Rejeneratif Axolotl'da Mikrocerrahi Laminektomi Ile Kontüzyon Omurilik Yaralanması

Özet

Bu el yazması cerrahi bir rejeneratif aksiyom(Ambystoma mexicanum)kontrollü künt ve keskin omurilik yaralanmaları inflicting için protokoller sunar.

Özet

Bu çalışmanın amacı axolotl(Ambystoma mexicanum)standart ve tekrarlanabilir rejeneratif omurilik yaralanması modeli oluşturmaktır. Klinik omurilik yaralanmalarının çoğu yüksek enerjili künt travmalar olarak ortaya çıkar, kontüzyon yaralanmaları indükleyen. Ancak, axolotl omurilik teki çalışmaların çoğu keskin travmalarla yapılmıştır. Bu nedenle, bu çalışma daha klinik olarak ilgili rejeneratif bir model üretmeyi amaçlamaktadır. Hemen hemen her türlü dokuyu yenileme yetenekleri sayesinde, axolotls rejeneratif çalışmalarda model olarak yaygın olarak kullanılır ve omurilik yaralanması (SCI) çalışmalarında yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu protokolde, axolotls bir benzocaine çözeltisi daldırma tarafından anestezi edilir. Mikroskop altında, açısal bir kesi sadece arka ekstremitelere kaudal bir düzeyde ikili olarak yapılır. Bu kesiden, spinous süreçleri incelemek ve ortaya çıkarmak mümkündür. Forceps ve makas kullanılarak, iki seviyeli laminektomi yapılır, omurilik açığa. Bir silindir düşen çubuk oluşan özel bir travma cihazı inşa edilir, ve bu cihaz omurilik bir çürük yaralanması neden olmak için kullanılır. Kesikler daha sonra dikilir ve hayvan anesteziden kurtulur. Cerrahi yaklaşım omuriliği ortaya çıkarmada başarılıdır. Travma mekanizması, histoloji, MRG ve nörolojik muayene ile doğrulanan, omurilik kontüzyon yaralanmaları üretebilir. Son olarak, omurilik yaralanma dan yeniler. Protokolün kritik adımı, omurilikte hasar vermeden spinous süreçleri kaldırmaktır. Bu adım, güvenli bir yordam sağlamak için eğitim gerektirir. Ayrıca, yara kapanması son derece kesi sırasında cilde gereksiz hasar vermemebağlıdır. Protokol, 12 hayvan üzerinde yapılan randomize bir çalışmada gerçekleştirildi.

Giriş

Bu çalışmanın genel amacı, yenileyici omurilik yaralanması modeli üreten axolotl(Ambystoma mexicanum)künt ve keskin SCI vermek için kontrollü ve tekrarlanabilir bir mikrocerrahi yöntem oluşturmaktı.

SCI, düzeyi ve ölçüde bağlı olarak, bozulmuş mesane ve bağırsak^kontrolü1 ile birlikte ekstremitelere nörolojik sakatlık inflicts ciddi bir durumdur^,2,3. En SCI trafik kazaları gibi yüksek enerjik travma sonucu ve düşüyor^4,5. Keskin yaralanmalar çok nadirdir. Bu nedenle, en sık görülen makroskopik yaralanma türü çürükler olduğunu.

Memeli merkezi sinir sistemi (CNS) non-rejeneratif doku, sci aşağıdaki nörolojik doku bu nedenle hiçbir restorasyon görülür^6,7,8. Öte yandan, bazı hayvanların cns doku da dahil olmak üzere dokuları yenilemek için ilginç bir yeteneği var. Bu hayvanlardan biri axolotl. Bu yaygın rejeneratif biyoloji çalışmalarında kullanılan ve omurilik rejenerasyon ilgi, bir omurgalı olduğu için^9,10,11,12.

Aksitotl en SCI çalışmaları ya tüm kuyruk ampütasyon veya omurilik^9,10,11,12daha büyük bir bölümünün ablasyon olarak yapılır. Son zamanlarda, klinik durumları daha iyi taklit künt yaralanmalar¹³ yeni bir çalışma yayınlandı. Axolotl tam aparat amputasyonu tam rejenerasyon sonuçları ise, bazı non-ampütasyon tabanlı rejeneratif olaylar kritik boyut defekti bağlıdır (CSD)^14,15. Bu, kritik eşiği aşan yaralanmaların yenilenolmadığı anlamına gelir. Daha yüksek klinik çevirideğerine sahip rejeneratif bir model geliştirmek için, bu çalışmada 2 mm künt travmanın CSD sınırını aşıp aşmayacağı araştırılmıştır.

Bu yöntem, özellikle axolotl küçük hayvan modellerinde omurilik rejenerasyonu üzerinde çalışan araştırmacılar için geçerlidir. Ayrıca, genel olarak küçük hayvanlarda kullanıma uygun bir künt travma mekanizması geliştirmek için standart laboratuvar ekipmanı kullanarak bir yol sergiler, çünkü daha genel ilgi olabilir.

Protokol

Bu çalışmada hayvanların etik kullanımına ilişkin tüm geçerli kurumsal ve resmi düzenlemeler izlenmiúve Çalışma, Danimarka Hayvan Deney Ii. Hayvanlar Meksika aksolotllarıydı (Ambystoma mexicanum, ortalama vücut kütlesi ± STD: 12.12 g ± 1.25 g).

1. Hazırlık

1. Anestezi için axolotl hazırlayın.
   1. Yüksek kaliteli kimyasal olarak arıtılmayan musluk suyu kullanın. Eğer kullanılamıyorsa, %40 Holtfreter'ın çözeltisini kullanın.
   2. Çözün 200 etil mg 4-aminobenzoat (benzocaine) aseton 3 mL içinde. Bu çözeltiyi 1 L musluk suyunda veya Holtfreter çözeltisinde çözün.
2. Cerrahi tablo olarak stereo mikroskop altına yerleştirilen standart bir Petri kabı (100 mm çapında) kullanın. Petri kabına cerrahi bir tekstil bezi yerleştirin.
   NOT: Petri kabının cerrahi alan olarak kullanılması, hayvanın dokunmadan hareket etmesini ve dönmesini sağlayarak ameliyat sırasında spinal stabiliteyi sağlar.
3. Tüm steril mikrocerrahi aletleri (örn. makas ve anatomik ensepsler) hazırlayın.

2. Anestezi

1. Derin ve kararlı anestezi sağlamak için yaklaşık 45 dakika boyunca benzokain çözeltisi ile bir kap içine axolotl yerleştirin.
   NOT: Benzokain verilen konsantrasyon axolotls tüm boyutlarda anestezi neden olacaktır.
2. 30-45 dk içinde genel anestezi belirtileri olup olmadığımı kontrol edin. Bu solungaç hareketleri tam bir eksikliği içerir, refleks düzeltme, ya da dokunsal veya ağrılı uyaranlara yanıt (ayak ağı nazik çimdikleme).
3. Anesteziyi korumak için, anestezik çözeltide ıslak kağıt havlularla hayvanları sarın. Cilt ve solungaçların nemli tutulmasını sağlamak için cerrahi işlem sırasında bu solüsyonu düzenli olarak ıslatın.
4. Ameliyattan sonra taze musluk suyu içeren bir kapta yerleştirerek hayvan kurtarmak. 1 saat¹⁶içinde solungaç hareketi ve yeniden sağlama refleksi gibi iyileşme belirtileri gözlemleyin.

3. Mikrocerrahi Laminektomi

NOT: Laminektomi stereomikroskop altında yapılır.

1. Petri kabına eğilimli pozisyonda hayvan yerleştirin. Kuyruk maruz böylece kağıt havlu sarın.
   NOT: Kağıt havlular, prosedür boyunca stabiliteyi sağlamak için mükemmeldir.
2. Arka uzuvları tanımlayın. İlk kesiği onlara sadece kaudal yap.
   1. Mikrosksor bir çift ile, spinous süreçlerin kemik çıkıntı hissedilene kadar omurga dikey bir kesi gerçekleştirin.
      NOT: Keel ve cildi forcep'lerle kavradığınızda çok dikkatli olun, çünkü bunlar hassas cilde kolayca zarar verir.
   2. Kesiği yanal olarak uzatın, böylece kesi kuyruğun tüm genişliğini geçer.
   3. Doğru derinliği sağlamak için spinous işlemini forceps ile kavrayın.
   4. Her iki taraftaki spinous prosesin 1 mm altındaki dikey kesileri uzatın.
3. Aşağıda belirtildiği gibi ventral ve yatay kesiler gerçekleştirmek için bir tarafa hayvan yerleştirin.
   1. Bir çift mikrosikül ile, dikey kesinin ventral noktasından başlayarak, 10-20 g ağırlığındaki hayvanlar için yaklaşık 15 mm'lik yatay bir kesi yapın. Daha büyük hayvanlar için kesiyi daha uzun, küçük hayvanlar için daha kısa yapın.
   2. Makas kullanarak, vertebral kolon orta hatta hissedilene kadar yatay kesi ile medially inceleyin.
   3. Hayvanın diğer tarafında ki 3.3, 3.3.1 ve 3.3.2 adımlarını tekrarlayın.
4. Her iki taraftan derin medial düzlemde kesilen, orta hattan kesişen, bu nedenle iki yatay kesi ler bağlayan.
   1. Serbest kuyruk ve omurga parçasını bir tarafa taşıyarak spinous prosesleri ortaya çıkarır (Şekil 1).
   2. Islä±k kağıt havlular kullanarak kuyruk parçasını sabitle
5. Başı cerrahın baskın olmayan tarafına bakacak şekilde hayvanı tekrar yatkın konuma getirin.
   1. Bir çift forceps ile, sadece arka ekstremitelere kaudal süreçleri kavramak. Hem yukarı hem de hayvanın başına doğru hafif çehre uygulayın.
   2. Bir çift mikrosiyenin bıçaklarını sürecin etrafına yatay olarak yerleştirin ve yavaşça kesin. İşlemdeki asansör, omuriliğin açığa çıkarılmasını sağlar.
   3. Sadece kaldırıldı ve adımları 3.5.1 ve 3.5.2 tekrarlamak için spinous süreci kavramak.
      NOT: Bu iki vertebral düzeylerine karşılık gelen bir maruz omurilik bırakmalıdır. Laminektomi yapılırken genellikle beyaz köpüklü bir salgı ortaya çıkar. Omurilik kolayca ayırt edici parlaklık ile tespit edilir, orta hat boyunca çalışan bir damar ile birlikte.
   4. Hayvanın büyüklüğüne bağlı olarak, maruz kalan alan yeterince geniş olmayabilir. Forseps iki çift kullanarak, omuriliğin her iki tarafında lamina kavramak ve hafif bir hareket ile yanal büküm.

4. Kontüzyon Tipi Yaralanmanın Tanıtılması (Şekil 2)

1. Hayvanı yatkın pozisyonda tutun.
2. Hayvanı travma ünitesine aktarmak için Petri kabını kullan.
3. Bir asistan omuriliğine el feneri yaksın.
4. Kontüzyon travma ünitesi silindirini, ünitedeki mikro ayarlayıcıları kullanarak açıkta kalan omuriliğin üzerine yerleştirin. Silindirin içinden nişan ala.
5. Lamina ile düz olana kadar silindiri indirin.
6. Düşen çubuğu elektromıknatısa takın. Travma ünitesi üzerine istenilen düşen yükseklik ayarı silindirini yerleştirin.
7. Düşen çubuğu silindire yerleştirin.
   NOT: Kör bir çalışma için, cerrah şimdi hayvan bir yaralanma ya da sahte bir cerrahi gruba atanacak olup olmadığını bilmeden odadan çıkmalıdır.
8. Elektromıknatısı kapat. Çubuk açıkta kalan omuriliğine düşüyor.
9. Omuriliğin çubuğunu kaldırmak için yükseklik ayarlama vidasını kullanın.
10. Mikroskoptan omurilik bakarak yarayı doğrulayın. Yaralı bölge daha karanlık görünecek ve orta hat damarından kanama belirgin olacak.

5. Keskin Yaralanma Tanıtımı

NOT: 3.5.4'ten sonra bu adımları gerçekleştirin.

1. Bir çift mikroskor ile mükemmel bir dikey kesim omuriliği kesti.
2. Kesilen 2 mm'yi vücudun kaudal tarafına kadar tekrarlayın.
   NOT: Omurilik kaldırılan parçanın uzunluğu çalışma gereksinimine göre ayarlanabilir. Ancak, 2 mm kesim regenerable¹⁰olacaktır.
3. Kesiklerin tamamlandığından emin olun. Tamamlandıktan sonra, spinal kanalın ventral kısmı boyunca kazınan makas bıçakları hissedin.
4. Omurilik kanalından 2 mm'lik omurilik parçasını kaldırın.

6. Cerrahi Yaranın Kapatılması

1. Hayvanı cerrahi masaya geri getir. Kör bir çalışmada, omurilik cerrah için görünür değil, böylece omurga yeniden konumlandırın.
2. Hayvanı yatkın pozisyonda tutun.
   1. Yatay kesien en kaudal kısmından 10.0 naylon dikiş yerleştirmeye başlayın. Yaraları tek bir katmanda kapatın.
      NOT: Çok sıkı cilt kavramak etmeyin, nekroz neden olacak çünkü.
   2. Kesiğin dikey kısmına doğru çalışın.
   3. Açıya ulaşırken, Petri kabını çevirin ve diğer yatay kesidik.
   4. Dik kesiler üzerine dikişler ayarlayın.
   5. Omurganın en üst kısmına dikiş koymayın, çünkü buradaki deri tutamaz.

7. Hayvanı Anestezisiz Çözüme Döndürmek

1. Petri kabını hayvanla birlikte kaldırın ve her ikisini de sadece 5 cm derinliğinde tatlı suya hafifçe batırın ve hayvanın kaymasını bırakın.
   NOT: Sığ su derinliği, hayvanın nefes almak için yüzeye yüzmeye çalışmamasını sağlar.
2. İlk hafta boyunca suyu değiştirmeyin.
3. Hayvanları beslerken, yiyeceğin hayvanın başının yakınına yerleştirildiğinden emin olun.
   NOT: Bu önlemlerin amacı, ilk hafta boyunca mümkün olduğunca çok hareket önlemektir.

8. Postoperatif Ultrason

1. Anestezinin sona erdirilmesinden önce, SCI sitesinin üç boyutlu görüntülerinin yapımında kullanılabilecek yaralanmanın görüntülerini elde etmek için yüksek frekanslı bir ultrason sistemi kullanın.
2. Dönüştürücü, tercihen uzak bir joystick tarafından yönetilen bir mikromanipülatöre takın.
3. Anesteziye ait hayvanı yatkın pozisyonda anestezik solüsyonla dolu küçük bir kapta batırın.
   NOT: Tarama sırasında hareket önlemek için minyatür kum torbaları veya diğer ekipman ile hayvan düzeltin.
4. Dönüştürücünün ucunu hayvanın uzunluk ekseni ile hizalayın ve hayvanın arka ekstremitelerinin arkasındaki omurganın sadece birkaç milimetre yukarısına kadar benzocaine çözeltisine batırın.
5. SCI sitesini tanımlayın.
   NOT: Sci'nin hemen üstündeki eksik spinous süreçler nedeniyle yaralanma bölgesi kolayca tanınabilir.
6. Ultrason ayarlarını ayarlayarak görüntüyü optimize edin. SCI sitesinin görüntünün merkezinde olduğundan emin olun. SCI sitesini ve bitişik sağlıklı dokuyu kapsayacak şekilde görüş alanını (yani görüntü derinliği, derinlik ofset ve görüntü genişliği) ayarlayın. Görüntü kontrastını en iyi duruma getirmek için iki boyutlu kazancı ayarlayın.
7. Ultrason transdüserini elektronik olarak işletilen bir mikromanipülatörle SCI alanı boyunca süpürerek, sci sitesini kapsayan B-modlu görüntüleri birden fazla sagittal kesit dilim lokasyonunda, dilimler arası aralıklı ardışık dilimlerle elde edin 50 m. ~50 kare/s kare hızı na ve 40 MHz'lik bir transdüser frekansına sahip 500 kare içeren sine görüntüleri edinin.
   NOT: Bu kurulum, uzaktan kumanda çubuğu (adım 8.2) tarafından yönetilen bir elektronik mikromanipülatör gerektirir.
8. Tarama sırasını bitirdikten sonra adım 7'ye dönün.

Sonuçlar

Protokolün amacı, motor ve duyusal fonksiyonları yaralanmak için kaudal felç edecek bir SCI üretmektir. Aksitotl rejenerasyon yetkin olduğu için birkaç hafta içinde işlevini geri yükler ve araştırmacıların kısa bir süre içinde CNS rejenerasyonunu incelemelerine olanak sağlar.

Tüm hayvanlara 45 dakika anestezi sağlandı ve erken iyileşme atakları yaşanmadı. Tüm hayvanlar bir saat içinde kurtarıldı ve sonraki haftalarda anestezi hasar belirtisi gösterdi

Tartışmalar

Omurilik yaralanma riski önemli olduğundan, protokolün kritik adımları spinous süreçleri kaldırarak ve gerekirse omurilik kanalına kemik erişimi genişletilmesi. Protokolde belirtildiği gibi, ilk olarak en kafatası işleminin kaldırılması şiddetle tavsiye edilir. Bu daha kaudal süreçler makas tarafından vurulduktan omurilik korumak anlamına gelecektir. Bu yeterli cerrahi erişim sağlamak için tavsiye edilir, çok küçük bir birincil kesi yapmak anlamına gelir. Ayrıca, bir şeyi forceps ile kavra...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
25 g custom falling rod	custom home made
30 mm PVC pipe	custom home made
Acetone	Sigma-Aldrich	67-64-1	Propanone
Axolotl (Ambystoma mexicanum)	Exoterra GmbH	N/A	12-22 cm and 10 g - 80 g, All strains (wildtype, melanoid, white, albino, transgenic white with GFP)
Benzocain	Sigma-Aldrich	94-09-7	ethyl 4-aminobenzoate
Electromaget	custom home made
Excel 2010	Microsoft	N/A	Excel 2010 or newer
ImageJ	National Institutes of Health		ImageJ 1.5e or newer. Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, https://imagej.nih.gov/ij/, 1997-2016.
Kimwipes
Microsurgical instruments	N/A	N/A	Forceps and scissors
MS550s	Fujifilm, Visualsonics	MS550s	40 MHz center frequency, transducer
MS700	Fujifilm, Visualsonics	MS700	50 MHz center frequency, transducer
Petri dish	any maker
Soft cloth	N/A	N/A	Any piece of soft cloth measuring approximately 70 x 55 cm2 e.g. a dish towel
Stereo microscope
Vevo 2100	Fujifilm, Visualsonics	Vevo 2100	High frequency ultrasound system