تحريض الصرع ما بعد الصدمة في نموذج الماوس من إصابات الدماغ المتكررة منتشر الصدمة

Summary

يصف هذا البروتوكول المنهجي نموذجًا جديدًا للصرع ما بعد الصدمة بعد إصابات الدماغ الخفيفة المتكررة. الجزء الأول تفاصيل خطوات لتحريض إصابات الدماغ الرضية باستخدام نموذج انخفاض الوزن المعدلة. ويقدم الجزء الثاني تعليمات بشأن النهج الجراحي لنظم الحصول على البيانات الكهروالدماغة أحادية ومتعددة القنوات.

Abstract

إصابة الدماغ الرضية (TBI) هي السبب الرئيسي للصرع المكتسب. يمكن أن يؤدي TBI إلى إصابة الدماغ البؤري أو المنتشر. الإصابة البؤرية هي نتيجة للقوى الميكانيكية المباشرة ، التي تخترق أحيانًا من خلال الجمجمة ، مما يخلق آفة مباشرة في أنسجة الدماغ. هذه مرئية أثناء تصوير الدماغ كمناطق مع كدمة, تمزق, ونزيف. الآفات البؤرية تحفز موت الخلايا العصبية وتشكيل ندبة الدبقية وهي موجودة في 20%-25% من جميع الأشخاص الذين يعانون من TBI. ومع ذلك ، في معظم حالات TBI ، تحدث الإصابة بسبب قوى التسارع وتسارع الأنسجة اللاحقة ، مما يؤدي إلى تلف غير بؤري ومنتشر. يستمر مرضى TBI في الإصابة بالصرع اللاحق للصدمة (PTE) بعد فترة الكمون من الأشهر أو السنوات. حاليا، فإنه من المستحيل التنبؤ المرضى الذين سوف تتطور PTE، والنوبات في المرضى PTE تشكل تحديا للسيطرة، مما يتطلب المزيد من البحوث. حتى وقت قريب، كان الحقل يقتصر على نموذجين فقط للحيوانات / القوارض مع نوبات ما بعد الصدمة التلقائية التي تم التحقق من صحتها ، وكلاهما يقدم آفات بؤرية كبيرة مع فقدان الأنسجة الهائل في القشرة وفي بعض الأحيان الهياكل تحت القشرية. وعلى النقيض من هذه النهج، تقرر أن الـ TBI المنتشر الناجم عن استخدام نموذج معدل لإسقاط الوزن يكفي للشروع في تطوير نوبات تشنجية عفوية وغير متشنجة، حتى في حالة عدم وجود آفات بؤرية أو فقدان الأنسجة. على غرار المرضى الذين يعانون من الصرع بعد الصدمة المكتسبة، يقدم هذا النموذج مع فترة الكمون بعد الإصابة قبل بداية النوبة. في هذا البروتوكول ، سيتم تزويد المجتمع بنموذج جديد للصرع ما بعد الصدمة ، وتفاصيل كيفية الحث على TBI غير الآفات المنتشر يليه مراقبة مستمرة طويلة الأجل للحيوانات الفيديوية الكهربية على مدار عدة أشهر. هذا البروتوكول سوف تفاصيل التعامل مع الحيوانات، وإجراءات انخفاض الوزن، ووضع القطب الكهربائي لاثنين من أنظمة الاستحواذ، والتحديات المتكررة التي تواجهها خلال كل من خطوات الجراحة، والرصد بعد الجراحة، والحصول على البيانات.

Introduction

كل عام يؤثر TBI ما يقدر بنحو 60 مليون شخص في جميع أنحاء العالم. الأفراد المتضررون هم أكثر عرضة للإصابة بالصرع، الذي يمكن أن يظهر بعد سنوات من الإصابة الأولية. على الرغم من أن TBIs شديدة ترتبط مع ارتفاع خطر الإصابة بالصرع، حتىTBI خفيفة يزيد من فرصة الفرد لتطوير الصرع^1،2،3،4. ويمكن تصنيف جميع مركبات ثلاثي بوتيل القصدير على أنها بؤرية أو منتشرأو مزيج من الاثنين معاً. إصابة الدماغ المنتشرة، الموجودة في العديد من TBIs إن لم يكن جميعها، هي نتيجة لأنسجة الدماغ ذات الكثافات المختلفة التي تقص ضد بعضها البعض بسبب تباطؤ التسارع وقوى الدوران. بحكم التعريف ، تحدث الإصابة المنتشرة فقط في عزلة في إصابة الدماغ الخفيفة / الارتجاج ية غير المخترقة ، حيث لا تظهر آفات الدماغ على التصوير المقطعي المحوسب^5.

هناك حاليا مشكلتين حرجتين في إدارة المرضى الذين لديهم، أو هم في خطر، تطوير الصرع ما بعد الصدمة (PTE). الأول هو أنه بمجرد أن يظهر PTE ، فإن النوبات مقاومة للأدوية المضادة للصرع المتاحة (AEDs)^6. ثانياً، لا تكون مضادات التغذية الإيبولية غير فعالة بنفس القدر في منع تكوين الصرع، ولا توجد طرق علاجية بديلة فعالة. من أجل معالجة هذا العجز وإيجاد أهداف علاجية أفضل والمرشحين للعلاج ، سيكون من الضروري استكشاف آليات خلوية وجزيئية جديدة في جذر PTE^6.

واحدة من السمات البارزة للصرع ما بعد الصدمة هي الفترة الكامنة بين الحدث الصادم الأولي وبداية النوبات التلقائية غير المبررة والمتكررة. الأحداث التي تحدث داخل هذه النافذة الزمنية هي التركيز الطبيعي للباحثين، لأن هذه النافذة الزمنية قد تسمح العلاج والوقاية من PTE تماما. النماذج الحيوانية هي الأكثر شيوعا ً لهذا البحث لأنها توفر العديد من الفوائد المتميزة ، وليس أقلها هو أن الرصد المستمر للمرضى البشريين سيكون غير عملي ومكلف على مدى فترات طويلة من الزمن. بالإضافة إلى ذلك ، لا يمكن استكشاف الآليات الخلوية والجزيئية في جذور الصرع إلا في النماذج الحيوانية.

ويفضل نماذج الحيوانات مع نوبات ما بعد الصدمة العفوية والصرع على النماذج التي يتم فيها الحث على المضبوطات بعد TBI بوسائل أقل ملاءمة من الناحية الفسيولوجية، مثل عن طريق الاضطرابات الكيميائية أو التحفيز الكهربائي بشكل حاد، مزمن، أو عن طريق التّوائي. تختبر نماذج النوبات اللاحقة للصدمة التلقائية كيفية تعديل TBI لشبكة الدماغ الصحية مما يؤدي إلى تكوين الصرع. الدراسات التي تستخدم التحفيز الإضافي بعد TBI تقييم كيفية التعرض لTBI يقلل من عتبة المضبوطات ويؤثر على التعرض للمضبوطات. مزايا النماذج الحيوانية مع المضبوطات الناجمة كيميائيا أو مع التحفيز الكهربائي هي في اختبار آليات محددة من الانكسار لAEDs وفعالية AEDs القائمة والرواية. ومع ذلك، فإن درجة أهمية هذه البيانات وترجمتها إلى البشر قد تكون غامضة⁷ بسبب ما يلي: 1) قد تختلف آليات الضبط عن تلك التي يسببها الـ TBI وحده؛ (2) قد تكون آليات الضبط ية مختلفة عن تلك التي يسببها الـ TBI وحده؛ (2) قد تكون آليات الضبط ية مختلفة عن تلك التي يسببها الـ TBI وحده؛ (2) قد تكون آليات الضبط ية مختلفة عن تلك التي يسببها الـ TBI وحده؛ (2) قد تكون آليات الضبط ية مختلفة عن تلك التي يسببها الـ TBI وحده؛ (2 2) ليس كل هذه النماذج تؤدي إلى نوبات عفوية⁷؛ 3) الآفات التي تم إنشاؤها بواسطة العامل المتشنج نفسه ، مع قنية المطلوبة لتسليمها ، أو عن طريق تحفيز وضع القطب في هياكل العمق (على سبيل المثال ، قرن آمون أو أميغدالا) يمكن أن يسبب بالفعل زيادة الحساسية للمضبوطات وحتى إمكانات حقل فرس النهر 7^. وعلاوة على ذلك، بعض العوامل المتشنجة (أي حمض الكاينك) تنتج آفات مباشرة فرس النهر والتصلب، وهو أمر غير نموذجي بعد TBI منتشر.

حتى وقت قريب ، لم يكن هناك سوى نموذجين للحيوانات من الصرع ما بعد الصدمة: التأثير القشري الخاضع للرقابة (CCI ، التنسيق) أو إصابة قرع السوائل (FPI ، البؤري والمنتشر)⁸. كلا النموذجين يؤدي إلى آفات بؤرية كبيرة جنبا إلى جنب مع فقدان الأنسجة، والنزيف، والدبقي في القوارض^8. تحاكي هذه النماذج الصرع ما بعد الصدمة الناجم عن الآفات البؤرية الكبيرة. أظهرت دراسة حديثة أن تكرار (3x) TBI منتشر يكفي لتطوير النوبات العفوية والصرع في الفئران حتى في حالة عدم وجود آفات بؤرية⁹، إضافة نموذج PTE القوارض الثالث مع المضبوطات المتكررة التلقائية المؤكدة. هذا النموذج الجديد يحاكي التغيرات الخلوية والجزيئية الناجمة عن TBI منتشر, أفضل تمثيل السكان مع السكان خفيفة, TBIs الارتجاج. في هذا النموذج، تسمح الفترة الكامنة التي تمتد لثلاثة أسابيع أو أكثر قبل بداية النوبة وظهور نوبات متكررة عفوية متأخرة بالتحقيق في الأسباب الجذرية لنشوء الصرع بعد الصدمة، واختبار فعالية النهج الوقائية والمرشحين العلاجيين الجدد بعد بداية النوبة، ولديها القدرة على تطوير علامات بيولوجية لنشوء الصرع بعد الصدمة لأن ما يقرب من نصف الحيوانات تتطور الصرع بعد الصدمة.

يعتمد اختيار النموذج الحيواني لدراسة الصرع ما بعد الصدمة على السؤال العلمي، ونوع إصابة الدماغ التي يتم التحقيق فيها، وما هي الأدوات التي سيتم استخدامها لتحديد الآليات الخلوية والجزيئية الأساسية. في نهاية المطاف ، يجب أن يظهر أي نموذج للصرع ما بعد الصدمة ظهور نوبات عفوية بعد TBI وفترة زمن وصول أولية في مجموعة فرعية من الحيوانات TBI ، لأنه ليس كل المرضى الذين يتحملون TBI يستمرون في تطوير الصرع. للقيام بذلك، يتم استخدام تخطيط كهربية الدماغ (EEG) مع اكتساب الفيديو في وقت واحد في هذا البروتوكول. إن فهم الجوانب التقنية وراء أجهزة ونهج الحصول على البيانات أمر بالغ الأهمية لتفسير البيانات بدقة. وتشمل الجوانب الهامة للأجهزة نوع نظام التسجيل، ونوع الأقطاب الكهربائية (الرصاص المسمار أو الأسلاك) والمواد التي مصنوعة منها، واكتساب الفيديو المتزامن (كجزء من نظام تخطيط كهربية الدماغ أو طرف ثالث)، وخصائص نظام الكمبيوتر. من الضروري وضع معلمات الاستحواذ المناسبة في أي نوع من النظام اعتمادًا على هدف الدراسة وأحداث تخطيط كهربية الدماغ ذات الأهمية وطريقة التحليل الإضافية واستدامة تخزين البيانات. وأخيراً، يجب النظر في طريقة تكوين القطب (المونتاج) ، لأن لكل منها مزايا وعيوب وستؤثر على تفسير البيانات.

هذا البروتوكول تفاصيل كيفية استخدام تعديل نموذج إسقاط الوزن مارمارو^10،11 للحث على إصابة منتشر مما أدى إلى عفوية، غير مبرر، والمضبوطات المتكررة في الفئران، ويصف النهج الجراحية للحصول على واحد ومتعددة القنوات المستمر، والفيديو المتزامن EEG باستخدام monopolar، ثنائي القطب، أو المونتاج المختلط.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

تم تنفيذ جميع الإجراءات الحيوانية الموصوفة في هذا البروتوكول وفقًا للجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها (IACUC) التابعة لفرجينيا تك ووفقًا لـ "دليل رعاية واستخدام الحيوانات المختبرية" للمعاهد الوطنية للصحة .

1- بروتوكول مناولة الحيوانات

ملاحظة: يهدف هذا البروتوكول إلى التعود على الحيوانات التي يتم طلبها من بائع إلى المرفق بعد الوصول وإلى تكييفها للتعامل معها من قبل المجرب. وهذا يحسن رفاهية الحيوان من خلال الحد من التوتر والقلق ويبسط بعض الإجراءات التي تتطلب التعامل مع الحيوانات، بما في ذلك حث TBI، والرصد بعد الجراحة، وربط الحيوان بنظام الاستحواذ.

1. عندما يتم تلقي العديد من الحيوانات من البائع، علامة الأذن وتعيينها عشوائيا إلى مجموعة تجريبية (TBI) أو مجموعة التحكم (جراحة صورية) في حين الجمع بينهما في أقفاص من 2-5 الحيوانات. منزل TBI الحيوانات بشكل منفصل عن الحيوانات الشام لأن الفئران الشام تتصرف أحيانا بقوة تجاه الفئران التي خضعت TBI.
2. اليوم الأول (24-48 ساعة بعد وضع علامات الأذن): إعداد مخطط لتسجيل علامات الأذن الحيوانية، وتاريخ الميلاد، وتواريخ المناولة، ووزن الحيوان في أيام المناولة، ومدة المناولة، وقسم للتعليقات والملاحظات.
3. كوب بلطف الحيوان باستخدام كلتا يديه. لا الاستيلاء على الحيوان من الذيل لأنه يحفز آليات الدفاع والاستجابة الإجهاد.
4. فحص وتسجيل علامة الأذن من الحيوان.
5. وضع الحيوان في الحاوية على مقياس الوزن وتسجيل الوزن.
6. كوب بلطف الحيوان بكلتا يديه مرة أخرى والتعامل معها لمدة 1 دقيقة، مما يسمح لها بالتحرك واستكشاف داخل اليدين. أداء هذا على مقاعد البدلاء في غرفة الإجراءات والحرص على عدم إسقاط الحيوان على الأرض.
7. بعد 1 دقيقة من المناولة، ضع الحيوان مرة أخرى في قفصه.
8. كرر الخطوات 1.3−1.7 للحيوانات الأخرى في القفص.
9. اليوم الثاني للمعالجة (اليوم التالي): كرر الخطوات 1.2−1.5.
10. بلطف كوب الحيوان بكلتا يديه مرة أخرى والتعامل معها لمدة 2 دقيقة، مما يسمح لها بالتحرك واستكشاف داخل اليدين. أداء هذا على مقاعد البدلاء في غرفة الإجراءات والحرص على عدم إسقاط الحيوان على الأرض.
11. بعد 2 دقيقة من التعامل مع, وضع الحيوان مرة أخرى في قفصه.
12. كرر الخطوات 1.10−1.11 للحيوانات الأخرى في القفص.
13. اليوم الثالث للمعالجة (اليوم التالي): كرر الخطوات 1.2−1.5.
14. كوب بلطف الحيوان بكلتا يديه مرة أخرى والتعامل معها لمدة 4 دقيقة، مما يسمح لها بالتحرك واستكشاف داخل اليدين. أداء هذا على مقاعد البدلاء في غرفة الإجراءات والحرص على عدم إسقاط الحيوان على الأرض.
15. بعد 4 دقيقة من المناولة، ضع الحيوان مرة أخرى في قفصه.
16. كرر الخطوات 1.14−1.15 للحيوانات الأخرى في القفص.
17. يوم المناولة 4 (يوم التحكم، أسبوع واحد من يوم المناولة 1): كرر الخطوات 1.2−1.5.
18. كوب بلطف الحيوان بكلتا يديه مرة أخرى والتعامل معها لمدة 4 دقيقة، مما يسمح لها بالتحرك واستكشاف داخل اليدين. أداء هذا على مقاعد البدلاء في غرفة الإجراءات والحرص على عدم إسقاط الحيوان على الأرض.
19. بعد 4 دقيقة التعامل مع, وضع الحيوان مرة أخرى في قفصه.
20. كرر الخطوات 1.18-1.19 للحيوانات الأخرى في القفص.
    ملاحظة: يوم التحكم معالجة اختبارات الاحتفاظ السلوك الهادئ بعد بروتوكول معالجة ثلاثة أيام.

2. إجراء إسقاط الوزن

1. وضع الماوس في غرفة التعريفي. تعيين تدفق الأكسجين والفراغ على حد سواء إلى 1 لتر / دقيقة ومستوى غاز الإيسوفلوران إلى 3٪ - 5٪. تهوّن الفأر ة لمدة 5 دقيقة.
2. إزالة الماوس من غرفة التعريفي ووضعه على وسادة رغوة. اختبار لعدم وجود استجابة لإصبع القدم أو الذيل قرصة.
3. إعطاء مسكن (0.1 ملغ /كغ البوبرينورفين) تحت الجلد. إذا تم إجراء جراحة تخطيط كهربية الدماغ في نفس اليوم، قم بإدارة البوبرينورفين تحت الجلد بالاقتران مع كاربروفين غير الستيرويدي المضاد للالتهابات (5 ملغ/كغ).
4. إدارة محلول لاكتات الصوديوم (3 ميكرولتر لكل غرام من وزن الحيوان) تحت الجلد قبل أو بعد الارتطام الأخير. يمكن خلط محلول لاكتات الصوديوم مع المسكنات للإدارة السريعة في حقنة واحدة.
   ملاحظة: يحتوي محلول لاكتات الصوديوم على خليط من كلوريد الصوديوم وكلوريد البوتاسيوم وكلوريد الكالسيوم ولاكتات الصوديوم في الماء. تساعد هذه الخطوة على استبدال السوائل والكهارل، مما يساعد على الشفاء.
5. ضع رأس الماوس تحت أنبوب إسقاط الوزن(الشكل 1A)ووضع قرص مسطح من الفولاذ المقاوم للصدأ (قطره 1.3 سم ، سمكه 1 مم ، ووزن 880 ملغ) في وسط الرأس ، بين خط العينين والأذنين.
   ملاحظة: ينشر هذا القرص التأثير عبر سطح الجمجمة(الشكل 1B).
6. قم بإزالة الدبوس في أنبوب إسقاط الوزن لإطلاق قضيب الوزن 100 جم من ارتفاع 50 سم. للحث على إصابة صورية للفئران التحكم، وإزالة قضيب الوزن من أنبوب لمنع الإفراج العرضي من دبوس وانخفاض الوزن.
   ملاحظة: يجب وضع رأس الحيوان مسطحًا ، بحيث يسقط القضيب مجانًا على سطح القرص بأكمله.
7. ضع الحيوان الفاقد الوعي على ظهره للتعافي على وسادة تدفئة مغطاة بمنشفة معقمة ماصة مبطنة. يمكن قياس وقت الاسترداد المنعكس الصحيح (أي الوقت الذي يستغرقه الماوس لتصحيح نفسه من ظهره) كقراءة للوقت الذي يقضيه فاقدالوعي.
8. عندما يستعيد الحيوان وعيه ، ضعها في قفص نظيف تم تسخينه على وسادة التدفئة ، مع هلام الاسترداد وعدد قليل من قطع الطعام المبللة لاسترداد لمدة 45 دقيقة. ارتفاع درجة حرارة الحيوان يمكن أن يثبت عقبة كبيرة أمام الانتعاش كما السماح للفأر لتصبح باردة جدا.
9. بعد 45 دقيقة، كرر الخطوات 2.1-2.8 مرتين، وحذف الخطوة 2.3 (أي إعطاء المسكنات والأدوية المضادة للالتهابات).
10. السماح للحيوانات بالتعافي لمدة 1-2 ساعة إذا تم إجراء جراحة زرع قطب EEG في نفس اليوم.

3. إعداد المجال الجراحي لزرع أقطاب تخطيط كهربية الدماغ

ملاحظة: الأوتوكلاف الأدوات الجراحية والبراغي قبل الجراحة. تنظيف القفازات الجراحية عن طريق الرش وفرك مع الإيثانول 70٪ قبل وبعد لمس الحيوان، والمواد غير المعقمة، وبين التعامل مع الحيوانات. قم بتعقيم الأدوات الجراحية لمدة 2-3 دقيقة في معقم المنبّه (انظر جدول المواد)بين الحيوانات. تغيير الستائر العقيمة قبل وضع الحيوان الجديد في جهاز stereotactic. تأكد من أن المجال الجراحي يحتوي على جميع المكونات اللازمة للجراحة(الشكل 2). عدم وجود إجراء جراحي الغازية للحث على TBI في هذا النموذج له عدة مزايا: 1) زرع الأقطاب الكهربائية مرنة ويمكن القيام به في نفس اليوم TBI أو بعد فترة زمنية محددة; 2) وقت استعادة الحيوان أسرع؛ 3) الجمجمة لا تزال سليمة، مما يسمح بمزيد من مساحة السطح والمرونة لزرع الأقطاب الكهربائية.

1. قم بتنويم الفأر في غاز الإيزوفران بنسبة 3% -5% في غرفة تعريفلمدة 5 دقيقة.
2. نقل الماوس من غرفة التعريفي إلى جهاز stereotactic ووضعه على الستائر المعقمة على وسادة التدفئة مع غاز الايسوفوران وأنابيب فراغ متصلة مخروط الأنف.
3. الحفاظ على درجة حرارة الجسم عند 37 درجة مئوية على مدار الجراحة. ضع مستشعر درجة الحرارة بحيث يتلامس مع جدار الصدر أو البطن للفأرة.
4. إصلاح رأس الحيوان في مكان باستخدام قضبان الأذن.
5. الحفاظ على التخدير عند 1.5٪ - 3.5٪ isoflurane أو في ~ 60 التنفس / دقيقة في الطائرة الجراحية (مع عدم الاستجابة لإصبع القدم أو قرصة الذيل).
6. تطبيق مرهم العين على عيون الحيوان للحفاظ على مشحم طوال الجراحة.
7. إعطاء خليط من المسكنات (0.1 ملغ / كغ البوبرينورفين) والمخدرات المضادة للالتهابات غير الستيرويدية (5 ملغ / كغ carprofen) في حقنة واحدة تحت الجلد إلا إذا تم تنفيذ TBI في وقت سابق من اليوم ، وفي هذه الحالة تلقى الحيوان بالفعل المسكنات ومضادات الالتهاب.
   ملاحظة: يجب أن تدار البوبرينورفين مرة أخرى إذا كان الوقت بين أول TBI وEEG جراحة وضع يتجاوز 8 ساعة أو إذا كان الحيوان يظهر علامات الألم 8 ساعة بعد الإدارة الأولى, ولكن ينبغي أن تعطى دون إضافة carprofen.
8. إدارة محلول لاكتات الصوديوم (3 ميكرولتر لكل غرام من وزن الحيوان) تحت الجلد لتحل محل السوائل والكهارل في الحيوان.
   ملاحظة: إذا تم إجراء عملية جراحية مباشرة بعد TBI، يجب أن يتم توقيت هذه الخطوة بشكل صحيح. يجب أن تدار محلول لاكتات الصوديوم كل 2 ساعة في حين يخضع الحيوان للإجراءات ومرة واحدة بعد الجراحة، 2 ساعة من الحقن السابق.
9. إزالة الشعر من فروة الرأس باستخدام كريم إزالة الشعر.
10. قبل إجراء الشق ، قم بتطهير جلد فروة الرأس بمحلول مطهر جراحي من povidone-iodine والإيثانول بنسبة 70٪ في مسحات متناوبة مع منصات شاش معقمة في حركة دائرية 3x (20 s لكل محلول في كل مرة).
11. باستخدام مشرط، وجعل شق rostral caudal على خط وسط فروة الرأس من فوق العينين إلى الجزء الخلفي من الرأس. يفضل هذا الأسلوب من فتح فروة الرأس على قطع فروة الرأس، كما يمكن أن تكون مختومة اللوحات الجلد أكثر أو حول غطاء تخطيط كهربية الدماغ توفير المزيد من الاستقرار.
    ملاحظة: عند إعداد الجمجمة لزرع الرأس 3-EEG، مطلوب قطع فروة الرأس، كما أن حجم الرأس لن تسمح لإغلاق اللوحات الجلد على الرأس.
12. توسيع منطقة شق عن طريق تطبيق hemostats صغيرة على حدود الجلد فتح. إذا حدث أي نزيف بعد الشق، قم بتنظيفه بشاش قطني معقم أو مسحة.
13. إزالة بلطف periosteum (أي الغشاء الرقيق على العظام القحفية) مع شفرة مشرط. إذا حدث أي نزيف خلال هذه الخطوة، اضغط على موقع النزيف مع مسحة قطنية معقمة حتى يتوقف.
14. استخدم مسحات قطنية معقمة لتنظيف الجمجمة باستخدام بيروكسيد الهيدروجين، ولكن تجنب لمس الأنسجة الرخوة المحيطة بالمنطقة القحفية المكشوفة. كرر هذه الخطوة حتى يتم تنظيف الجمجمة من أي أنسجة لينة ولها مظهر أبيض.
15. جفف الجمجمة بشاش معقم أو مسحة قطنية.
    ملاحظة: الخطوات 3.12−3.15 مهمة للتثبيت السليم للأقطاب الكهربائية وأسمنت الأسنان. يمكن لأي نسيج لين، ونزيف غير مكين، وحطام أن يسبب العدوى، والتثبيت غير المستقر لجبل الرأس، والإشارة المشوهة أو الغائبة، وفقدان الغرسة في غضون عدة أيام أو أسابيع بعد الجراحة.

4. وضع القطب الكهربائي

1. زرع EEG واحد (1EEG) قناة headmount.
   ملاحظة: تمثل الاختصارات في إحداثيات التجسم العلاقات المكانية وتحدد المسافة بالملليمترات من الهدف من البريجما في اتجاه معين على رأس الحيوان: الأمامي الخلفي (AP) والمتوسطة الجانبية (ML). لا ينطبق Dorsal-البطني في هذا البروتوكول لأن جميع الأقطاب الكهربائية توضع في الفضاء فوق الجافية بدلاً من بنية معينة داخل الدماغ (الشكل 3). فين + هو قطب كهربائي نشط وفين - هو القطب المرجعي لها.
   1. استخدم مثقابعالي السرعة مع بت فولاذي (0.5 مم، مستدير، 1/4 في.) عند حوالي 5000-6000 جولة في الدقيقة (دورة في الدقيقة) لإنشاء ستة ثقوب بور (ثلاثة لمسامير الاستقرار وثلاثة للأقطاب الكهربائية) باستخدام إحداثيات stereotactic المقدمة¹². للمسمارين الأماميين: AP = +1.5 مم، ML = ± 1.5 مم؛ للمسمار الخلفي واحد: AP = -5.2 مم، ML = -1.5 مم؛ للقطب الأرضي: AP = -5.2 مم، ML = +1.5 مم؛ لتسجيل الأقطاب: AP = -2.3 مم، ML = ± 2.7 مم، مع Vin+ إلى اليمين وفين- إلى اليسار.
   2. إضافة ثلاثة مسامير لتعزيز الاستقرار في مرحلة الرأس. باستخدام مفك البراغي، بدوره مسامير 1-1.5 x كل لتكون ثابتة ثابت في الجمجمة.
      ملاحظة: وضع مسامير أعمق سوف تلحق الضرر في الدماغ.
   3. أدخل حامل الرأس 1EEG في ذراع حامل مجسم ووضع الرأس بحيث تقع الأقطاب الثلاثة على طول خط الوسط القحفي. في هذا التكوين القطب الأرض وفتحة كل منها على رأس الرأس هو في الجزء الخلفي، والقطب Vin + في الوسط، والقطب فين في الجبهة. ويمكن إجراء علامة على الرأس مع علامة دائمة.
   4. ثني كل قطب كهربائي 90 درجة بحيث يتم ثني نهاية كل سلك إلى أسفل ويتم وضعها فوق ثقب البور المقابلة. ثم، قياس من 1 مم طول جزء من السلك الذي هو الآن عمودي على ثقب بور وتقليم الزائدة قبالة(الشكل 3). وهذا يضمن وضع فوق الجافية من الأقطاب الكهربائية. يجب أن تكون الأقطاب الكهربائية بالكاد تلمس سطح ماتر الدورة.
   5. خفض headmount وضبط جميع الأقطاب الثلاثة لتتناسب مع ثقب بور المعنية. للتسجيل فوق الجافية ، يجب وضع الأقطاب الكهربائية فوق أو بالكاد تلامس ماطر الجافية.
   6. إعداد الاسمنت الأسنان للتطبيق عن طريق خلط 1/2 مغرفة من مسحوق مع عدة قطرات من المذيبات. استخدام ملعقة خلط ويحرك حتى الخليط النهائي هو المعجون مثل، مبتذل ولكن مرن، وقاسية بما يكفي لتكثيف بشكل صحيح عند وضعها على الجمجمة الحيوان.
   7. تطبيق خليط الاسمنت الأسنان التي تغطي جميع مسامير والأقطاب الكهربائية والانتظار ~ 3-5 دقيقة لترسيخ ذلك. تأكد من عدم تغطية الرسال البلاستيكي بالأسمنت السني، لأنه سيجعل من المستحيل توصيل الحيوان بالجهاز الزائب بحبل.
   8. الافراج عن hemostats عقد اللوحات الجلد وإغلاق شق عن طريق ربط اللوحات الجلد حول الرماج البلاستيكية. تطبيق عدة قطرات من الأنسجة لاصقة (انظر جدول المواد)لختم اللوحات الجلد.
   9. تطبيق مطهر الكلورهيكسيدين إلى المنطقة المحيطة بالزرع لتجنب العدوى. إذا كان الحيوان تحت التخدير لمدة أطول من 2 ساعة بعد الحقن السابق من محلول لاكتات الصوديوم ، الذي يعطى أثناء تحريض TBI ، فأعد حقنة أخرى تحت الجلد. للحفاظ على الترطيب السليم للمستشفى، كرر الحقن كل 2 ساعة التي ينفقها الحيوان تحت التخدير.
   10. بعد الجراحة، وإعطاء الحقن النهائي من محلول لاكتات الصوديوم 2 ساعة بعد الحقن السابقة. إذا كانت الجراحة أقل من 2 ساعة طويلة, إدارة جرعة الانتعاش النهائي من محلول لاكتات الصوديوم 2 ساعة من الحقنة الأولى.
   11. إزالة الحيوان من جهاز stereotactic وقياس وزن الحيوان بعد جراحة تخطيط كهربية الدماغ كمرجع للرصد في المستقبل. بسبب الزرع ، سيكون وزن الحيوان أكبر مما كان عليه قبل الجراحة.
   12. وضع الحيوان في قفص نظيف على وسادة تدفئة دافئة للتعافي.
2. زرع اثنين من EEG وواحد EMG (2EEG/1EMG) قنوات الرأس.
   1. استخدام bregma كمعلم لوضع headmount. تطبيق كمية صغيرة من الأنسجة لاصقة (انظر جدول المواد)إلى الجانب السفلي من الرأس 2EEG/1EMG، وتجنب ثقوب المسمار الأربعة ووضع 2EEG/1EMG headmount على سطح الجمجمة.
      ملاحظة: لا توجد إحداثيات محددة لوضع هذا الرأس. يبلغ طول الرأس 8 مم وعرضه 5 مم، والذي يغطي معظم سطح الجمجمة. وضع headmount مع حافة أمامية له 3.0 مم الأمامي إلى bregma هو الأمثل ويوفر نوعية إشارة جيدة. وضع يدوي سريع ضروري قبل قطرة من العلاجات اللاصقة الأنسجة. السماح ما يقرب من 5 دقيقة للأنسجة الغراء لعلاج تماما.
   2. استخدام إبرة 23 G معقمة لخلق ثقوب التجريبية للمسامير من خلال الفتحات الأربعة في headmount. لتحقيق ذلك، دفع بلطف الإبرة وتدوير ببطء حتى طرف الإبرة تخترق الجمجمة دون الإضرار الدماغ. إزالة أي نزيف من الثقوب التجريبية باستخدام مسحة القطن المعقمة.
   3. إدراج 0.10 في مسامير في الثقوب التجريبية وتدويرها حتى يتم إصلاح كل في الجمجمة. هذا يمكن أن يصل إلى نصف طول المسمار، ولكن ليس طول كامل، لأن هذا من شأنه أن يضر ماتر دورا والقشرة. إذا تم وضع headmount بحيث يكون هناك فجوة بين سطح الجمجمة والطرف الخلفي من headmount استخدام اثنين 0.12 في مسامير في الجزء الخلفي.
   4. جعل فتحة صغيرة على جانبي الايبوكسي المكون من اثنين (الفضة الايبوكسي) الحقيبة التوأم حزمة. تأخذ ملعقة على الوجهين واستخدام كل جانب لغرف كمية صغيرة ومتساوية من كل مكون من الحقيبة ومزجها معا. استخدام كمية صغيرة فقط كافية لعملية جراحية واحدة، لأن الخليط يقوي في غضون 20 دقيقة. ختم الجانبين من الحقيبة لمنع التجفيف.
      ملاحظة: الفضة-الايبوكسي يسمح للاتصال الكهربائية السليم بين المسمار والرأس ويعزز استقرار مسامير.
   5. تطبيق كمية صغيرة من هذا الخليط بين ثقب المسمار والمسمار، ثم تشديد كل المسمار حتى تقع رأسه على قاعدة الزرع. تأكد من عدم وجود الفضة الايبوكسي هو إجراء اتصال بين مسامير اثنين لأن كل المسمار بمثابة قطب كهربائي الفردية، وضمان إشارة دقيقة، فإنه لا ينبغي إجراء اتصال مع المسمار الآخر.
   6. إذا كان خليط الفضة والايبوكسي في غير محله، وهناك عدد قليل من نافذة الوقت الثاني لمغرفة بعناية من الزائدة لفصل الاتصال. ينحني بعناية كل من EMG يؤدي من الحافة الخلفية لحامل الرأس لمتابعة كفاف رأس الحيوان ورقبته، ومن ثم إدراجها في العضلات nuchal.
   7. إعداد الاسمنت الأسنان للتطبيق عن طريق خلط 1/2 مغرفة من مسحوق مع عدة قطرات من المذيبات. استخدام ملعقة خلط ويحرك حتى الخليط النهائي هو المعجون مثل، مبتذل ولكن مرن، وقاسية بما يكفي لتكثيف بشكل صحيح عند وضعها على الجمجمة الحيوان.
   8. تطبيق خليط الاسمنت الأسنان التي تغطي headmount كامل مع تجنب تغطية الثقوب دبوس ستة، لأن هذا سيجعل من المستحيل لربط ما قبل مكبر للصوت. انتظر ~ 3-5 دقيقة لترسيخ الاسمنت. تأكد من أن الجلد غير مختومة إلى الرأس مع الاسمنت الأسنان.
   9. الافراج عن hemostats عقد اللوحات الجلد وإغلاق شق عن طريق ربط اللوحات الجلد حول الرماج البلاستيكية. تطبيق عدة قطرات من الأنسجة لاصقة لختم اللوحات الجلد.
      ملاحظة: إذا تم إجراء شق الجلد لفترة أطول للسماح لتقويم يؤدي سلك EMG، يمكن ختم الجلد مع الأنسجة لاصقة أو خياطة. ختم الجلد مع الأنسجة لاصقة عادة ما تكون كافية. ومع ذلك ، إذا لوحظ أثناء فتح مراقبة ما بعد الجراحة للشق ، يوصى بالغرز بدلاً من ذلك.
   10. تطبيق مطهر الكلورهيكسيدين إلى المنطقة المحيطة بالزرع لتجنب العدوى. إدارة محلول لاكتات الصوديوم (3 ميكرولتر لكل غرام من وزن الحيوان) تحت الجلد لتحل محل السوائل والكهارل إذا كان الحيوان تحت التخدير لمدة أطول من 2 ساعة بعد الحقن السابق.
   11. إزالة الحيوان من جهاز stereotactic وقياس وزن الحيوان بعد جراحة تخطيط كهربية الدماغ كمرجع للرصد في المستقبل. بسبب الزرع ، سيكون وزن الحيوان أكبر مما كان عليه قبل الجراحة.
   12. وضع الحيوان في قفص نظيف على وسادة التدفئة الدافئة، مع هلام الانتعاش وعدد قليل من قطع تشاو مبللة للانتعاش.
3. زرع ثلاث قنوات EEG (3EEG) headmount.
   1. استخدم الحفر عالي السرعة مع بت فولاذي (0.5 مم، مستدير، 1/4) عند 5000-6000 دورة في الدقيقة تقريبًا لإنشاء ستة ثقوب بور (ثلاثة لمسامير الثبات وثلاثة للأقطاب الكهربائية) باستخدام إحداثيات المجسمة المقدمة¹². بالنسبة للمرجع الأرضي والمشترك لـ EEG1 و EEG2: AP = 5.2 مم، ML = ± 1.5 مم؛ لEEG1 وEEG2: AP = -3.0 مم، ML = ± 3.0 مم؛ لEEG3 المستقلة: AP =-1.4 مم، ML = ± 1.5 مم.
   2. ضع الأقطاب المسمارية الستة في ثقوب البور.
      ملاحظة: وضع مسامير أعمق سيخلق ضررا كبيرا للدماغ. توفر أقطاب المسمار استقرارًا أفضل لحامل الرأس.
   3. إعداد الاسمنت الأسنان للتطبيق عن طريق خلط 1/2 مغرفة من مسحوق مع عدة قطرات من المذيبات. استخدام ملعقة خلط ويحرك حتى الخليط النهائي هو المعجون مثل، مبتذل ولكن مرن، وقاسية بما يكفي لتكثيف بشكل صحيح عند وضعها على الجمجمة الحيوان.
   4. تطبيق خليط الاسمنت الأسنان التي تغطي كامل السطح المكشوف من الجمجمة وكل القطب المسمار. تأكد من أن الجلد غير مختومة إلى الرأس مع الاسمنت الأسنان. انتظر ~ 1-2 دقيقة للأسمنت لترسيخ أقل ما يقال. ليست هناك حاجة للانتظار حتى التصلب الكامل قبل الانتقال إلى الخطوة التالية.
   5. بدوره على لحام الحديد لتسخينه. ضع حامل الرأس 3EEG في ذراع حامل مجسم.
      ملاحظة: ضع حامل الرأس بحيث تتطابق مواضع الرصاص السلكية الستة مع موضع خيوط الأسلاك لكل قطب كهربائي.
   6. خفض headmount بحيث يقع الجزء البطني على رأس الاسمنت الأسنان.
   7. تحريف السلك من كل الرصاص من كل من أقطاب المسمار مع الرصاص الأسلاك المقابلة من headmount.
      ملاحظة: سيؤدي التواء الأسلاك الخاطئة إلى جعل تفسير البيانات معقدًا أو مستحيلًا.
   8. تقليم بعناية السلك الزائد قبالة باستخدام مقص. لحام كل زوج الملتوية من الأسلاك لالتوصيل إشارة السليم.
      ملاحظة: يجب أن كل زوج من الأسلاك إجراء اتصال مع زوج آخر، وإلا سيتم اختراق جودة الإشارة وتفسير البيانات.
   9. ثني كل زوج ملحوم من الأسلاك يؤدي حول headmount، وتجنب الاتصال بين كل زوج.
      ملاحظة: إذا لم يتم قطع الأسلاك يؤدي قصيرة بما فيه الكفاية يمكن أن يكون من الصعب ثني لهم حول headmount دون لمس سلك آخر. في هذه الحالة، ثني زوج واحد أولاً، وتغطية ذلك مع خليط الاسمنت الأسنان، والانتظار ~ 1-2 دقيقة لترسيخ، ثم المضي قدما مع الزوج التالي في نفس الطريقة.
   10. الانتهاء من تغطية جميع الأسلاك مع الاسمنت الأسنان ترك فقط الجزء الأسود من headmount يتعرض.
       ملاحظة: يجب الحرص على عدم تطبيق أي مسحوق أسمنت الأسنان أو خليط إلى الجزء العلوي من الجزء المكشوف من headmount كما أي حطام أو الأسمنت في الثقوب سوف تمنع الاتصال وسوف يؤدي إما إلى غياب إشارة أو الضوضاء.
   11. الافراج عن hemostats عقد اللوحات الجلد. تطبيق مطهر الكلورهيكسيدين إلى المنطقة المحيطة بالزرع لتجنب العدوى.
   12. إدارة محلول لاكتات الصوديوم (3 ميكرولتر لكل غرام من وزن الحيوان) تحت الجلد لاستبدال السوائل والكهارل إذا كان الحيوان تحت التخدير لمدة أطول من 2 ساعة بعد الحقن السابق.
   13. إزالة الحيوان من جهاز stereotactic وقياس وزن الحيوان بعد جراحة تخطيط كهربية الدماغ كمرجع للرصد في المستقبل. بسبب الزرع ، سيكون وزن الحيوان أكبر مما كان عليه قبل الجراحة.
   14. وضع الحيوان في قفص نظيف على وسادة التدفئة الدافئة، مع هلام الانتعاش وعدد قليل من قطع تشاو مبللة للانتعاش.
       ملاحظة: يساعد بيروكسيد الهيدروجين في إزالة أي أنسجة لينة متبقية من الجمجمة.

5. ربط الحيوانات بنظام الاستحواذ

1. كأس الحيوان بكلتا يديه لإزالته من قفص الاستحواذ ونقله إلى منطقة نظيفة مع سطح مستو، مثل محطة نقل الحيوانات (ATS).
2. الاستيلاء بلطف الماوس من الجلد من ظهرها. لا تمسك الحيوان من الذيل ، لأن هذا يسبب الضيق.
3. تحديد الفتحة في headmount EEG المقابلة للقطب الأرضي وتطابق دبوس كل من الحبل للاتصال السليم.
   ملاحظة: سيؤدي الاتصال العكسي للحبل من المنازج إلى حامل الرأس الحيواني إلى قراءة مختلفة عن الأقطاب الكهربائية والأشكال الموجية المشوهة المحتملة.
4. أعد الحيوان إلى قفص الاستحواذ وقم بتوصيل الطرف الآخر من الحبل (نظام EEG 1) أو مكبر الصوت المسبق (نظام EEG 2) بالتنقل.
   ملاحظة: عند توصيل مكبر الصوت قبل (نظام تخطيط كهربية الدماغ 2) إلى الحبل من التنقل، تطابق العلامات البيضاء على طرفي كلا الحبال. الاتصال العكسي سيؤدي إلى ضرر دائم للمكبر ويتطلب إصلاحات من قبل الشركة المصنعة ، والتي هي مكلفة.
5. تدوير بلطف الحبل الذي يربط الحيوان إلى التنقل لضمان آلية يعمل بشكل صحيح والحيوان يمكن أن تتحرك بحرية.

6. إعدادات الحصول على بيانات EEG

1. تعيين معلمات الاستحواذ على نظام EEG 1.
   1. تعيين معدل أخذ العينات إلى 500 هرتز؛ كسب 5000؛ وضع القاعدة 35 هرتز؛ LPN قبالة. تعيين مرشح تمرير عالية إلى 0.5 هرتز.
      ملاحظة: 100 هرتز (تمرير منخفض) مضمنة ولا تتطلب إدخال يدوي.
2. تعيين معلمات الاستحواذ على نظام EEG 2.
   1. تعيين معدل أخذ العينات إلى 600 هرتز؛ preamp كسب 100؛ كسب 1 (EEG1, 2). تعيين مرشح تمرير منخفض إلى 100 هرتز.
      ملاحظة: 1 هرتز (تمرير ة عالية) مضمنة ولا تتطلب إدخال يدوي.

7. إعدادات الحصول على بيانات الفيديو

1. تعيين معلمات الاستحواذ لنظام EEG 1.
   ملاحظة: هناك حاجة إلى نظام اقتناء الفيديو طرف ثالث للحصول على بيانات الفيديو في وقت واحد.
   1. حدد معدل الإطار بين 15 (الحد الأدنى الموصى به) و30 (الحد الأقصى المتاح) لجودة الفيديو المناسبة. تعيين الدقة إلى 640 × 640 بكسل. تعيين نوع الضغط إلى H.264H.
2. تعيين معلمات الاستحواذ لنظام EEG 2.
   ملاحظة: يوفر نظام EEG هذا نظام فيديو وبرنامجًا يتزامن انفًا بيانات الفيديو وEEG معًا في ملف واحد لمدة تصل إلى أربعة أنواع من الحيوانات (انظر جدول المواد).
   1. حدد معدل الإطار بين 15 (الحد الأدنى الموصى به) و30 (الحد الأقصى المتاح) لجودة الفيديو المناسبة. تعيين الدقة إلى 640 × 480 بكسل. تعيين نوع الضغط إلى تنسيق ملف WebM.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

يصف البروتوكول المبين هنا طريقة تحريض الإصابة المنتشرة في العزل (على سبيل المثال ، في حالة عدم وجود آفة بؤرية) باستخدام نموذج الماوس من TBI المنتشر المتكرر(الشكل 1). يصور الشكل 1A جهاز إسقاط الوزن ومكوناته(الشكل 1A, a1−a5)المستخ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

وعلى النقيض من نماذج CCI وFPI التي تحفز إما البؤري أو الجمع بين الإصابة البؤرية والمنتشرة ، فإن نموذج TBI المنتشر المتكرر الموصوف في هذا البروتوكول يسمح بتحريض الإصابة المنتشرة في غياب إصابة الدماغ البؤرية ولا يتطلب فتحات فروة الرأس أو الجمجمة والالتهاب المرتبط بها. فائدة إضافية من عدم وجود ج...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.10" screw	Pinnacle Technology Inc., KS, USA	8209	0.10 inch long stainless steel
0.10" screw	Pinnacle Technology Inc., KS, USA	8403	0.10 inch long with pre-soldered wire lead
0.12" screw	Pinnacle Technology Inc., KS, USA	8212	0.12 inch long stainless steel
1EEG headmount	Invitro1 (subsidiary of Plastics One), VA, USA	MS333/8-A/SPC	3 individually Teflon-insulated platinum iridium wire electrodes (twisted or untwisted, 0.005 inch diameter) extending below threaded plastic pedestal
2EEG/1EMG headmount	Pinnacle Technology Inc., KS, USA	8201	2EEG/1EMG channels
3% hydrogen peroxide			Pharmacy
3EEG headmount	Pinnacle Technology Inc., KS, USA	8235-SM-C	custom 6-Pin Connector for 3EEG channels
Buprenorphine	Par Pharmaceuticals, Cos. Inc., Spring Valley, NY, USA	060969
Buprenorphine	Par Pharmaceuticals, Cos. Inc., Spring Valley, NY, USA	060969
C57BL/6 mice	Harlan/Envigo Laboratories Inc		male, 12-16 weeks old
C57BL/6 mice	The Jackson Laboratory		male, 12-16 weeks old
Carprofen	Zoetis Services LLC, Parsippany, NJ, USA	026357	NOTE: this drug is added during weight drop only if stereotactic electrode implantation will be performed on the same day
Chlorhexidine antiseptic			Pharmacy
Dental cement and solvent kit	Stoelting Co., USA	51459
Drill	Foredom	HP4-917
Drill bit	Meisinger USA, LLC, USA	HM1-005-HP	0.5 mm, Round, 1/4, Steel
Dry sterilizer	Cellpoint Scientific, USA		Germinator 500
EEG System 1	Biopac Systems, CA, USA
EEG System 2	Pinnacle Technology Inc., KS, USA
Ethanol ≥70%	VWR, USA	71001-652	KOPTEC USP, Biotechnology Grade (140 Proof)
Eye ointment	Pro Labs Ltd, USA		Puralube Vet Ointment Sterile Ocular Lubricant available in general online stores and pharmacies
Fluriso liquid for inhalation anesthesia	MWI Veterinary Supply Co., USA	502017
Hair removal product	Church & Dwight Co., Inc., USA		Nair cream
Isoflurane	MWI Veterinary Supply Co., USA	502017
Povidone-iodine surgical solution	Purdue Products, USA	004677	Betadine
Rimadyl/Carprofen	Zoetis Services LLC, Parsippany, NJ, USA	026357
Solder			Harware store
Soldering iron	Weller, USA	WP35	ST7 tip, 0.8mm
Stainless steel disc			Custom made
Sterile cotton swabs
Sterile gauze pads	Fisher Scientific, USA	22362178
Sterile poly-lined absorbent towels pads	Cardinal Health, USA	3520
Tissue adhesive	3M Animal Care Products, USA	1469SB