Tekrarlayan Diffüz Travmatik Beyin Hasarının Fare Modelinde Travma Sonrası Epilepsi Nin İndüklemesi

Özet

Bu sistematik protokol tekrarlayan hafif travmatik beyin hasarı sonrası travma sonrası epilepsi yeni bir hayvan modeli açıklar. İlk bölüm değiştirilmiş bir kilo damla modeli kullanarak travmatik beyin hasarı indüksiyon için adımlar ayrıntıları. İkinci bölümde tek ve çok kanallı elektroensefalografik veri toplama sistemleri için cerrahi yaklaşım hakkında talimatlar verilmektedir.

Özet

Travmatik beyin hasarı (TBI) edinsel epilepsi lerin önde gelen nedenidir. TBI bir odak veya yaygın beyin hasarına neden olabilir. Fokal yaralanma doğrudan mekanik güçlerin bir sonucudur, bazen kafatası ile nüfuz, beyin dokusunda doğrudan bir lezyon oluşturma. Bunlar beyin görüntüleme sırasında kontüzyon, yırtılma ve kanama olan alanlar olarak görülebilir. Fokal lezyonlar nöronal ölüme ve glial skar oluşumuna neden olur ve TBI geçiren tüm kişilerin %20−%25'inde bulunur. Ancak, TBI olguların çoğunda, yaralanma ivme-yavaşlama kuvvetleri ve sonraki doku kesme neden olur, nonfocal, diffüz hasar ile sonuçlanan. TBI hastalarının bir alt popülasyonu aylar veya yıllar süren bir gecikme döneminden sonra travma sonrası epilepsi (PTE) gelişmeye devam etmektedir. Şu anda hangi hastaların PTE gelişeceğini tahmin etmek mümkün değildir ve PTE hastalarındaki nöbetler kontrol etmek zordur ve bu da daha fazla araştırma gerektirmektedir. Yakın zamana kadar, alan doğrulanmış spontan post-travmatik nöbetler ile sadece iki hayvan / kemirgen modelleri ile sınırlıydı, her ikisi de korteks ve bazen subkortikal yapılarda büyük doku kaybı ile büyük fokal lezyonlar ile mevcut. Bu yaklaşımların aksine, modifiye ağırlık düşürme modeli kullanılarak indüklenen diffüz TBI'nin fokal lezyonlar veya doku kaybı olmamasında bile spontan konvülsif ve konvülsif olmayan nöbetlerin gelişimini başlatmak için yeterli olduğu saptanmıştır. Edinsel travma sonrası epilepsisi olan insan hastalarına benzer şekilde, bu model de nöbet başlamadan önce yaralanma dan sonra bir gecikme dönemi ile ortaya konmaktadır. Bu protokolde, topluma, birkaç ay boyunca sürekli uzun süreli video-elektroensefalografik hayvan takibinin ardından diffüz non-lezyonel TBI'yi nasıl tetikleyeceği ayrıntılı olarak anlatan yeni bir travma sonrası epilepsi modeli sağlanacaktır. Bu protokol, hayvan işleme, kilo düşürme prosedürü, iki satın alma sistemi için elektrot yerleştirme ve cerrahi, postoperatif izleme ve veri toplama adımlarının her birinde karşılaşılan sık karşılaşılan zorlukları ayrıntılı olarak ele alacaktır.

Giriş

Her yıl TBI dünya çapında yaklaşık 60 milyon kişiyi etkilemektedir. Etkilenen bireyler epilepsi gelişme riski daha yüksektir, hangi ilk yaralanma yıl sonra tezahür edebilir. Şiddetli Tüberküloz epilepsi riski ile ilişkili olmasına rağmen, hatta hafif TBI epilepsi gelişmekte olan bir bireyin şansını artırır^1,2,3,4. Tüm Tüberküloz fokal, diffüz veya her ikisinin kombinasyonu olarak sınıflandırılabilir. Diffüz beyin hasarı, birçok değilse tüm Tüberküloz mevcut, farklı yoğunluklarda hızlanma-yavaşlama ve dönme kuvvetleri nedeniyle birbirlerine karşı kesme beyin dokularının bir sonucudur. Tanım olarak, diffüz yaralanma sadece hafif / beyin sarsıntısı olmayan penetran beyin hasarı, hangi hiçbir beyin lezyonları bilgisayarlı tomografi taramaları görünür izole oluşur⁵.

Travma sonrası epilepsi (PTE) gelişen veya risk altında olan hastaların yönetiminde şu anda iki kritik sorun bulunmaktadır. Birincisi, PTE ortaya çıktıktan sonra, nöbetler mevcut anti-epileptik ilaçlara (AED)dirençli 6. İkinci olarak, AED'ler epileptogenezi önlemede eşit derecede etkisizdir ve etkili bir alternatif tedavi yaklaşımı yoktur. Bu açığı gidermek ve tedavi için daha iyi terapötik hedefler ve adaylar bulmak için, PTE⁶kökünde yeni hücresel ve moleküler mekanizmaları keşfetmek için gerekli olacaktır.

Travma sonrası epilepsinin en belirgin özelliklerinden biri ilk travmatik olay ile spontan, sebepsiz, tekrarlayan nöbetlerin başlangıcı arasındaki gizli dönemdir. Bu zamansal pencere içinde meydana gelen olaylar araştırmacılar için doğal bir odak vardır, Bu zaman penceresi tedavi ve PTE önlenmesi tamamen izin verebilir çünkü. Hayvan modelleri bu araştırma için en yaygın olarak kullanılır, çünkü birçok farklı fayda sunarlar, en azından insan hastalarının sürekli izlenmesi nin bu kadar uzun zaman dilimlerinde hem pratik ve maliyetli olacağıdır. Ayrıca, epileptogenez kökündeki hücresel ve moleküler mekanizmalar sadece hayvan modellerinde incelenebilir.

Spontan post-travmatik nöbetler ve epilepsi olan hayvan modelleri, kemokonvülzanlar veya elektrik stimülasyonları gibi daha az fizyolojik olarak alakalı yollarla TBI sonrası nöbetlerin indüklendiği modellere göre tercih edilir. Spontan travma sonrası nöbet modelleri, TBI'nin epileptogeneze yol açan sağlıklı beyin ağını nasıl değiştirip değiştirip değiştirip test etti. TBI sonrası ek stimülasyon kullanılarak yapılan çalışmalar, TBI'ye maruz kalmanın nöbet eşiğini nasıl azalttığını ve nöbetlere yatkınlığı nasıl etkilediğini değerlendirmeye değerbilmektedir. Kimyasal olarak veya elektrik stimülasyonuna neden olan elegeçirmelerle hayvan modellerinin avantajları, refraktörlülük mekanizmalarını AED'lere ve mevcut ve yeni AED'lerin etkinliğini test etmededir. Ancak, bu verilerin insanlara uygunluk derecesi ve çevirisi şu nedenlerden dolayı belirsiz^{olabilir 7:} 1) nöbet mekanizmaları sadece TBI tarafından indüklenenlerden farklı olabilir; 2) bu modellerin hepsi spontan nöbetlere yol açmaz⁷; 3) konvülzan ajan kendisi tarafından oluşturulan lezyonlar, onun teslimi için gerekli kanül ile, ya da derinlemesine yapılarda elektrot yerleşimi uyarıcı tarafından (örneğin, hipokampus veya amigdala) zaten artan nöbet yatkınlık ve hatta hipokampal epileptiform alan potansiyelleri neden olabilir⁷. Ayrıca, bazı konvülzan ajanlar (yani, kainik asit) doğrudan hipokampal lezyonlar ve skleroz üretmek, diffüz TBI sonra tipik değildir.

Yakın zamana kadar, post-travmatik epilepsi sadece iki hayvan modelleri vardı: kontrollü kortikal etki (CCI, fokal) veya sıvı perküsyon yaralanması (FPI, fokal ve diffüz)⁸. Her iki model de doku kaybı, kanama ve kemirgenlerdegliozis ile birlikte büyük fokal lezyonlar alabilmektedir 8 . Bu modeller büyük fokal lezyonların neden olduğu travma sonrası epilepsiyi taklit etmektedir. Yakın zamanda yapılan bir çalışmada, tekrarlanan (3x) diffüz TBI'nin farelerde spontan nöbetve epilepsi gelişimi için yeterli olduğunu göstermiştir^9,doğrulanmış spontan tekrarlayan nöbetler ile üçüncü bir kemirgen PTE modeli eklenmiştir. Bu yeni model, diffüz TBI tarafından indüklenen hücresel ve moleküler değişiklikleri taklit eder, daha iyi hafif ile insan nüfusunu temsil, sarsıntılı TBiile. Bu modelde, nöbet başlangıcından önce üç hafta veya daha fazla gizli süre ve geç ortaya çıkması, spontan, tekrarlayan nöbetler post-travmatik epileptogenezin kök nedenlerini araştırmaya, nöbet başlangıcından sonra önleyici yaklaşımların ve yeni terapötik adayların etkinliğini test etmeye ve travma sonrası epileptogenez biyobelirteçlerinin gelişimi için potansiyele sahiptir, çünkü hayvanların yaklaşık yarısı travma sonrası epilepsi gelişir.

Travma sonrası epilepsi çalışmaları için hayvan modeliseçimi bilimsel soruya bağlıdır, araştırılan beyin hasarının türü, ve altta yatan hücresel ve moleküler mekanizmaları belirlemek için hangi araçların kullanılacağı. Sonuç olarak, travma sonrası epilepsi herhangi bir model tbi hayvanların bir alt kümesinde spontan nöbetler ve ilk gecikme dönemi hem ortaya çıkması göstermek gerekir, bir TBI tabi tüm hastalar epilepsi geliştirmek için gitmek çünkü. Bunun için bu protokolde eşzamanlı video edinimi ile elektroensefalografi (EEG) kullanılmaktadır. Veri toplama donanımı ve yaklaşımlarının arkasındaki teknik yönleri anlamak, doğru veri yorumlanması için çok önemlidir. Kritik donanım yönleri kayıt sisteminin türü, elektrotların türü (vida veya tel kurşun) ve bunların yapıldığı malzeme, senkronize video edinimi (EEG sisteminin bir parçası veya üçüncü taraf olarak) ve bilgisayar sisteminin özelliklerini içerir. Çalışma hedefine, EEG ilgi olaylarına, daha fazla analiz yöntemine ve veri depolamanın sürdürülebilirliğine bağlı olarak her türlü sistemde uygun kazanım parametrelerinin ayarlanması zorunludur. Son olarak, elektrot yapılandırma (montaj) yöntemi göz önünde bulundurulmalıdır, her biri avantajları ve dezavantajları vardır ve veri yorumlanmasını etkileyecektir.

Bu protokol, modifiye Marmarou ağırlık düşürme modeli^10,11 farelerde spontan, sebepsiz, tekrarlayan nöbetler ile sonuçlanan diffüz yaralanmaneden nasıl kullanılacağını ayrıntıları, tek ve çok kanallı sürekli elde etmek için cerrahi yaklaşımlar açıklar, ve senkronize video EEG monopolar kullanarak, bipolar, veya karışık montaj.

Protokol

Bu protokolde tanımlanan tüm hayvan prosedürleri Virginia Tech Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) uyarınca ve Ulusal Sağlık Enstitüleri'nin 'Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Rehberi' uyarınca gerçekleştirilmiştir. .

1. Hayvan taşıma protokolü

NOT: Bu protokol, varıştan sonra satıcıdan tesise sipariş edilen hayvanları alışkanlık haline getirmek ve deneyci tarafından ele alınmalarını şartlandırmak için tasarlanmıştır. Bu stres ve anksiyete azaltarak hayvan refahını artırır ve TBI, post-operatif izleme indükleme ve satın alma sistemine hayvan bağlayan dahil olmak üzere hayvanların işleme gerektiren bazı prosedürleri kolaylaştırır.

1. Birçok hayvan satıcıdan alındığı zaman, kulak etiketi ve rastgele bir deney grubu (TBI) veya kontrol grubu (sahte cerrahi) onları 2−5 hayvan kafesleri birleştirerek onları atamak. Sahte fareler bazen TBI yapılan farelere karşı agresif davranırlar çünkü Ev TBI hayvanlar ayrı sahte hayvanlardan.
2. 1. gün (kulak etiketlemeden sonra 24−48 saat): Hayvan kulak etiketlerini, doğum tarihini, kullanım günlerini, kullanım günlerindeki hayvan ağırlığını, kullanım süresini ve yorum ve gözlemler için bir bölüm kaydetmeleri için bir grafik hazırlayın.
3. Yavaşça iki elini kullanarak hayvan fincan. Bu savunma mekanizmaları ve bir stres tepkisi neden olarak kuyruk hayvan kapmak etmeyin.
4. Hayvanın kulak etiketini kontrol edin ve kaydedin.
5. Ağırlık ölçeğinde kabın içinde hayvan yerleştirin ve ağırlığı kaydedin.
6. Yavaşça tekrar iki eliyle hayvan fincan ve 1 dakika boyunca kolu, hareket etmek ve eller içinde keşfetmek için izin. İşlem odasında bir bank üzerinde bunu gerçekleştirin ve yere hayvan düşmemeye dikkat edin.
7. 1 dakika taşıma sonra, onun kafese geri hayvan yerleştirin.
8. Kafesteki diğer hayvanlar için 1.3−1.7 adımlarını tekrarlayın.
9. İşlem günü 2 (ertesi gün): Adımları 1.2−1.5'i yineleyin.
10. Yavaşça tekrar iki eliyle hayvan fincan ve 2 dakika boyunca kolu, hareket etmek ve eller içinde keşfetmek için izin. İşlem odasında bir bank üzerinde bunu gerçekleştirin ve yere hayvan düşmemeye dikkat edin.
11. 2 dakika taşıma sonra, onun kafese geri hayvan yerleştirin.
12. Kafesteki diğer hayvanlar için 1.10−1.11 adımlarını tekrarlayın.
13. 3. gün (ertesi gün): Adımları 1.2−1.5'i yineleyin.
14. Yavaşça tekrar iki eliyle hayvan fincan ve 4 dakika boyunca kolu, hareket etmek ve eller içinde keşfetmek için izin. İşlem odasında bir bank üzerinde bunu gerçekleştirin ve yere hayvan düşmemeye dikkat edin.
15. 4 dakika taşıma sonra, onun kafese geri hayvan yerleştirin.
16. Kafesteki diğer hayvanlar için 1.14−1.15 adımlarını tekrarlayın.
17. 4. gün (kontrol günü, 1. gün işlemeden itibaren 1 hafta): Adımları 1.2−1.5'i yineleyin.
18. Yavaşça tekrar iki eliyle hayvan fincan ve 4 dakika boyunca kolu, hareket etmek ve eller içinde keşfetmek için izin. İşlem odasında bir bank üzerinde bunu gerçekleştirin ve yere hayvan düşmemeye dikkat edin.
19. 4 dk tutuştan sonra hayvanı tekrar kafesine koyun.
20. Kafesteki diğer hayvanlar için 1.18-1.19 adımlarını tekrarlayın.
    NOT: Denetim işleme günü, üç günlük bir işleme protokolünden sonra sakin davranışın tutulmasını sınar.

2. Ağırlık düşürme prosedürü

1. Fareyi bir indüksiyon odasına yerleştirin. Oksijen ve vakum akışını hem 1 L/dk'ya, hem de isofluran gazı seviyesini %3−5'e ayarlayın. 5 dakika boyunca fareanestezi.
2. Fareyi indüksiyon odasından çıkarın ve köpük bir pedin üzerine yerleştirin. Bir parmak veya kuyruk kıskaç yanıt yokluğu için test edin.
3. Bir analjezik (0.1 mg/kg buprenorfin) subkutan olarak uygulayın. EEG ameliyatı aynı gün yapılırsa, steroid olmayan anti-inflamatuar carprofen (5 mg/kg) ile birlikte buprenorfini subkutan olarak uygulayın.
4. Sodyum laktat çözeltisini (hayvanın ağırlığının gramı 3 μL) son darbeden önce veya sonra deri altına uygulayın. Sodyum laktat çözeltisi tek bir enjeksiyonda hızlı uygulama için analjezikler ile karıştırılabilir.
   NOT: Sodyum laktat çözeltisi suda sodyum klorür, potasyum klorür, kalsiyum klorür ve sodyum laktat karışımı içerir. Bu adım sıvılar ve elektrolitler yerine yardımcı olur, kurtarma yardımcı.
5. Farenin başını ağırlık düşürme borusu(Şekil 1A)altına yerleştirin ve başın ortasına, göz ve kulak çizgisi arasına düz paslanmaz çelik bir disk (1,3 cm çapında, 1 mm kalınlığında ve 880 mg ağırlık) yerleştirin.
   NOT: Bu disk kafatası yüzeyine darbe yayılır (Şekil 1B).
6. 50 cm yükseklikten 100 g ağırlık çubuk serbest bırakmak için ağırlık bırakma tüpü nde pin çıkarın. Kontrol fareler için sahte yaralanma indüklemek için, pin ve kilo damlasının kazara serbest bırakılmasını önlemek için üreden ağırlık çubuğunu tümden çıkar.
   NOT: Hayvanın kafası düz konumlandırılmalıdır, böylece çubuk diskin tüm yüzeyine serbest çesitlenmelidir.
7. Steril polilined emici havlu ile kaplı bir ısıtma yastığı üzerinde kurtarma için sırtında bilinçsiz hayvan yerleştirin. Doğru refleks kurtarma süresi (yani, farenin kendisini sırtından sağa düzeltmesi için gereken süre) bilinçsiz geçirilen zaman için bir okuma olarak ölçülebilir.
8. Hayvan bilincini geri kazandığında, bir ısıtma yastığı üzerinde ısıtılmış temiz bir kafese yerleştirin, kurtarma jeli ve birkaç nemlendirilmiş chow parçaları ile 45 dakika boyunca kurtarmak için. Hayvanın aşırı ısınması, farenin çok soğuk olmasına izin vermek kadar iyileşmenin önündeki en büyük engeli kanıtlayabilir.
9. 45 dakika sonra, tekrar adımları 2.1−2.8 iki kez, adım 2.3 atlayarak (yani, analjezikler ve anti-inflamatuar ilaçların uygulanması).
10. EEG elektrot implantasyonu ameliyatı aynı gün yapılırsa hayvanların 1−2 saat iyileşmesini bekleyin.

3. EEG elektrotlarının implantasyonu için cerrahi alan hazırlığı

NOT: Ameliyat öncesi cerrahi aletleri ve vidaları otoklav. Cerrahi eldivenleri hayvana dokunmadan önce ve sonra %70 etanol, steril olmayan malzemeler ve hayvanlarla ilgilenme arasında püskürtme ve ovma ile temizleyin. Hayvanlar arasında boncuk sterilizatörde (Bkz. Malzemeler Tablosu)2−3 dk için cerrahi aletleri sterilize edin. Stereotaktik cihaza yeni bir hayvan yerleştirmeden önce steril perdeyi değiştirin. Cerrahi alanın ameliyat için gerekli tüm bileşenleri içerdiğinden emin olun(Şekil 2). Bu modelde TBI'yi indüklemek için invaziv bir cerrahi işlemin olmamasının çeşitli avantajları vardır: 1) elektrotların implantasyonu esnektir ve TBI ile aynı gün veya belirli bir süre sonra yapılabilir; 2) hayvanın iyileşme süresi daha hızlıdır; 3) kafatası bozulmadan kalır, daha fazla yüzey alanı ve elektrotlar implante için esneklik sağlar.

1. Fareyi 5 dakika boyunca indüksiyon odasında %3−5 izofluran gazıyla anesteize edin.
2. Fareyi indüksiyon odasından stereotaktik cihaza aktarın ve burun konisine bağlı izofluran gazı ve vakum tüpleriyle ısıtma yastığının üzerine steril bir perdeüzerine yerleştirin.
3. Ameliyat sırasında vücut ısısını 37 °C'de koruyun. Sıcaklık sensörünü farenin göğüs veya karın duvarıyla temas edecek şekilde yerleştirin.
4. Kulak çubuklarını kullanarak hayvanın kafasını yerinde düzeltin.
5. Anesteziyi %1,5−%3,5 isofluran veya cerrahi düzlemde ~60 nefes/dk 'da (parmak veya kuyruk kıskacına yanıt sız) koruyun.
6. Ameliyat boyunca yağlanmış tutmak için hayvanın gözlerine bir göz merhemi uygulayın.
7. TBI gün içinde daha erken bir şekilde yapılmadığı sürece analjezikler (0.1 mg/kg buprenorfin) ve steroid olmayan anti-inflamatuar ilaç (5 mg/kg karprofen) karışımını tek bir enjeksiyonda uygulayın.
   NOT: İlk TBI ve EEG yerleştirme ameliyatı arasındaki süre 8 h'yi aşarsa veya hayvanda ilk uygulamadan sonra 8 saat ağrı belirtileri gösteriyorsa buprenorfin tekrar uygulanmalıdır, ancak karprofen ilavesi yapılmadan verilmelidir.
8. Sodyum laktat çözeltisi (hayvanın ağırlığının gramı 3 μL) deri altı bir şekilde hayvandaki sıvı ve elektrolitlerin yerine uygulayın.
   NOT: Ameliyat TBI'den hemen sonra yapılıyorsa, bu adımın doğru bir şekilde zamanlanmış olması gerekir. Sodyum laktat çözeltisi her 2 saat uygulanmalıdır süre hayvan prosedürleri uğrar ve bir kez ameliyattan sonra, 2 saat önceki enjeksiyondan.
9. Bir epilasyon kremi kullanarak kafa derisi nden saç çıkarın.
10. Kesi yapmadan önce, povidon-iyot cerrahi antiseptik solüsyon ve dairesel bir hareket 3x (her zaman çözelti başına 20 s) steril gazlı bez pedleri ile alternatif bezler% 70 etanol ile kafa derisi cilt dezenfekte.
11. Bir neşter kullanarak, kafa derisi orta hatta sadece başın arkasına kadar bir rostral-ködal kesi yapmak. Deri kapakları eEG-cap üzerinde veya çevresinde daha fazla istikrar sağlayan mühürlü olabilir gibi kafa derisi açma Bu yöntem, kafa derisi kesme yerine tercih edilir.
    NOT: Kafatasını 3-EEG başlığının implantasyonuna hazırlanırken kafa derisinin kesilmesi gereklidir, çünkü başın büyüklüğü deri kapaklarının başağa kapanmasına izin vermeyecektir.
12. Açık cilt sınırlarına küçük hemostatlar uygulayarak kesi alanını genişletin. Kesiden sonra herhangi bir kanama meydana gelirse, steril pamuklu gazlı bez veya bezle temizleyin.
13. Neşter bıçağıyla periost (yani kranial kemik üzerindeki ince zarı) nazikçe çıkarın. Bu adımda herhangi bir kanama olursa, kanama bölgesine steril pamuklu bir bezle durana kadar basın.
14. Hidrojen peroksit ile kafatası temizlemek için steril pamuk lu bezler kullanın, ancak maruz krannial alanı çevreleyen yumuşak doku dokunmaktan kaçının. Kafatası herhangi bir yumuşak dokudan temizlenir ve beyazımsı bir görünüme sahip olana kadar bu adımı tekrarlayın.
15. Steril bir gazlı bez veya pamuklu bez ile kafatası kuru.
    NOT: 3.12−3.15 adımlarının elektrotların ve diş çimentolarının doğru fiksasyonu için önemlidir. Herhangi bir yumuşak doku, kateterize olmayan kanama, ve enkaz enfeksiyona neden olabilir, kararsız headmount fiksasyon, bozuk veya sinyal yok, ve ameliyattan sonra birkaç gün veya hafta içinde implant kaybı.

4. Elektrot yerleşimi

1. Tek EEG (1EEG) kanal headmount implant.
   NOT: Stereotaktik koordinatlarda kısaltmalar uzamsal ilişkileri temsil eder ve hayvanın başında belirli bir oryantasyonda hedefin milimetre cinsinden mesafesini belirtir: anterior-posterior (AP) ve medial-lateral (ML). Dorsal-ventral bu protokolde geçerli değildir, çünkü tüm elektrotlar beyin içinde belirli bir yapıyerine epidural alana yerleştirilir (Şekil 3). Vin+ aktif bir elektrot, Vin-ise referans elektrotdur.
   1. Sağlanan stereotaktik^{koordinatları}kullanarak altı çapak deliği (üç stabilite vidaları ve elektrotlar için üç) oluşturmak için min başına ~5.000−6.000 mermi (rpm) bir çelik bit (0.5 mm, yuvarlak, 1/4 in.) ile yüksek hızlı bir matkap kullanın. İki ön vida için: AP = +1,5 mm, ML = ±1,5 mm; bir posterior vida için: AP = -5,2 mm, ML = -1,5 mm; yer elektrotiçin: AP = -5.2 mm, ML = +1.5 mm; kayıt elektrotları için: AP = -2,3 mm, ML = ±2,7 mm, vin+ sağda ve Vin- solda.
   2. Baş sahne gelişmiş istikrar için üç vida ekleyin. Bir tornavida kullanarak, her biri 1−1,5 x vidaları kafatasına sabitlenecek şekilde çevirin.
      NOT: Vidaları daha derine yerleştirmek beyne zarar verir.
   3. 1EEG başlığını stereotaktik tutucu bir kola takın ve üç elektrotun kafatası orta hattı boyunca yer alması için başlığı yerleştirin. Bu yapılandırmada zemin elektrot ve headmount üstünde ki ilgili açılış arka, Ortasında Vin + elektrot ve önde Vin- elektrot. Bir işaret kalıcı bir işaretile headmount üzerinde yapılabilir.
   4. Her elektrodu 90° bükün, böylece her telin ucu aşağı doğru bükülür ve ilgili çapak deliğinin üzerine yerleştirin. Daha sonra, şimdi çapak deliğine dik olan telin 1 mm uzunluğunu ölçün ve fazlalığı kırpın(Şekil 3). Bu elektrotların epidural yerleşimsağlayacaktır. Elektrotlar dura mater yüzeyine zar zor dokunuyor olmalı.
   5. Headmount alt ve ilgili çapak delik maç için her üç elektrotayarlayını ayarlayın. Epidural kayıt için elektrotlar dura mater'in üzerine veya zar zor dokunmalıdır.
   6. Diş çimentosu birkaç damla çözücü ile toz 1/2 kepçe karıştırarak uygulamaya hazırlayın. Bir karıştırma spatula kullanın ve son karışımı macun gibi, yapışkan ama dövülebilir ve hayvanın kafatası üzerine yerleştirildiğinde düzgün bir şekilde yoğunlaştırmak için yeterince sert olana kadar karıştırın.
   7. Tüm vida ve elektrotları kaplayan diş çimentosu karışımı uygulayın ve katılaşmak için ~3−5 dk bekleyin. Plastik kaideyi diş çimentosuyla örtmemeye özen, çünkü hayvanı bir tether ile commutator'a bağlamayı imkansız hale getirecektir.
   8. Deri kapaklarını tutan hemostatları serbest bırakın ve deri kapaklarını plastik kaidenin etrafına bağlayarak kesiyi kapatın. Deri fleplerini kapatmak için birkaç damla doku yapıştırıcısı uygulayın (Bkz. Malzemeler Tablosu).
   9. Enfeksiyondan kaçınmak için implantın çevresindeki bölgeye klorheksidin antiseptik uygulayın. Eğer hayvan, TBI indüksiyonu sırasında verilen sodyum laktat solüsyonu enjeksiyonundan sonra 2 saatten uzun süre anestezi altında ysa, deri altına başka bir enjeksiyon uygulayın. Hayvanın uygun hidrasyon korumak için, enjeksiyon her 2 saat hayvan anestezi altında harcadığı tekrarlayın.
   10. Ameliyattan sonra, önceki enjeksiyondan sonra sodyum laktat çözeltisi 2 saat son bir enjeksiyon verin. Ameliyat 2 saatten daha uzunsa, ilk enjeksiyondan itibaren sodyum laktat solüsyonunun son iyileşme dozu 2 saat uygulayın.
   11. Hayvanı stereotaktik cihazdan çıkarın ve EEG ameliyatından sonra hayvanın ağırlığını gelecekteki izleme için bir referans olarak ölçün. İmplant nedeniyle, hayvanın ağırlığı ameliyat öncesi daha büyük olacaktır.
   12. Kurtarma için sıcak bir ısıtma yastığı üzerinde temiz bir kafese hayvan yerleştirin.
2. İki EEG ve bir EMG (2EEG/1EMG) kanalını implante edin.
   1. Headmount yerleşimi için bir dönüm noktası olarak bregma kullanın. 2EEG/1EMG başlığının alt tarafına, dört vida deliğinden kaçınarak ve 2EEG/1EMG headmount'u kafatası yüzeyine yerleştirerek az miktarda doku yapıştırıcısı (Bkz. Malzeme Tablosunabakın) uygulayın.
      NOT: Bu başlık yerleştirme için özel koordinatları vardır. Headmount 8 mm uzunluğunda ve 5 mm genişliğinde, hangi kafatası yüzeyinin çoğunu kapsar. Ön kenarı 3.0 mm ön ön bregma ile headmount konumlandırma en iyi ve iyi sinyal kalitesi sağlar. Doku yapışkan kürlerinin düşmesinden önce hızlı manuel yerleştirme gereklidir. Doku tutkal tamamen tedavi için yaklaşık 5 dk bekleyin.
   2. Kafa daki dört açıklıktan vidalar için pilot delikleri oluşturmak için steril 23 G iğne kullanın. Bunu başarmak için, yavaşça iğne itin ve yavaş yavaş iğne ucu beyne zarar vermeden kafatası nüfuz kadar döndürün. Steril pamuklu bir bez kullanarak pilot deliklerdeki kanamaları giderin.
   3. Pilot deliklerdeki vidalara 0.10'u yerleştirin ve her biri kafatasına sabitlenene kadar döndürün. Bu vida uzunluğunun yarısına kadar olabilir, ama tam uzunlukta değil, Bu dura mater ve korteks zarar vereceğini gibi. Başmontaj kafatası yüzeyi ile başın arka ucu arasında bir boşluk olacak şekilde yerleştirilmişse, arka kısımda iki 0.12 vida kullanın.
   4. İki bileşenli epoksi (gümüş-epoksi) çift paket kesenin kenarlarında küçük bir açıklık yapın. Bir çift taraflı spatula alın ve kese her bileşenin küçük ve eşit miktarda kepçe ve onları karıştırın her tarafı kullanın. Karışım 20 dk içinde katılaşır, çünkü tek bir ameliyat için yeterli sadece küçük bir miktar kullanın.
      NOT: Gümüş-epoksi vida ve headmount arasında uygun elektrik teması sağlar ve vida ların stabilitesini artırır.
   5. Vida başı ve vida deliği arasında bu karışımın küçük bir miktar uygulayın, sonra başını implant tabanına dayanın kadar her vida sıkın. Her vida ayrı bir elektrot görevi gördüğünden ve doğru bir sinyal sağlamak için diğer vidayla temas etmediğinden emin olun.
   6. Gümüş-epoksi karışımı yanlış yerleştirilmiş ise, dikkatle bağlantı ayırmak için fazlakepçe için birkaç ikinci kez pencere vardır. Dikkatle hayvanın baş ve boyun kontur takip headmount arka kenarından her iki EMG yol viraj, ve sonra ense kasları içine takın.
   7. Diş çimentosu birkaç damla çözücü ile toz 1/2 kepçe karıştırarak uygulamaya hazırlayın. Bir karıştırma spatula kullanın ve son karışımı macun gibi, yapışkan ama dövülebilir ve hayvanın kafatası üzerine yerleştirildiğinde düzgün bir şekilde yoğunlaştırmak için yeterince sert olana kadar karıştırın.
   8. Altı iğne deliklerini kaplamaktan kaçınırken tüm başlığı kaplayan diş çimentosu karışımı uygulayın, bu ön amplifikatörü bağlamayı imkansız hale getirecektir. Çimento katılaşmak için ~3−5 dk bekleyin. Cildin diş çimentosu ile başağa kapalı olmadığından emin olun.
   9. Deri kapaklarını tutan hemostatları serbest bırakın ve deri kapaklarını plastik kaidenin etrafına bağlayarak kesiyi kapatın. Deri flepleri mühürlemek için birkaç damla doku yapıştırıcısı uygulayın.
      NOT: Cilt kesi, EMG telinin düzleştirmesi için daha uzun yapılmışsa, deri doku yapıştırıcısı veya dikişli ile kapatılabilir. Doku yapıştırıcıile cildi mühürleme genellikle yeterlidir. Ancak ameliyat sonrası izleme sırasında kesi nin açılması gözlenirse, bunun yerine dikiş ler önerilir.
   10. Enfeksiyondan kaçınmak için implantın çevresindeki bölgeye klorheksidin antiseptik uygulayın. Sodyum laktat çözeltisi (hayvanın ağırlığının gramı 3 μL) deri altı bir şekilde, hayvan önceki enjeksiyondan sonra 2 saatten uzun süre anestezi altında ysa sıvı ve elektrolitleri değiştirin.
   11. Hayvanı stereotaktik cihazdan çıkarın ve EEG ameliyatından sonra hayvanın ağırlığını gelecekteki izleme için bir referans olarak ölçün. İmplant nedeniyle, hayvanın ağırlığı ameliyat öncesi daha büyük olacaktır.
   12. Kurtarma jeli ve kurtarma için birkaç nemlendirilmiş chow parçaları ile, sıcak bir ısıtma yastığı üzerinde temiz bir kafese hayvan yerleştirin.
3. Üç adet EEG kanalı (3EEG) başlığı nı implante edin.
   1. Sağlanan stereotaktik koordinatları kullanarak altı çapak deliği (üç stabilite vidaları ve elektrotlar için üç) oluşturmak için ~ 5.000−6.000 rpm bir çelik bit (0.5 mm, yuvarlak, 1/4) ile yüksek hızlı matkap kullanın¹². EEG1 ve EEG2 için zemin ve ortak referans için: AP = 5,2 mm, ML = ±1,5 mm; EEG1 ve EEG2 için: AP = -3.0 mm, ML = ±3.0 mm; bağımsız EEG3 için: AP =-1.4 mm, ML = ±1.5 mm.
   2. Çapak delikleri içine altı vida elektrotları yerleştirin.
      NOT: Vidaların daha derine yerleştirilmesi beyne önemli hasarlar verecektir. Vidalı elektrotlar başlık daha iyi stabilite sağlar.
   3. Diş çimentosu birkaç damla çözücü ile toz 1/2 kepçe karıştırarak uygulamaya hazırlayın. Bir karıştırma spatula kullanın ve son karışımı macun gibi, yapışkan ama dövülebilir ve hayvanın kafatası üzerine yerleştirildiğinde düzgün bir şekilde yoğunlaştırmak için yeterince sert olana kadar karıştırın.
   4. Kafatasının tüm maruz kalan yüzeyini ve her vida elektrodu kapsayan diş çimentosu karışımı uygulayın. Cildin diş çimentosu ile başağa kapalı olmadığından emin olun. Çimento hafif katılaşmak için ~1−2 dk bekleyin. Bir sonraki adıma geçmeden önce tam katılaşmayı beklemeye gerek yoktur.
   5. Isıtmak için lehim demirini açın. 3EEG başlığını stereotaktik tutucu kola yerleştirin.
      NOT: Altı tel kurşun pozisyonu, her vida elektrotunun tel kablolarının konumuyla eşleşecek şekilde başlık montajını yerleştirin.
   6. Başlık kısmını diş çimentosu üstüne dayanacak şekilde alt edin.
   7. Vida elektrotlarının her birinden her bir kurşunun kabloyu, başa başın ilgili tel kurşunuyla bükün.
      NOT: Yanlış kablo kablolarının bükülmesi veri yorumlanmasını karmaşık veya imkansız hale getirir.
   8. Makasla fazla kabloyu dikkatlice kırpın. Uygun sinyal iletimi için her bükümlü tel çifti lehim.
      NOT: Her bir kablo çifti başka bir çiftle temas etmelidir, aksi takdirde sinyal kalitesi ve veri yorumlanması tehlikeye girer.
   9. Her lehimli tel kablo kablosunu başağa doğru bükün ve her çift arasında temastan kaçının.
      NOT: Kablo kabloları yeterince kısa kesilmemişse, başka bir kabloya dokunmadan başlık etrafında bükmek zor olabilir. Bu durumda, ilk bir çift viraj, diş çimento karışımı ile kaplayın, katılaştırmak için ~ 1−2 dk bekleyin, sonra aynı şekilde bir sonraki çifti ile devam edin.
   10. Tüm teli diş çimentosuyla kaplayan son kısım, başlığın sadece siyah kısmını açıkta bırakarak.
       NOT: Deliklerdeki herhangi bir enkaz veya çimento kontağı engelleyecek ve sinyal yokluğuna veya gürültüye yol açacağından, başbaşlığın açıkta kalan kısmının üstüne herhangi bir diş çimentosu tozu veya karışımı uygulamamaya dikkat edin.
   11. Deri fleplerini tutan hemostatları serbest bırakın. Enfeksiyondan kaçınmak için implantın çevresindeki bölgeye klorheksidin antiseptik uygulayın.
   12. Sodyum laktat çözeltisi (hayvanın ağırlığının gramı 3 μL) deri altı bir şekilde, hayvan önceki enjeksiyondan sonra 2 saatten uzun süre anestezi altında kalmışsa sıvı ve elektrolitleri değiştirin.
   13. Hayvanı stereotaktik cihazdan çıkarın ve EEG ameliyatından sonra hayvanın ağırlığını gelecekteki izleme için bir referans olarak ölçün. İmplant nedeniyle, hayvanın ağırlığı ameliyat öncesi daha büyük olacaktır.
   14. Kurtarma jeli ve kurtarma için birkaç nemlendirilmiş chow parçaları ile, sıcak bir ısıtma yastığı üzerinde temiz bir kafese hayvan yerleştirin.
       NOT: Hidrojen peroksit kafatası kalan yumuşak doku çıkarmadan yardımcı olur.

5. Hayvanların satın alma sistemine bağlanması

1. Satın alma kafesinden çıkarmak ve bir Hayvan Transfer İstasyonu (ATS) gibi düz bir yüzeye sahip temiz bir alana aktarmak için iki eliyle hayvan Kupası.
2. Fareyi sırtından hafifçe yakalayın. Bu sıkıntıya neden olduğu için hayvanı kuyruğundan tutmayın.
3. EEG başlığındaki açıklığı zemin elektrotuna karşılık gelen olarak tanımlayın ve uygun bağlantı için tether'in ilgili pimini eşleştirin.
   NOT: Bağlantı noktasından hayvan başlığına ters bağlantı elektrotlardan ve potansiyel olarak bozulmuş dalga formlarından farklı bir okuma ile sonuçlanır.
4. Hayvanı satın alma kafesine geri döndürün ve bağlantı nın diğer ucunu (EEG System 1) veya ön amplifikatörü (EEG System 2) commutator'a bağlayın.
   NOT: Ön amplifikatör (EEG System 2) commutator'dan gelen bağlantıya bağlanırken, her iki tetherin uçlarındaki beyaz işaretleri eşleştirin. Ters bağlantı amplifikatörkalıcı hasara neden olur ve pahalı üretici tarafından onarım gerektirir.
5. Mekanizmanın düzgün çalıştığından ve hayvanın serbestçe hareket edebilmesi için hayvanı commutatöre bağlayan ipi yavaşça döndürün.

6. EEG veri toplama ayarları

1. EEG Sistem 1 kazanım parametrelerini ayarlayın.
   1. Örnekleme oranını 500 Hz'e ayarlayın; kazanç 5.000; mod Norm 35 Hz; LPN kapalı. Yüksek geçiş filtresini 0,5 Hz'e ayarlayın.
      NOT: 100 Hz (düşük geçiş) dahili dir ve manuel giriş gerektirmez.
2. EEG Sistemi 2 kazanım parametrelerini ayarlayın.
   1. Örnekleme oranını 600 Hz'e ayarlayın; preamp kazanç 100; kazanç 1 (EEG1,2). Düşük geçiş filtresini 100 Hz'e ayarlayın.
      NOT: 1 Hz (yüksek geçiş) dahili dir ve manuel giriş gerektirmez.

7. Video veri toplama ayarları

1. EEG Sistemi 1 için satın alma parametrelerini ayarlayın.
   NOT: Eşzamanlı video verilerini elde etmek için üçüncü taraf video edinme sistemine ihtiyaç vardır.
   1. Uygun video kalitesi için kare hızını 15 (minimum önerilir) ile 30 (maksimum kullanılabilir) arasında ayarlayın. Çözünürlüğü 640 x 640 piksel olarak ayarlayın. Sıkıştırma türünü H.264H olarak ayarlayın.
2. EEG System 2 için satın alma parametrelerini ayarlayın.
   NOT: Bu EEG sistemi, video ve EEG verilerini en fazla dört hayvan için tek bir dosyada senkronize eden bir video sistemi ve yazılım sunar (bkz.
   1. Uygun video kalitesi için kare hızını 15 (minimum önerilir) ile 30 (maksimum kullanılabilir) arasında ayarlayın. Çözünürlüğü 640 x 480 piksel olarak ayarlayın. Sıkıştırma türünü WebM dosya biçimine ayarlayın.

Sonuçlar

Burada özetlenen protokol, tekrarlayan diffüz TBI'nin fare modelini kullanarak, bir diffüz yaralanmayı izole etme de (örn. fokal lezyon yokluğunda) indüksiyon yöntemini açıklar (Şekil 1). Şekil 1A, bu modelde TBI indüksiyonu için kullanılan ağırlık düşürme cihazını ve bileşenlerini(Şekil 1A, a1−a5)ve işlem sırasında önemli adımları(Şekil 1

Tartışmalar

Odak ve diffüz yaralanmanın odak veya kombinasyonunu indükleyen CCI ve FPI modellerinin aksine, bu protokolde tanımlanan tekrarlayan diffüz TBI modeli, fokal beyin hasarının yokluğunda diffüz yaralanmanın indüksiyonuna olanak sağlar ve kafa derisi veya kraniyal açıklıklar ve ilişkili inflamasyon gerektirmez. Bu modelde kraniektomi yokluğunun bir yararı da sadece kronik sürekli EEG kaydı için elektrotlar implant sağlar, aynı zamanda kronik in vivo 2-foton görüntüleme için hayvanların inceltilmi...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.10" screw	Pinnacle Technology Inc., KS, USA	8209	0.10 inch long stainless steel
0.10" screw	Pinnacle Technology Inc., KS, USA	8403	0.10 inch long with pre-soldered wire lead
0.12" screw	Pinnacle Technology Inc., KS, USA	8212	0.12 inch long stainless steel
1EEG headmount	Invitro1 (subsidiary of Plastics One), VA, USA	MS333/8-A/SPC	3 individually Teflon-insulated platinum iridium wire electrodes (twisted or untwisted, 0.005 inch diameter) extending below threaded plastic pedestal
2EEG/1EMG headmount	Pinnacle Technology Inc., KS, USA	8201	2EEG/1EMG channels
3% hydrogen peroxide			Pharmacy
3EEG headmount	Pinnacle Technology Inc., KS, USA	8235-SM-C	custom 6-Pin Connector for 3EEG channels
Buprenorphine	Par Pharmaceuticals, Cos. Inc., Spring Valley, NY, USA	060969
Buprenorphine	Par Pharmaceuticals, Cos. Inc., Spring Valley, NY, USA	060969
C57BL/6 mice	Harlan/Envigo Laboratories Inc		male, 12-16 weeks old
C57BL/6 mice	The Jackson Laboratory		male, 12-16 weeks old
Carprofen	Zoetis Services LLC, Parsippany, NJ, USA	026357	NOTE: this drug is added during weight drop only if stereotactic electrode implantation will be performed on the same day
Chlorhexidine antiseptic			Pharmacy
Dental cement and solvent kit	Stoelting Co., USA	51459
Drill	Foredom	HP4-917
Drill bit	Meisinger USA, LLC, USA	HM1-005-HP	0.5 mm, Round, 1/4, Steel
Dry sterilizer	Cellpoint Scientific, USA		Germinator 500
EEG System 1	Biopac Systems, CA, USA
EEG System 2	Pinnacle Technology Inc., KS, USA
Ethanol ≥70%	VWR, USA	71001-652	KOPTEC USP, Biotechnology Grade (140 Proof)
Eye ointment	Pro Labs Ltd, USA		Puralube Vet Ointment Sterile Ocular Lubricant available in general online stores and pharmacies
Fluriso liquid for inhalation anesthesia	MWI Veterinary Supply Co., USA	502017
Hair removal product	Church & Dwight Co., Inc., USA		Nair cream
Isoflurane	MWI Veterinary Supply Co., USA	502017
Povidone-iodine surgical solution	Purdue Products, USA	004677	Betadine
Rimadyl/Carprofen	Zoetis Services LLC, Parsippany, NJ, USA	026357
Solder			Harware store
Soldering iron	Weller, USA	WP35	ST7 tip, 0.8mm
Stainless steel disc			Custom made
Sterile cotton swabs
Sterile gauze pads	Fisher Scientific, USA	22362178
Sterile poly-lined absorbent towels pads	Cardinal Health, USA	3520
Tissue adhesive	3M Animal Care Products, USA	1469SB