다. 집게와 가위를 사용하여 척수를 노출하는 2 단계 의 라민 절제술이 수행됩니다. 실린더에 떨어지는 막대로 구성된 사용자 정의 외상 장치가 구성되며,이 장치는 척수에 타박상 부상을 유발하는 데 사용됩니다. 절개는 그 때 봉합되고, 동물은 마취에서 복구됩니다. 외과 접근은 척수를 드러내는 에서 성공적입니다. 외상 메커니즘은 조직학, MRI 및 신경 학적 검사에 의해 확인 된 바와 같이 척수에 타박상 부상을 일으킬 수 있습니다. 마지막으로 척수는 부상에서 재생됩니다. 프로토콜의 중요한 단계는 척수에 손상을 입히지 않고 가시 과정을 제거하는 것입니다. 이 단계에서는 안전한 절차를 보장하기 위한 교육이 필요합니다. 또한, 상처 폐쇄는 절개 중에 피부에 불필요한 손상을 입히지 않는 것에 크게 의존합니다. 프로토콜은 12마리의 동물을 무작위로 연구하여 수행되었다.

서문

이 연구의 전반적인 목표는 축색에 무딘 날카로운 SCI를 가하기 위한 제어되고 재현 가능한 미세 수술 방법을 확립하는 것이었습니다(Ambystoma 멕시카눔),재생 척수 손상 모델을 생성.

SCI는 수준과 정도에 따라 방광 및 대장 조절^장애와함께 사지에 신경 장애를 가하는 심각한 상태이며^1,2,3. 대부분의 SCI는 교통사고와 같은 고에너지 무딘 외상의 결과이며^4,5. 날카로운 부상은 매우 드뭅니다. 따라서 가장 일반적인 거시적 상해 유형은 타박상입니다.

포유류 중추 신경계(CNS)는 재생되지 않는 조직이므로 SCI에 따른 신경 조직의 복원이^{없음은 6,7,8.} 다른 한편으로는, 몇몇 동물은 CNS 조직을 포함하여 조직을 재생하는 흥미로운 기능이 있습니다. 이 동물 들 중 하나는 축 색으로 틀. 그것은 널리 재생 생물학의 연구에 사용되며 척수 재생에 관심이, 그것은 척추 동물이기 때문에^9,10,11,12.

액소로틀에서의 대부분의 SCI 연구는 전체 꼬리의 절단 또는 척수의 큰 부분의 절제로서 수행된다^9,10,11,12. 최근, 새로운 연구는 무딘 부상에 발표 되었다¹³ 그 더 나은 임상 상황을 모방. 액소로틀에서완전한 부속절단이 완전한 재생을 초래하는 반면, 일부 비절단기반 재생현상은 임계크기 결손(CSD)^14,15에의존한다. 즉, 임계 임계값을 초과하는 부상은 재생되지 않습니다. 더 높은 임상 번역 값을 가진 재생 모델을 개발하기 위하여, 이 연구 결과는 2 mm 무딘 외상이 CSD 한계를 초과할 지 여부를 조사했습니다.

이 방법은 작은 동물 모델에서 척수 재생에 종사하는 연구원, 특히 액소로틀에서 관련이 있습니다. 더욱이, 그것은 일반적인 관심사일 지도 모릅니다, 일반적인 작은 동물에서 사용하기에 적합한 무딘 외상 기계장치를 개발하기 위하여 표준 실험실 장비를 사용하는 쪽을 전시하기 때문에.

프로토콜

동물의 윤리적 사용에 관한 모든 적용 가능한 기관 및 정부 규정이 이 연구 기간 동안 준수되었습니다. 이 연구는 승인 ID에서 실시되었다: 덴마크 동물 실험 검사에 의해 2015-15-0201-0061. 동물은 멕시코 액소톨(Ambystoma 멕시카눔,평균 체질량 ± STD: 12.12 g ± 1.25 g)이었다.

1. 준비

1. 마취를 위한 액소를 준비하십시오.
   1. 고품질의 비화학 처리 된 수돗물을 사용하십시오. 사용할 수 없는 경우 40% Holtfreter의 솔루션을 사용하십시오.
   2. 아세톤의 3 mL에 에틸 4-아미노 벤조에이트 (벤조카인)의 200 mg을 용해. 이 용액을 수돗물 1L 또는 홀트프레터 용액 40%에 녹입니다.
2. 스테레오 현미경 아래에 놓인 표준 페트리 접시(직경 100mm)를 수술용 테이블로 사용하십시오. 페트리 접시에 수술용 직물 천을 놓습니다.
   참고: 페트리 접시를 수술 공간으로 사용하면 동물을 건드리지 않고도 움직이고 회전할 수 있으므로 수술 중 척추의 안정성을 보장할 수 있습니다.
3. 모든 멸균 미세 수술 기구 (즉, 가위 및 해부학 적 집게)를 준비하십시오.

2. 마취

1. 약 45 분 동안 벤조카인 용액이있는 용기에 액소틀을 놓아 깊고 안정적인 마취를 보장하십시오.
   참고: 벤조카인의 주어진 농도는 축색의 모든 크기에서 마취를 일으킬 것입니다.
2. 30-45 분 이내에 전신 마취의 징후를 확인하십시오. 이들은 아가미 운동의 완전한 부족을 포함합니다, 오른쪽 반사, 또는 촉각 또는 고통스러운 자극에 대한 응답 (발가락 웹의 부드러운 꼬집기).
3. 마취를 유지하기 위해 마취용액에 적신 종이 타월에 동물을 감쌉하십시오. 피부와 아가미가 촉촉하게 유지되도록 수술 시 이 용액으로 정기적으로 적시세요.
4. 수술 후 신선한 수돗물이 들어있는 용기에 넣어 동물을 회복하십시오. 1 시간¹⁶이내에 아가미 운동 및 회복 된 오른쪽 반사와 같은 회복 의 징후를 관찰하십시오.

3. 미세 외과 중수 절제술

참고: 라민 절제술은 입체 현미경으로 수행됩니다.

1. 동물을 페트리 접시에 놓기 쉬운 위치에 놓습니다. 꼬리가 노출되도록 종이 타월에 싸서.
   참고: 종이 타월은 절차 전반에 걸쳐 안정성을 보장하기에 우수합니다.
2. 뒷다리를 식별합니다. 첫 번째 절개는 그들에게 그냥 꼬리를 확인합니다.
   1. 한 쌍의 마이크로시저로 용골에서 수직 절개를 수행하여 가시 공정의 뼈가 두드러질 때까지 느껴질 때까지.
      참고: 포셉으로 용골과 피부를 잡을 때 는 섬세한 피부에 쉽게 손상을 입히기 때문에 매우 조심하십시오.
   2. 절개가 꼬리의 전체 너비를 통과할 수 있도록 컷을 측면으로 확장합니다.
   3. 올바른 깊이를 보장하기 위해 집게로 가시 공정을 잡습니다.
   4. 양쪽의 가시 공정 아래 수직 절개를 1mm 아래로 확장합니다.
3. 아래에 명시된 대로 동물을 한쪽에 놓고 복부 및 수평 절개를 수행합니다.
   1. 한 쌍의 마이크로시저로 수직 절개의 복부 지점에서 시작하여 동물의 무게 가 10-20g의 약 15mm의 수평 절개를합니다. 더 큰 동물의 경우 절개를 더 길게 하고, 더 작은 동물의 경우 더 짧게 만듭니다.
   2. 가위를 사용하여 척추 기둥이 중간선에서 느껴질 때까지 수평 절개를 통해 내측해 합니다.
   3. 동물의 반대편에서 3.3, 3.3.1 및 3.3.2 단계를 반복합니다.
4. 양쪽에서 깊은 내측 평면에서 해부한 후, 중간선을 통해 해부되어 두 개의 수평 절개를 연결합니다.
   1. 꼬리와 용골의 자유 조각을 한쪽으로 이동하여 가풍 공정을 노출시합니다(그림1).
   2. 젖은 종이 타월을 사용하여 꼬리 조각을 고정합니다.
5. 외과 의사의 비 지배적 인 측면을 향한 머리와 다시 경향이 위치에 동물을 배치합니다.
   1. 한 쌍의 집게로, 뒤의 사지에 그냥 꼬리를 꼬리가 있는 가소성 과정을 파악하십시오. 동물의 머리 위로 그리고 머리 쪽으로 부드럽게 들어 올립니다.
   2. 한 쌍의 마이크로시저 잎을 공정 주변에 수평으로 놓고 부드럽게 자릅니다. 프로세스의 리프트는 척수를 노출, 지금 제거되도록합니다.
   3. 방금 제거 된 것으로 가소 성 과정을 잡고 3.5.1 및 3.5.2 단계를 반복하십시오.
      참고: 이것은 2개의 척추 수준에 대응하는 노출된 척수를 남겨두어야 합니다. 라미네절제술을 수행 할 때, 흰색 거품 분비가 종종 나타납니다. 척수는 중간선을 따라 달리는 혈관과 함께 독특한 광택으로 쉽게 식별됩니다.
   4. 동물의 크기에 따라 노출 된 영역이 충분히 넓지 않을 수 있습니다. 두 쌍의 집게를 사용하여 척수 양쪽에 있는 라미나(laminae)를 잡고 부드러운 움직임으로 옆으로 비틀어 보세요.

4. 타박상 유형 상해 소개(그림 2)

1. 동물을 쉬운 위치에 두십시오.
2. 페트리 접시를 사용하여 동물을 외상 단위로 옮김을 옮김으로 옮김을 옮김을 옮김으로 옮김을 옮김을 옮김으로 옮김을 옮김으로 옮김을 활용한다.
3. 조수가 척수에 손전등을 비추게 하십시오.
4. 장치의 마이크로 조절기를 사용하여 노출된 척수 위에 타박상 외상 유닛 실린더를 놓습니다. 실린더를 통해 조준하십시오.
5. 라미나와 레벨이 될 때까지 실린더를 낮춥습니다.
6. 떨어지는 막대를 전자석에 부착합니다. 원하는 낙하 높이 조정 실린더를 외상 유닛에 놓습니다.
7. 떨어지는 막대를 실린더에 놓습니다.
   참고: 맹인 연구를 위해, 외과 의사는 이제 동물이 부상이나 가짜 수술 그룹에 할당 될 지 모르고 방을 떠나야한다.
8. 전자석을 끕니다. 막대는 노출 된 척수에 떨어집니다.
9. 높이 조절 나사를 사용하여 척수에서 막대를 들어 올립니다.
10. 현미경을 통해 척수를 보고 부상을 확인합니다. 부상당한 부위는 더 어둡게 나타나고 중간 선 선박에서 출혈이 분명합니다.

5. 날카로운 부상 소개

참고: 3.5.4 이후 이 단계를 수행합니다.

1. 한 쌍의 마이크로시저로 척수를 완벽한 수직 절단으로 잘라냅니다.
2. 컷을 2mm 를 몸의 꼬리 쪽으로 반복합니다.
   참고: 제거된 척수 조각의 길이는 연구 요건에 따라 조정할 수 있습니다. 그러나, 2mm 절단은¹⁰을 갱신 할 수 있습니다.
3. 절단이 완료되었는지 확인합니다. 완료되면 척추 관의 복부 부분을 따라 가위 가위의 칼날이 긁히는 것을 느낍니다.
4. 척수 2mm 조각을 척수에서 들어 올립니다.

6. 외과 상처 닫기

1. 동물을 수술테이블로 되돌려 보라고 합니다. 맹인 연구에서는 척수를 외과 의사에게 볼 수 없도록 용골을 재배치하십시오.
2. 동물을 쉬운 위치에 두십시오.
   1. 수평 절개의 가장 꼬리 부분에서 10.0 나일론 봉합사를 배치하기 시작합니다. 상처를 한 층으로 닫습니다.
      참고: 괴사를 입힐 것이기 때문에 피부를 너무 단단히 잡지 마십시오.
   2. 절개의 수직 부분을 향해 작업합니다.
   3. 각도에 도달하면 페트리 접시를 돌리고 다른 수평 절개를 봉합합니다.
   4. 수직 절개에 봉합사를 설정합니다.
   5. 여기에 피부가 보유 할 수 없기 때문에 용골의 가장 위쪽에 봉합사를 두지 마십시오.

7. 동물을 마취없는 솔루션으로 되돌리기

1. 동물과 함께 페트리 접시를 들어 올리고 5cm 깊이의 담수에 매우 부드럽게 담그고 동물이 미끄러지게하십시오.
   참고: 얕은 수심은 동물이 숨을 쉬기 위해 수면으로 수영하지 않도록 합니다.
2. 첫 주 동안에는 물을 바꾸지 마십시오.
3. 동물에게 먹이를 주면 음식이 동물의 머리 근처에 놓여 있는지 확인하십시오.
   참고: 이러한 조치의 목적은 첫 주 동안 가능한 한 많은 움직임을 피하기 위한 것입니다.

8. 수술 후 초음파

1. 마취가 종료되기 전에 고주파 초음파 시스템을 사용하여 SCI 부위의 3 차원 이미지 구성에 사용할 수있는 부상 이미지를 수집하십시오.
2. 트랜스듀서를 리모트 조이스틱에 의해 제어되는 마이크로 조작기에 부착하십시오.
3. 마취 된 동물을 마취 용액으로 채워진 작은 용기에 적시고 발생하기 쉬운 위치에 담급전하십시오.
   참고: 스캔 시퀀스 중에 움직임을 피하기 위해 소형 샌드백 이나 기타 장비로 동물을 고정하십시오.
4. 트랜스듀서의 끝을 동물의 길이 축에 맞추고 동물의 뒷다리 뒤쪽 용골 보다 몇 밀리미터 정도 가을이 될 때까지 벤조카인 용액에 담급전시넣습니다.
5. SCI 사이트를 식별합니다.
   참고: 부상 부위는 SCI 바로 위에 누락 된 가시 공정으로 인해 쉽게 인식 할 수 있습니다.
6. 초음파 설정을 조정하여 이미지를 최적화합니다. SCI 사이트가 이미지의 가운데에 있는지 확인합니다. SCI 사이트와 인접한 정상 조직을 덮도록 시야(예: 이미지 깊이, 깊이 오프셋 및 이미지 너비)를 조정합니다. 2차원 게인을 조정하여 이미지 대비를 최적화합니다.
7. 전자작동 마이크로조작마이크로조작기로 SCI 사이트 전체에 초음파 트랜스듀서를 스위핑하여, 여러 시상 단면 슬라이스 위치에서 SCI 부위를 덮는 B 모드 이미지를 획득하고, 슬라이스 간격을 가진 연속슬라이스를 통해 50 μm. ~ 50 프레임 / s의 프레임 속도와 40 MHz의 트랜스듀서 주파수와 500 프레임을 포함하는 시네 이미지를 획득합니다.
   참고: 이 설정에는 원격 조이스틱이 제어하는 전자 마이크로 매니더가 필요합니다(단계 8.2).
8. 스캐닝 시퀀스를 완료한 후 7단계로 복귀한다.

결과

프로토콜의 목적은 부상에 모터 및 감각 기능을 마비시킬 SCI를 생성하는 것입니다. axolotl는 재생 유능한 이기 때문에 그것은 주 안에 기능을 복원, 연구원이 짧은 시간 범위 동안 CNS 재생을 공부 할 수 있도록.

마취는 모든 동물에게 45 분 동안 제공되었으며 조기 회복의 에피소드는 경험되지 않았습니다. 모든 동물은 1 시간 이내에 회복하고 다음 주^13,

토론

척수 손상의 위험이 중요하기 때문에 프로토콜의 중요한 단계는 가시 과정을 제거하고 필요한 경우 척추 관에 대한 뼈 접근을 넓히는 것입니다. 프로토콜에서 언급했듯이 가장 두개골 프로세스를 먼저 제거하는 것이 좋습니다. 이것은 더 많은 꼬리 프로세스가 척수에 의해 명중되는 것을 보호한다는 것을 의미합니다. 그것은 충분한 수술 접근을 보장하는 것이 좋습니다, 너무 작은 기본 절개를하...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
25 g custom falling rod	custom home made
30 mm PVC pipe	custom home made
Acetone	Sigma-Aldrich	67-64-1	Propanone
Axolotl (Ambystoma mexicanum)	Exoterra GmbH	N/A	12-22 cm and 10 g - 80 g, All strains (wildtype, melanoid, white, albino, transgenic white with GFP)
Benzocain	Sigma-Aldrich	94-09-7	ethyl 4-aminobenzoate
Electromaget	custom home made
Excel 2010	Microsoft	N/A	Excel 2010 or newer
ImageJ	National Institutes of Health		ImageJ 1.5e or newer. Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, https://imagej.nih.gov/ij/, 1997-2016.
Kimwipes
Microsurgical instruments	N/A	N/A	Forceps and scissors
MS550s	Fujifilm, Visualsonics	MS550s	40 MHz center frequency, transducer
MS700	Fujifilm, Visualsonics	MS700	50 MHz center frequency, transducer
Petri dish	any maker
Soft cloth	N/A	N/A	Any piece of soft cloth measuring approximately 70 x 55 cm2 e.g. a dish towel
Stereo microscope
Vevo 2100	Fujifilm, Visualsonics	Vevo 2100	High frequency ultrasound system