反復性びまん性外傷性脳損傷のマウスモデルにおける心的外傷後てんかんの誘導

要約

この体系的なプロトコルは、反復的な軽度の外傷性脳損傷後の心的外傷後てんかんの新しい動物モデルを記述する。最初の部分は、変更された体重減少モデルを使用して外傷性脳損傷誘導のためのステップを詳述する。第2部では、単一および多チャンネルの脳波データ集録システムの外科的アプローチについて説明します。

要約

外傷性脳損傷(TBI)は、後天性てんかんの主な原因である。TBI は、焦点またはびまん性脳損傷を引き起こす可能性があります。焦点損傷は、時には頭蓋骨を貫通する直接的な機械的力の結果であり、脳組織に直接病変を引き起こした。これらは、脳イメージング中に、連続、裂傷、出血を伴う領域として見られます。焦点病変は神経死およびグリア瘢痕形成を誘発し、TBIを発生させる全ての人々の20%−25%に存在する。しかし、TBIの大部分の場合、傷害は加速減速力とその後の組織剪断によって引き起こされ、非焦点的、拡散性損傷をもたらす。TBI患者の亜集団は、数ヶ月または数年の待ち時間の後に心的外傷後てんかん(PTE)を発症し続けている。現在、どの患者がPTEを発症するかを予測することは不可能であり、PTE患者の発作は制御に困難であり、さらなる研究が必要です。最近まで、この分野は、検証された自発的な心的外傷後発作を有する2つの動物/げっ歯類モデルに限定され、両方とも皮質および時には皮質下構造における大規模な組織喪失を有する大きな焦点病変を呈した。これらのアプローチとは対照的に、変性体重減少モデルを用いて誘導されたびまん性TBIは、焦点性病変または組織喪失がない場合でも、自発的痙攣性および非けいれん発作の発症を開始するのに十分であると判断された。後天性心的外傷後てんかんを有するヒト患者と同様に、このモデルは発作発症前の傷害後の待ち時間を呈する。このプロトコルでは、コミュニティに心的外傷後てんかんの新しいモデルが提供され、数ヶ月の間に拡散性非病変TBIを誘導し、続いて数ヶ月にわたって継続的な長期的なビデオ脳波動物モニタリングを誘導する方法を詳述する。このプロトコルは、動物の取り扱い、重量低下手順、2つの集録システムの電極配置、および手術、術後モニタリング、およびデータ取得の各ステップで頻繁に遭遇する課題について詳述します。

概要

TBIは毎年、世界中で推定6,000万人に影響を与えています。影響を受けた個人はてんかんを発症するリスクが高く、最初の怪我の数年後に現れる可能性があります。重篤なTBIはてんかんのリスクが高いと関連していますが、軽度のTBIでさえ、てんかん^{1、2、3、4}を発症する可能性が高くなります。すべての TBE は、フォーカル、ディフューズ、またはその両方の組み合わせに分類できます。びまん性脳損傷は、多くのTbIではないにしても多くの中に存在し、加速減速および回転力のために互いに異なる密度の脳組織の結果である。定義上、びまん性傷害は軽度/脳震盪性非貫通性脳損傷において孤立してしか起こらず、コンピュータ断層撮影スキャン⁵では脳病変は見えない。

現在、心的外傷後てんかん(PTE)を発症している患者の管理には2つの重大な問題があります。1つ目は、PTEが現れると、発作は利用可能な抗てんかん薬(AED)6に耐性があることです^。第二に、AEはてんかんの予防に等しく効果がなく、効果的な代替治療アプローチはありません。この赤字に対処し、より良い治療標的と治療の候補を見つけるためには、PTE⁶の根本にある新しい細胞および分子メカニズムを探求する必要があります。

心的外傷後てんかんの顕著な特徴の1つは、最初の外傷性事象と自発的で挑発的な再発発作の発症との間の潜伏期間である。この時間枠はPTEの治療と予防を完全に可能にする可能性があるため、この時間ウィンドウ内で発生するイベントは、研究者にとって自然な焦点です。動物モデルは、いくつかの明確な利点を提供するため、この研究に最も一般的に使用されています, 少なくとも、人間の患者の継続的な監視は、このような潜在的に長い時間をかけて非現実的かつ高価であろうということです.さらに、てんかんの根本にある細胞および分子のメカニズムは、動物モデルでのみ探索することができます。

自発的な心的外傷後発作およびてんかんを有する動物モデルは、ケモコンブチル剤または電気刺激などによってTBIの後に発作が誘発されるモデルよりも好ましい。例えば、ケモコンブルサンスまたは電気刺激によって、急性、慢性、または親切によって。自発的な心的外傷後発作モデルは、TBIがてんかんを引き起こす健康な脳ネットワークをどのように変更するかをテストする。TBI後の追加刺激を用いた研究は、TBIへの暴露が発作閾値を減少させ、発作に対する感受性に影響を与える方法を評価する。化学的または電気刺激によって誘発された発作を伴う動物モデルの利点は、AEDに対する屈折性の特定のメカニズムと既存および新規のAEDの有効性をテストすることである。しかし、これらのデータのヒトへの関連性および翻訳の程度は、^{以下の理由}で7があいまいであり得る:1)発作機構はTBI単独で誘発されるものとは異なり得る。2)これらのモデルのすべてが自発的な発作につながるわけではありません⁷;3)痙攣剤自体によって生じる病変は、その送達に必要なカニューレを有する、または深層構造(例えば、海馬または扁桃体)での電極配置を刺激することによって、すでに発作感受性の増加を引き起こし得る可能性があり、さらには海馬てんかん場電位^7。さらに、いくつかの痙攣剤(すなわち、カイエン酸)は、直接海馬病変および硬化性を産生し、これは拡散TBI後に典型的ではない。

最近まで、心的外傷後てんかんの2つの動物モデルのみが存在していた:制御された皮質衝撃(CCI、焦点)または流体打楽器損傷(FPI、焦点およびびまん性^)8。両方のモデルは、げっ歯類⁸の組織損失、出血、およびグリオシスと並んで大きな焦点病変をもたらす。これらのモデルは、大きな焦点病変によって誘発される心的外傷後てんかんを模倣する。最近の研究では、繰り返し(3x)びまん性TBIが、マウスに対する自発的発作およびてんかんの発症に十分であることを示した^9は、自発再発性発作が確認された第3のげっ歯類PTEモデルを加える。この新しいモデルは、拡散TBIによって引き起こされる細胞および分子の変化を模倣し、軽度の脳震盪性TBIを有するヒト集団をよりよく表す。このモデルでは、発作発症前3週間以上の潜伏期間と後期の自発的な再発発作の出現は、心的外傷後てんかん発生の根本的な原因を調査し、発作発症後の予防アプローチおよび新しい治療候補の有効性をテストすることを可能にし、約半数の動物が心的外傷後てんかんを発症するため、心的外傷後てんかんのバイオマーカーの発症の可能性を有する。

心的外傷後てんかんの研究のための動物モデルの選択は、科学的な質問、調査された脳損傷の種類、および基礎となる細胞および分子メカニズムを決定するためにどのようなツールを使用するかに依存する。最終的には、心的外傷後てんかんのモデルは、TBI後の自発的発作の出現とTBI動物のサブセットにおける初期遅延期間の両方を実証しなければならない。これを行うために、このプロトコルでは、同時ビデオ集録を伴う脳波(EEG)が使用されます。データ収集ハードウェアとアプローチの背後にある技術的側面を理解することは、正確なデータ解釈のために重要です。重要なハードウェアの側面には、記録システムの種類、電極の種類(ねじまたはワイヤリード)と材料、同期ビデオ集録(EEGシステムまたはサードパーティの一部として)、およびコンピュータシステムの特性が含まれます。研究目標、対象のEEGイベント、さらなる分析方法、データストレージの持続可能性に応じて、あらゆるタイプのシステムに適切な取得パラメータを設定することが不可欠です。最後に、電極構成(モンタージュ)の方法は、それぞれ長所と短所があり、データ解釈に影響を与えるので、考慮する必要があります。

このプロトコルは、変更されたMarmarou重量降下モデル^10、11を使用して、マウスにおける自発的、挑発されない再発性発作をもたらすびまん性傷害を誘発する方法を詳述し、単一および多チャンネル連続、および単一級、バイポーラ、または混合モンタージュを使用してビデオEEGを同期させる外科的アプローチを記述する。

プロトコル

このプロトコルに記載されているすべての動物手順は、バージニア工科大学の施設動物管理および使用委員会(IACUC)に従い、国立衛生研究所の「実験動物のケアと使用のためのガイド」に準拠して行われました。.

1. 動物の取り扱いプロトコル

注:このプロトコルは、到着後にベンダーから施設に注文した動物を習慣化し、実験者によって処理されることを条件とすることを目的としています。これは、ストレスや不安を軽減することにより、動物の幸福を向上させ、TBIを誘導する、術後の監視、および取得システムに動物を接続するなど、動物を処理する必要がある特定の手順を簡素化します。

1. 多くの動物がベンダーから受け取られ、2〜5匹の動物のケージでそれらを組み合わせながら、実験グループ(TBI)または対照群(シャム手術)にランダムに割り当てます。シャムマウスは時折TBIを受けたマウスに対して積極的に行動するので、ハウスTBI動物は偽の動物とは別に。
2. 取り扱い日1(耳タグの後24-48時間):動物の耳のタグ、生年月日、取扱日、取り扱い日の動物の体重、取り扱いの期間、コメントと観察のためのセクションを記録するためのチャートを準備します。
3. 両手を使って動物をやさしくカップに入れ。防御機構やストレス応答を誘発するので、尾で動物をつかまないでください。
4. 動物の耳札を確認し、記録します。
5. 重量スケールの容器に動物を置き、重量を記録します。
6. もう一度両手で動物をそっとカップし、1分間扱い、手の中を動かして探索できるようにします。手順室のベンチでこれを実行し、床に動物を落とさなくなるように注意してください。
7. 取り扱いの1分後、動物をケージに戻します。
8. ケージ内の他の動物に対して、ステップ 1.3-1.7 を繰り返します。
9. 処理日 2 日目(翌日): 手順 1.2-1.5 を繰り返します。
10. もう一度両手で動物をそっとカップし、2分間扱い、手の中を動かして探索できるようにします。手順室のベンチでこれを実行し、床に動物を落とさなくなるように注意してください。
11. 取り扱いの2分後、動物をケージに戻します。
12. ケージ内の他の動物に対して、ステップ 1.10-1.11 を繰り返します。
13. 処理日 3 日目(翌日): 手順 1.2-1.5 を繰り返します。
14. もう一度両手で動物をそっとカップし、それを4分間扱い、手の中で動いて探検できるようにします。手順室のベンチでこれを実行し、床に動物を落とさなくなるように注意してください。
15. 取り扱いの4分後、そのケージに戻って動物を配置します。
16. ケージ内の他の動物に対して、ステップ 1.14-1.15 を繰り返します。
17. 4 日目の処理(制御日、1 日目から 1 週間):手順 1.2-1.5 を繰り返します。
18. もう一度両手で動物をそっとカップし、それを4分間扱い、手の中で動いて探検できるようにします。手順室のベンチでこれを実行し、床に動物を落とさなくなるように注意してください。
19. 4分の取り扱いの後、そのケージに戻って動物を配置します。
20. ケージ内の他の動物に対して、ステップ 1.18-1.19 を繰り返します。
    注: コントロール処理日は、3 日間の処理プロトコルの後に、落ち着いた動作の保持をテストします。

2. 重量の減少手順

1. マウスを誘導室に置きます。酸素と真空の流れを1 L/分に、イソフルランガスのレベルを3%~5%に設定します。マウスを5分間麻酔します。
2. 誘導室からマウスを取り出し、泡パッドの上に置きます。つま先または尾のピンチに対する応答がないかどうかテストします。
3. 皮下に鎮痛薬(0.1mg/kgブプレノルフィン)を投与する。脳体手術が同じ日に行われる場合は、非ステロイド性抗炎症カルプロフェン(5mg/kg)と組み合わせてブプレノルフィンを皮下投与する。
4. 最後の衝撃の前後に皮下に乳酸ナトリウム溶液(動物の体重のグラム当たり3μL)を投与する。乳酸ナトリウム溶液は、単一の注射で迅速な投与のために鎮痛薬と混合することができる。
   注:乳酸ナトリウム溶液には、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、および乳酸ナトリウムの混合物が含まれています。このステップは、回復を助ける流体および電解質を交換するのに役立ちます。
5. マウスの頭部をウェイトドロップチューブ(図1A)の下に置き、眼と耳の線の間の頭の中央に平らなステンレス製のディスク(直径1.3cm、厚さ1mm、880mgの重量)を置きます。
   注: このディスクは、頭蓋骨の表面に衝撃を拡散します(図1B)。
6. 重量滴下チューブのピンを取り外し、高さ50cmから100gの重量ロッドを放します。コントロールマウスの恥の傷害を誘発するために、ピンの誤って放出および重量低下を防ぐためにチューブから重量ロッドを取り外す。
   メモ:ロッドがディスクの表面全体に自由に落ちるように、動物の頭は平らに配置する必要があります。
7. 無菌ポリライン吸収タオルで覆われたヒーターパッドの上に回復のために背中に無意識の動物を置きます。右反射回復時間(つまり、マウスが背中から右にかかる時間)は、無意識に費やされた時間の読み出しとして測定することができます。
8. 動物が意識を取り戻したら、ヒーティングパッドに温めたきれいなケージに入れ、回復ゲルといくつかの湿ったチャウピースを45分間回復させます。動物を過熱させることは、マウスが寒くなりすぎるのと同じくらい回復の大きな障害であることが証明できます。
9. 45分後、ステップ2.1-2.8を2回繰り返し、ステップ2.3(すなわち、鎮痛薬および抗炎症薬の投与)を省略します。
10. 脳電電極注入手術が同じ日に行われる場合、動物が1〜2時間回復できるようにします。

3. 脳電電極の移植のための外科場の準備

メモ:手術前に、手術用の工具とネジをオートクレーブします。動物に触れる前と触れた後、70%エタノールでスプレーしてこすり、動物を取り扱う間に外科用手袋をきれいにしてください。動物間のビーズ滅菌装置(資料表を参照)で2-3分間の外科用具を殺菌します。新しい動物を立体装置に入れる前に、滅菌ドレープを交換してください。手術フィールドに手術に必要なすべてのコンポーネントが含まれていることを確認します (図 2)。このモデルでTBIを誘導する侵襲的な外科的処置の欠如は、いくつかの利点を有する:1)電極の移植は柔軟であり、TBIと同じ日または定義された期間後に行うことができる。2)動物の回復時間が速い;3)頭蓋骨はそのまま残り、電極を埋め込むためより多くの表面積と柔軟性を可能にする。

1. マウスを3%-5%イソフルランガスで5分間誘導室に麻酔します。
2. マウスを誘導室から定位装置に移し、鼻コーンに接続されたイソフルランガスと真空管を備えた加熱パッド上の無菌ドレープの上に置きます。
3. 手術の間、体温を37°Cに保ちます。マウスの胸壁や腹壁に接触するように温度センサーを設置します。
4. 耳棒を使って動物の頭を所定の位置に固定します。
5. 麻酔を1.5%~3.5%のイソファフルランまたは外科手術面で60回/分程度に保つ(つま先や尾のピンチに反応しない)。
6. 動物の目に目の軟膏を塗り、手術中に潤滑状態を保ちます。
7. 鎮痛薬(0.1 mg/kgブプレノルフィン)と非ステロイド性抗炎症薬(5 mg/kg carprofen)の混合物を、TBIが日中早く行われない限り、皮下注射で投与し、その場合、動物はすでに鎮痛薬および抗炎症薬を受けている。
   注:ブプレノルフィンは、最初のTBIと脳腺配置手術の間の時間が8時間を超える場合、または動物が最初の投与後に8時間の痛みの兆候を表示する場合は再び投与する必要がありますが、カルプロフェンを添加せずに与えられるべきです。
8. 乳酸ナトリウム溶液(動物の体重のグラム当たり3μL)を皮下に投与し、動物の液体および電解質を置換する。
   注: TBI の直後に手術を行う場合、このステップは適切にタイミングを合う必要があります。乳酸ナトリウム溶液は、動物が処置を受けている間、2時間ごとに投与されるべきであり、手術後に1回、前の注射から2時間投与されるべきである。
9. 脱毛クリームを使用して頭皮から毛髪を取り除きます。
10. 切開を行う前に、ポリドンヨウ素外科用消毒液と70%エタノールを回りの動き3倍(1回につき20秒)の滅菌ガーゼパッドで交互に頭皮の皮膚を消毒する。
11. メスを使用して、目のすぐ上から頭の後ろまで、頭皮の正中線にロストラル・コーダル切開を行います。頭皮の開口部のこの方法は、皮膚のフラップがより安定性を提供するEEGキャップの上または周りに密封することができるので、頭皮を切断するよりも好ましいです。
    注:3-EEGヘッドマウントの埋め込み用に頭蓋骨を準備する場合、ヘッドマウントのサイズはヘッドマウント上の皮膚フラップの閉鎖を可能にしませんので、頭皮を切断する必要があります。
12. 開いた皮膚の境界に小さな止まり紙を適用することにより切開の領域を拡大します。切開後に出血が起こった場合は、無菌綿ガーゼまたは綿棒で洗浄する。
13. 頭皮の刃で骨膜(すなわち、頭蓋骨の上の薄い膜)を静かに取り除きます。このステップで出血が起こった場合は、止まるまで無菌綿棒で出血部位を押してください。
14. 滅菌綿棒を使用して過酸化水素で頭蓋骨をきれいにしますが、露出した頭蓋骨領域を取り巻く軟部組織に触れないようにしてください。このステップを繰り返して、任意の軟部組織から頭蓋骨を洗浄し、白っぽい外観を持つ。
15. 頭蓋骨を滅菌ガーゼまたは綿棒で乾燥させます。
    注:ステップ3.12-3.15は電極および歯科セメントの適切な固定のために重要である。軟部組織、非焼灼出血、および破片は、手術後数日または数週間以内に感染、不安定なヘッドマウント固定、歪んだまたは不在の信号、およびインプラントの喪失を引き起こす可能性がある。

4. 電極の配置

1. 単一のEEG(1EEG)チャネルのヘッドマウントを埋め込む。
   注: 定位座標の略語は空間的な関係を表し、動物の頭部の所定の方向(前-後方(AP)および内側側方(ML)におけるブレグマからのターゲットの距離をミリメートル単位で指定します。すべての電極は脳内の特定の構造ではなく硬膜外空間に配置されるため、このプロトコルでは下側腹側は適用できません(図 3).Vin+はアクティブな電極であり、Vin-はその参照電極です。
   1. スチールビット(0.5 mm、ラウンド、1/4インチ)を1分あたり約5,000~6,000ラウンド(rpm)で高速ドリルで使用し、付属の定位座標¹²を使用して6つのバリ穴(安定性ネジ用3個、電極用3個)を作成します。2 本の前ねじの場合:AP = +1.5 mm、ML = ±1.5 mm;1 つの後ねじの場合: AP = -5.2 mm、ML = -1.5 mm;接地電極の場合:AP = -5.2 mm、ML = +1.5 mm;記録電極の場合:AP = -2.3 mm、ML = ±2.7 mm、Vin+を右に、Vin-を左にします。
   2. ヘッドステージの安定性を高めるには、3本のねじを追加します。ドライバーを使用して、ネジを1-1.5 xずつ回して、クラニウムに安定して固定します。
      注意:ねじを深く配置すると、脳に損傷を与えます。
   3. 1EEGヘッドマウントを定位ホルダーアームに挿入し、3つの電極が頭蓋正線に沿って配置されるようにヘッドマウントを配置します。この構成では、ヘッドマウントの上部にある接地電極とそれぞれの開口部が背面にあり、中央にVin+電極、前面にVin-電極が配置されています。ヘッドマウントには、永久的なマーカーでマークを付けることができます。
   4. 各電極を90°曲げて、各線の端部が下方に曲げ、対応するバリ穴の上に位置するようにする。次に、バー穴に垂直になったワイヤの部分の長さ1mmを測定し、余分な部分をトリムします(図3)。これにより、電極の硬膜外配置が保証されます。電極は、硬膜表面にほとんど触れる必要があります。
   5. ヘッドマウントを下げ、3つの電極すべてを調整してそれぞれのバリ穴に合わせます。硬膜外記録のために、電極は、上に置くか、またはかろうじて硬膜に触れる必要があります。
   6. 数滴の溶剤と粉末の1/2スクープを混合することにより、適用のための歯科セメントを準備します。混合ヘラを使用し、最後の混合物がパテ状、粘着性が可鍛性であり、動物の頭蓋骨に置かれたときに適切に凝縮されるほど硬くなるまでかき混ぜます。
   7. すべてのネジと電極を覆う歯科用セメント混合物を適用し、それが固化するために〜3-5分待ちます。それはテザーで通勤者に動物を接続することが不可能になりますので、歯科セメントでプラスチックの台座をカバーしないようにしてください。
   8. 皮膚のフラップを保持している止血を解除し、プラスチック台座の周りの皮膚フラップを接続することにより切開を閉じます。皮膚のフラップを密封するために組織接着剤(材料の表を参照)の数滴を適用します。
   9. 感染を避けるために、インプラントの周りにクロルヘキシジンの消毒剤を塗布します。TBI誘導の間に与えられた乳酸ナトリウム溶液の前の注入後に2時間以上麻酔下にある場合、動物は皮下に別の注射を投与する。動物の適切な水分補給を維持するために、動物が麻酔下で過ごす2時間ごとに注射を繰り返す。
   10. 手術後、前の注射後2時間の乳酸ナトリウム溶液の最終注射を与える。手術が2時間未満の場合、最初の注射から2時間の乳酸ナトリウム溶液の最終回収用量を投与する。
   11. 定位装置から動物を取り出し、脳機能手術後の動物の体重を将来のモニタリングの基準として測定する。インプラントのため、動物の体重は手術前よりも大きくなります。
   12. 回復のために暖かい加熱パッドの上にきれいなケージに動物を置きます。
2. 2つのEEGおよび1つのEMG(2EEG/1EMG)チャネルのヘッドマウントを埋め込む。
   1. ブレグマをヘッドマウントの配置のランドマークとして使用します。2EEG/1EMG ヘッドマウントの下部に少量のティッシュ接着剤(材料表を参照)を適用し、4 つのねじ穴を避け、2EEG/1EMG ヘッドマウントを頭蓋骨の表面に置きます。
      注: このヘッドマウントの配置に特定の座標はありません。ヘッドマウントは長さ8mm、幅5mmで、頭蓋面の大部分をカバーしています。ヘッドマウントのフロントエッジを持つ位置は、ブレグマに対して3.0 mm前部に最適であり、良好な信号品質を提供します。組織接着剤の治療のドロップ前に迅速な手動配置が必要です。完全に治すために組織の接着剤のために約5分を与えます。
   2. 無菌の23 G針を使用して、ヘッドマウントの4つの開口部を通してねじのパイロット穴を作成します。これを達成するには、針を軽く押し、針の先端が脳を傷つけることなく頭蓋骨に突き刺さるまでゆっくりと回転させる。無菌綿棒を使用してパイロット穴から出血を除去します。
   3. パイロット穴に0.10をネジで挿入し、それぞれが頭蓋骨に固定されるまで回転させます。これは、デュラマーと皮質を損傷するので、ネジ長の半分までですが、完全な長さではありません。ヘッドマウントが位置付けられている場合は、後部のネジで 2 つの 0.12 を使用して、頭蓋の表面とヘッドマウントの後端の間にギャップがあります。
   4. 2成分エポキシ(銀エポキシ)ツインパックポーチの側面に小さな開口部を作ります。両面ヘラを取り、ポーチから各成分の小さくて等しい量をすくい、それらを一緒に混ぜるために両側を使用します。混合物が20分以内に固まるので、単一の手術のために十分な少量を使用してください。
      メモ:銀エポキシはねじとヘッドマウント間の適切な電気接触を可能にし、ねじの安定性を高める。
   5. スクリューヘッドとスクリューホールの間に少量のこの混合物を適用し、その頭がインプラントのベースに置かれるまで各ネジを締めます。各ねじが個々の電極として機能するため、2つのネジの間に銀エポキシが接触していないことを確認し、正確な信号を確保するために、他のネジと接触しないようにしてください。
   6. 銀エポキシ混合物が見当違いであった場合、接続を分離するために余分なものを慎重にすくい取るためにいくつかの第二の時間枠があります。慎重に両方のEMGリードをヘッドマウントの後縁から曲げて、動物の頭と首の輪郭に従い、それらをヌーカルの筋肉に挿入します。
   7. 数滴の溶剤と粉末の1/2スクープを混合することにより、適用のための歯科セメントを準備します。混合ヘラを使用し、最後の混合物がパテ状、粘着性が可鍛性であり、動物の頭蓋骨に置かれたときに適切に凝縮されるほど硬くなるまでかき混ぜます。
   8. これはプリアンプを接続することが不可能になりますように、6ピン穴をカバーすることを避けながら、ヘッドマウント全体をカバーする歯科セメント混合物を適用します。セメントが固化するまで~3~5分待ちます。歯科用セメントで皮膚がヘッドマウントに密封されていないか確認してください。
   9. 皮膚のフラップを保持している止血を解除し、プラスチック台座の周りの皮膚フラップを接続することにより切開を閉じます。皮膚のフラップを密封するためにティッシュ接着剤の数滴を適用します。
      注:EMG線の導線の矯正を可能にするために皮膚切開が長くなった場合、皮膚は組織接着剤で密封されるか、または縫合することができる。組織接着剤で皮膚を密封することは、通常十分である。しかし、手術後のモニタリング中に切開口が観察される場合は、代わりに縫合が推奨される。
   10. 感染を避けるために、インプラントの周りにクロルヘキシジンの消毒剤を塗布します。前の注射後2時間より長く麻酔下にある場合は、液体および電解質を置換するために皮下に乳酸ナトリウム溶液(動物の体重のグラム当たり3μL)を投与する。
   11. 定位装置から動物を取り出し、脳機能手術後の動物の体重を将来のモニタリングの基準として測定する。インプラントのため、動物の体重は手術前よりも大きくなります。
   12. 回復ジェルといくつかの湿ったチャウピースで、暖かい加熱パッドの上にきれいなケージに動物を置きます。
3. 3つのEEGチャネル(3EEG)ヘッドマウントを埋め込みます。
   1. 5,000~6,000 rpmの約5,000~6,000 rpmのスチールビット(0.5mm、ラウンド、1/4)の高速ドリルを使用して、指定された定位座標¹²を使用して6つのバリ穴(安定性ネジ用3つ、電極用に3つ)を作成します。EEG1 および EEG2 のグラウンドおよび共通のリファレンスの場合: AP = 5.2 mm、ML = ±1.5 mm;EEG1 および EEG2 の場合: AP = -3.0 mm、ML = ±3.0 mm;独立した EEG3 の場合: AP =-1.4 mm、ML = ±1.5 mm。
   2. 6本のネジ電極をバリ穴に入れる。
      注:ねじを深く配置すると、脳に大きなダメージを与えます。スクリュー電極はヘッドマウントの安定性を向上させます。
   3. 数滴の溶剤と粉末の1/2スクープを混合することにより、適用のための歯科セメントを準備します。混合ヘラを使用し、最後の混合物がパテ状、粘着性が可鍛性であり、動物の頭蓋骨に置かれたときに適切に凝縮されるほど硬くなるまでかき混ぜます。
   4. 頭蓋骨の表面全体と各スクリュー電極を覆う歯科用セメント混合物を適用します。歯科用セメントでヘッドマウントに皮膚が密封されないようにしてください。セメントが弱く固化するまで~1~2分待ちます。次のステップに進む前に、完全に固化するまで待つ必要はありません。
   5. はんだ付けアイロンを入して加熱します。3EEGヘッドマウントを定位ホルダーアームに装着します。
      メモ:6本のリード位置が各スクリュー電極のワイヤリードの位置と一致するようにヘッドマウントを配置します。
   6. 腹側部分が歯科用セメントの上に置かるようにヘッドマウントを下げます。
   7. 各ねじ電極から各リードのワイヤを、ヘッドマウントの対応するワイヤリードでねじります。
      注: 間違った配線リードをツイストすると、データの解釈が複雑になるか不可能になります。
   8. ハサミを使用して余分なワイヤーを慎重にトリミングします。適切な信号伝導のためにワイヤーの各ねじれたペアをはんだ付け。
      注: 各ワイヤペアは別のペアと接触する必要があり、それ以外の場合は信号の品質とデータの解釈が損なわれます。
   9. ヘッドマウントの周りにワイヤーリードの各はんだ付けされたペアを曲げ、各ペア間の接触を避けます。
      注: ワイヤのリード線が短くトリムされていない場合は、別のワイヤに触れずにヘッドマウントの周りでワイヤを曲げることが困難な場合があります。この場合は、最初に1組を曲げ、歯科用セメント混合物で覆い、〜1〜2分待って固めてから、次のペアを同じ方法で進めます。
   10. ヘッドマウントの黒い部分だけを露出したまま、歯科用セメントですべてのワイヤーを覆い仕上げ。
       注:ヘッドマウントの露出部分の上部に歯科用セメント粉末または混合物を塗布しないように注意してください。
   11. 皮膚のフラップを保持している止まっている人を解放します。感染を避けるために、インプラントの周りにクロルヘキシジンの消毒剤を塗布します。
   12. 前の注射後2時間より長く麻酔を受けている場合は、乳酸ナトリウム溶液(動物の体重のグラム当たり3μL)を皮下に投与し、液体および電解質を置換する。
   13. 定位装置から動物を取り出し、脳機能手術後の動物の体重を将来のモニタリングの基準として測定する。インプラントのため、動物の体重は手術前よりも大きくなります。
   14. 回復ジェルといくつかの湿ったチャウピースで、暖かい加熱パッドの上にきれいなケージに動物を置きます。
       注:過酸化水素は、残りの軟部組織を頭蓋骨から取り除くのに役立ちます。

5. 動物を取得システムに接続する

1. 両手で動物をカップに入れて取得ケージから取り出し、動物移動ステーション(ATS)のような平らな表面を持つ清潔な領域に移します。
2. 背中の皮でマウスを軽くつかみます。これは苦痛を引き起こすので、尾で動物をつかむなないでください。
3. 接地電極に対応するEEGヘッドマウントの開口部を特定し、適切な接続のためにテザーのそれぞれのピンと一致させます。
   メモ:インターマターから動物のヘッドマウントへのテザーの逆接続は、電極とは異なる読み取りおよび潜在的に歪んだ波形になります。
4. 動物を集録ケージに戻し、テザー(EEGシステム1)またはプリアンプ(EEGシステム2)の他端を通勤器に接続します。
   メモ:プリアンプ(EEGシステム2)をコンミュータからテザーに接続する場合は、両方のテザーの端にある白いマークと一致させます。リバース接続は、アンプの永久的な損傷をもたらし、高価であるメーカーによる修理が必要になります。
5. 動物を通勤器に接続するテザーをそっと回転させて、機構が正しく機能し、動物が自由に動くことができるようにします。

6. EEG データ取得設定

1. EEG システム 1 の取得パラメータを設定します。
   1. サンプリングレートを500 Hzに設定します。5,000を得る。モードノルム35 Hz;LPN オフ。0.5 Hzにハイパスフィルタを設定します。
      メモ:100Hz(ローパス)は内蔵されており、手動入力は必要ありません。
2. EEG システム 2 の取得パラメータを設定します。
   1. サンプリングレートを600 Hzに設定します。プリアンプゲイン100。ゲイン 1 (EEG1,2)ローパスフィルタを100Hzに設定します。
      メモ:1Hz(ハイパス)は内蔵されており、手動入力は必要ありません。

7. ビデオデータ取得設定

1. EEG システム 1 の取得パラメータを設定します。
   メモ:同時ビデオデータを取得するには、サードパーティのビデオ収集システムが必要です。
   1. 適切なビデオ品質を得る場合は、フレーム レートを 15 (最小推奨) から 30 (最大使用可能) に設定します。解像度を 640 x 640 ピクセルに設定します。圧縮の種類を H.264H に設定します。
2. EEG システム 2 の取得パラメータを設定します。
   注:このEEGシステムは、ビデオシステムとビデオとEEGデータを一緒に4匹までの動物のための単一のファイルに同期するソフトウェアを提供しています(資料の表を参照)。
   1. 適切なビデオ品質を得る場合は、フレーム レートを 15 (最小推奨) から 30 (最大使用可能) に設定します。解像度を 640 x 480 ピクセルに設定します。圧縮の種類を WebM ファイル形式に設定します。

結果

ここで概説するプロトコルは、反復拡散TBIのマウスモデルを用いて、単独で拡散傷害を誘導する方法(例えば、焦点病変がない場合)を説明する(図1)。図 1Aは、このモデルで TBI の誘導に使用されるウェイト ドロップ デバイスとそのコンポーネント (図 1A、 a1-a5)と、手順中の重要なステップ (

ディスカッション

焦点と拡散傷害のどちらを誘発するCCIおよびFPIモデルとは対照的に、このプロトコルで説明されている反復的な拡散TBIのモデルは、焦点脳損傷の不在時にびまん性傷害の誘発を可能にし、頭皮または頭蓋の開口部および関連する炎症を必要としない。このモデルにおける難解切除がないことの付加的な利点は、慢性的な連続脳波記録のための電極を埋め込むだけでなく、ShandraとRobel 20191に記?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.10" screw	Pinnacle Technology Inc., KS, USA	8209	0.10 inch long stainless steel
0.10" screw	Pinnacle Technology Inc., KS, USA	8403	0.10 inch long with pre-soldered wire lead
0.12" screw	Pinnacle Technology Inc., KS, USA	8212	0.12 inch long stainless steel
1EEG headmount	Invitro1 (subsidiary of Plastics One), VA, USA	MS333/8-A/SPC	3 individually Teflon-insulated platinum iridium wire electrodes (twisted or untwisted, 0.005 inch diameter) extending below threaded plastic pedestal
2EEG/1EMG headmount	Pinnacle Technology Inc., KS, USA	8201	2EEG/1EMG channels
3% hydrogen peroxide			Pharmacy
3EEG headmount	Pinnacle Technology Inc., KS, USA	8235-SM-C	custom 6-Pin Connector for 3EEG channels
Buprenorphine	Par Pharmaceuticals, Cos. Inc., Spring Valley, NY, USA	060969
Buprenorphine	Par Pharmaceuticals, Cos. Inc., Spring Valley, NY, USA	060969
C57BL/6 mice	Harlan/Envigo Laboratories Inc		male, 12-16 weeks old
C57BL/6 mice	The Jackson Laboratory		male, 12-16 weeks old
Carprofen	Zoetis Services LLC, Parsippany, NJ, USA	026357	NOTE: this drug is added during weight drop only if stereotactic electrode implantation will be performed on the same day
Chlorhexidine antiseptic			Pharmacy
Dental cement and solvent kit	Stoelting Co., USA	51459
Drill	Foredom	HP4-917
Drill bit	Meisinger USA, LLC, USA	HM1-005-HP	0.5 mm, Round, 1/4, Steel
Dry sterilizer	Cellpoint Scientific, USA		Germinator 500
EEG System 1	Biopac Systems, CA, USA
EEG System 2	Pinnacle Technology Inc., KS, USA
Ethanol ≥70%	VWR, USA	71001-652	KOPTEC USP, Biotechnology Grade (140 Proof)
Eye ointment	Pro Labs Ltd, USA		Puralube Vet Ointment Sterile Ocular Lubricant available in general online stores and pharmacies
Fluriso liquid for inhalation anesthesia	MWI Veterinary Supply Co., USA	502017
Hair removal product	Church & Dwight Co., Inc., USA		Nair cream
Isoflurane	MWI Veterinary Supply Co., USA	502017
Povidone-iodine surgical solution	Purdue Products, USA	004677	Betadine
Rimadyl/Carprofen	Zoetis Services LLC, Parsippany, NJ, USA	026357
Solder			Harware store
Soldering iron	Weller, USA	WP35	ST7 tip, 0.8mm
Stainless steel disc			Custom made
Sterile cotton swabs
Sterile gauze pads	Fisher Scientific, USA	22362178
Sterile poly-lined absorbent towels pads	Cardinal Health, USA	3520
Tissue adhesive	3M Animal Care Products, USA	1469SB