반복적 확산 외상성 뇌 손상의 마우스 모델에서 외상 후 간질 유도

요약

이 체계적인 프로토콜은 반복적인 가벼운 외상성 뇌 손상 후에 외상 후 간질의 새로운 동물 모델을 설명합니다. 첫 번째 부분은 수정된 체중 감소 모델을 사용하여 외상성 뇌 손상 유도 단계를 자세히 설명합니다. 두 번째 부분은 단일 및 다중 채널 뇌전도 데이터 수집 시스템에 대한 수술 접근 방식에 대한 지침을 제공합니다.

초록

외상성 뇌 손상 (TBI)은 후천성 간질의 주요 원인입니다. TBI는 초점 또는 확산 뇌 손상을 초래할 수 있습니다. 초점 상해는 뇌 조직에 직접적인 병변을 만드는 두개골을 통해 때때로 관통하는 직접적인 기계적 힘의 결과입니다. 이들은 타박상, 열상 및 출혈을 가진 지역으로 두뇌 화상 진찰 도중 보입니다. 국소 병변은 신경 세포 죽음과 신경교 흉터 형성을 유도하고 TBI를 발생 모든 사람들의 20 %-25 %에 존재한다. 그러나, TBI 케이스의 대다수에서, 상해는 비 초점, 확산 손상의 결과로 가속 감속 력 및 후속 조직 전단에 기인합니다. TBI 환자의 소집단은 몇 달 또는 년의 대기 기간 후에 외상 후 간질 (PTE)를 개발하는 것을 계속합니다. 현재, 어떤 환자가 PTE를 개발할지 예측하는 것은 불가능하며, PTE 환자의 발작은 통제하기가 어렵기 때문에 추가 연구가 필요합니다. 최근까지, 필드는 피질에 있는 거대한 조직 손실을 가진 큰 초점 병변및 때때로 피질 구조물을 가진 두 개의 자발적인 외상 후 포착을 가진 두 개의 동물/설치류 모형으로 제한되었습니다. 이러한 접근법과는 대조적으로, 변형된 체중 투하 모델을 사용하여 유도된 확산 TBI가 국소 병변 또는 조직 손실이 없는 경우에도 자발적인 경련성 및 비경련성 발작의 개발을 개시하기에 충분하다고 판단되었다. 후천성 외상 후 간질을 가진 인간 환자와 유사하게, 이 모형은 포착 개시의 앞에 상해 후에 대기 기간으로 제출합니다. 이 프로토콜에서, 지역 사회는 몇 달의 과정을 통해 지속적인 장기 비디오 뇌전도 동물 모니터링 에 이어 확산 비 lesional TBI를 유도하는 방법을 자세히 외상 후 간질의 새로운 모델을 제공 할 것입니다. 이 프로토콜은 동물 취급, 체중 감소 절차, 두 개의 수집 시스템에 대한 전극 배치 및 수술, 수술 후 모니터링 및 데이터 수집의 각 단계에서 발생하는 빈번한 과제를 자세히 설명합니다.

서문

매년 TBI는 전 세계적으로 약 6천만 명에게 영향을 미칩니다. 영향 받은 개별은 초기 상해 후에 년을 명시할 수 있는 간질 개발의 고위험에 입니다. 가혹한 TBI는 간질의 고위험과 연관되더라도, 온화한 TBI조차 간질 발전의 개별의 기회를 증가합니다^1,2,3,4. 모든 TI는 초점, 확산 또는 둘 다의 조합으로 분류될 수 있습니다. 확산 뇌 손상, 많은 경우 모든 TI에 존재, 때문에 가속 감속 및 회전 힘으로 서로 에 대해 전단 다른 밀도의 뇌 조직의 결과입니다. 정의에 따르면, 확산 상해는 컴퓨터 단층 촬영 스캔에 뇌 병변이 보이지 않는 경증 / 뇌진탕 비 관통 뇌 손상에서 만^발생5.

외상 후 간질 (PTE)을 개발하거나 위험에 처한 환자의 관리에는 현재 두 가지 중요한 문제가 있습니다. 첫 번째는 PTE가 나타나면 발작이 사용 가능한 항 간질 약물 (AED)에 내성이 있다는 것입니다^6. 둘째, AEDs는 간질 발생을 예방하는 데 동등하게 효과가 없으며 효과적인 대체 치료 접근법이 없습니다. 이 적자를 해결하고 치료를위한 더 나은 치료 목표와 후보를 찾기 위해, PTE^6의뿌리에서 새로운 세포 및 분자 메커니즘을 탐구할 필요가있을 것이다.

외상 후 간질의 두드러진 특징 중 하나는 초기 외상 성 사건과 자발적, 도발적이지 않은 재발성 발작의 발병 사이의 잠복 기간입니다. 이 시간 창에서 발생하는 이벤트는 연구원을위한 자연적인 초점입니다, 이 시간 창은 모두 PTE의 치료와 예방을 허용 할 수 있기 때문에. 동물 모델은 몇 가지 뚜렷한 이점을 제공하기 때문에 이 연구에 가장 일반적으로 사용되며, 그 중 가장 적은 것은 인간 환자의 지속적인 모니터링이 잠재적으로 긴 시간 동안 비실용적이고 비용이 많이 들 것이라는 것입니다. 추가적으로, 간질 발생의 루트에 있는 세포와 분자 기계장치는 동물 모형에서만 탐구될 수 있습니다.

자발적인 외상 후 발작 및 간질을 가진 동물 모델은 화학 흡충제 또는 전기 자극에 의해 급성, 만성, 또는 점화에 의해 보다 적게 생리학적으로 관련성이 있는 수단에 의해 TBI 후에 포착이 유도되는 모형에 선호됩니다. 자발적인 외상 후 발작 모델은 TBI가 간질 발생으로 이어지는 건강한 뇌 네트워크를 어떻게 수정하는지 테스트합니다. TBI에 노출이 발작 임계값을 감소시키고 포착에 감수성에 영향을 미치는 방법을 TBI 후에 추가 자극을 사용하는 연구 결과. 화학적으로 또는 전기 자극을 유도한 발작을 가진 동물 모형의 이점은 AEDs에 내화성의 특정 기계장치 및 기존 및 신규 한 AEDs의 효험을 시험하기 에서 입니다. 그러나, 인간에게 이러한 데이터의 관련성 및 번역의 정도는 다음과 같은 이유로 모호한^7일 수 있습니다: 1) 발작 메커니즘은 TBI에 의해 유도된 메커니즘과 다를 수 있습니다. 2) 이러한 모델의 모든 자발적인 발작으로 이어질^7; 3) 경련제 자체에 의해 생성된 병변은, 캐뉼라가 그 전달에 요구되거나, 또는 깊이 구조(예를 들어, 해마 또는 편도체)에서 전극 배치를 자극함으로써 이미 발작 감수성 및 심지어 해마 간질 전위 잠재력을 증가시킬 수 있다^7. 더욱이, 일부 경련제(즉, 카이닉산)는 TBI 확산 후 전형적이지 않은 직접적인 해마 병변 및 경화증을 생성한다.

최근까지, 외상 후 간질의 단지 2개의 동물 모형존재: 통제된 피질 충격 (CCI, 초점) 또는 유체 타악기 상해 (FPI, 초점 및 확산)^8. 두 모델 모두 설치류의 조직 손실, 출혈 및 글리오시스와 함께 큰 국소 병변을 초래합니다^8. 이 모형은 큰 초점 병변에 의해 유도된 외상 후 간질을 모방합니다. 최근 연구는 반복 (3x) 확산 TBI가 초점 병변의 부재에도 마우스에서 자발적인 발작과 간질의 개발을 위해 충분하다는 것을 입증^9,확인 된 자발적인 재발 성 발작과 세 번째 설치류 PTE 모델을 추가. 이 새로운 모형은 온화한, 뇌진탕 TBI를 가진 인간 인구를 더 잘 나타내는 확산 TBI에 의해 유도된 세포와 분자 변경을 모방합니다. 이 모델에서는, 발작 개시 및 늦은, 자발적, 재발성 발작의 출현 의 출현 의 3 주 이상 잠복 기간은 외상 후 간질 발생의 근본 원인을 조사하고, 발작 개시 후 예방 접근법 및 새로운 치료 후보의 효능을 테스트하고, 외상 후 간질 의 바이오 마커의 개발 가능성이 있다.

외상 후 간질 연구를 위한 동물 모델의 선택은 과학적 질문, 조사된 뇌 손상의 유형 및 기본 세포 및 분자 메커니즘을 결정하는 데 사용되는 도구에 따라 달라집니다. 궁극적으로, 외상 후 간질의 모든 모델은 TBI 동물의 하위 집합에서 자발적인 발작의 출현과 TBI 동물의 하위 집합에서 초기 대기 기간 모두를 입증해야합니다, TBI를 발생시키는 모든 환자는 간질을 개발하기 위해 계속하지 않기 때문에. 이를 위해 동시 비디오 수집을 통해 뇌파(EEG)가 이 프로토콜에 사용됩니다. 정확한 데이터 해석을 위해 데이터 수집 하드웨어 및 접근 방식의 기술적 측면을 이해하는 것은 매우 중요합니다. 중요한 하드웨어 측면에는 기록 시스템의 유형, 전극 유형(나사 또는 와이어 리드) 및 이들이 만든 재료, 동기화된 비디오 수집(EEG 시스템 또는 제3자의 일부) 및 컴퓨터 시스템의 특성이 포함됩니다. 연구 목표, 관심 있는 EEG 이벤트, 추가 분석 방법 및 데이터 스토리지의 지속 가능성에 따라 모든 유형의 시스템에서 적절한 수집 매개 변수를 설정하는 것이 필수적입니다. 마지막으로, 각각의 장점과 단점을 가지고 있으며 데이터 해석에 영향을 미치기 때문에 전극 구성 (montage)의 방법을 고려해야합니다.

이 프로토콜은 마우스에서 자발적, 도발적이지 않은, 재발성 발작을 초래하는 확산 상해를 유도하기 위해 변형된 Marmarou 중량 투하 모델^10,11을 사용하는 방법을 자세히 설명하고, 단극성, 양극성 또는 혼합 몽타주를 사용하여 단일 및 다중 채널 연속 및 동기화된 비디오 EEG를 획득하는 외과적 접근법을 설명한다.

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프로토콜

이 프로토콜에 설명된 모든 동물 절차는 버지니아 공대의 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 따라 그리고 국립 보건원의 '실험실 동물의 관리 및 사용을위한 가이드'에 따라 수행되었습니다. .

1. 동물 취급 프로토콜

참고: 이 프로토콜은 도착 후 공급업체에서 시설로 주문한 동물을 습관화하고 실험자가 처리하도록 조절하기 위한 것입니다. 이것은 스트레스와 불안을 감소시켜 동물의 복지를 향상시키고 TBI 유도, 수술 후 모니터링 및 획득 시스템에 동물을 연결하는 것을 포함하여 동물을 취급해야 하는 특정 절차를 단순화합니다.

1. 많은 동물이 공급 업체로부터 수신될 때, 귀 태그를 무작위로 실험 군 (TBI) 또는 대조군 (가짜 수술)에 할당하면서 2-5 동물의 새장에서 그들을 결합합니다. 집 TBI 동물은 때때로 TBI를 겪은 마우스를 향해 공격적으로 행동하기 때문에 가짜 동물과 별도로.
2. 취급 일 1 (귀 태그 후 24-48 시간): 동물 귀 태그, 생년월일, 취급 일자, 취급 일자, 취급 기간 및 의견 및 관찰을위한 섹션을 기록하기위한 차트를 준비하십시오.
3. 양손으로 동물을 부드럽게 컵에 마침하십시오. 그것은 방어 메커니즘과 스트레스 응답을 유도로 꼬리에 의해 동물을 잡아하지 마십시오.
4. 동물의 귀 태그를 확인하고 기록하십시오.
5. 동물을 용기에 넣고 체중계를 기록합니다.
6. 동물을 양손으로 다시 부드럽게 컵에 대고 1분간 다루어 손 안에서 움직이고 탐험할 수 있도록 합니다. 절차 실에서 벤치에이 작업을 수행하고 바닥에 동물을 떨어 뜨리지 않도록주의하십시오.
7. 1분 후에 동물을 케이지에 다시 놓습니다.
8. 케이지에 있는 다른 동물에 대해 1.3-1.7단계를 반복합니다.
9. 취급 일 2 (다음 날): 1.2-1.5 단계를 반복합니다.
10. 동물을 양손으로 다시 부드럽게 컵에 대고 2분간 다루어 손 안에서 움직이고 탐험할 수 있도록 합니다. 절차 실에서 벤치에이 작업을 수행하고 바닥에 동물을 떨어 뜨리지 않도록주의하십시오.
11. 2분 처리 후 동물을 케이지에 다시 놓습니다.
12. 케이지에 있는 다른 동물에 대해 1.10-1.11단계를 반복합니다.
13. 취급일 3(다음 날): 1.2-1.5단계를 반복한다.
14. 동물을 양손으로 다시 부드럽게 컵에 대고 4분간 다루어 손 안에서 움직이고 탐험할 수 있도록 합니다. 절차 실에서 벤치에이 작업을 수행하고 바닥에 동물을 떨어 뜨리지 않도록주의하십시오.
15. 4분 후에 동물을 케이지에 다시 놓습니다.
16. 케이지에 있는 다른 동물에 대해 1.14-1.15단계를 반복합니다.
17. 취급일4일(관리일, 취급일로부터 1주일): 1.2-1.5단계를 반복한다.
18. 동물을 양손으로 다시 부드럽게 컵에 대고 4분간 다루어 손 안에서 움직이고 탐험할 수 있도록 합니다. 절차 실에서 벤치에이 작업을 수행하고 바닥에 동물을 떨어 뜨리지 않도록주의하십시오.
19. 4분 처리 후 동물을 케이지에 다시 놓습니다.
20. 케이지에 있는 다른 동물에 대해 1.18-1.19단계를 반복합니다.
    참고: 제어 처리 일은 3일 간의 처리 프로토콜 후에 진정 동작의 보존을 테스트합니다.

2. 체중 감량 절차

1. 유도 챔버에 마우스를 놓습니다. 산소와 진공의 흐름을 1L/min으로 설정하고 이소플루란 가스 수준을 3%-5%로 설정합니다. 5 분 동안 마우스를 마취.
2. 유도 챔버에서 마우스를 제거하고 폼 패드에 놓습니다. 발가락이나 꼬리 핀치에 대한 반응이 없는지 테스트합니다.
3. 피하 진통제 (0.1 mg / kg buprenorphine)를 피하 투여하십시오. EEG 수술이 같은 날 수행되는 경우, 비 스테로이드 성 항 염증 카프로펜 (5 mg / kg)과 함께 피하 피하로 buprenorphine을 투여.
4. 마지막 충격 전후에 젖산 나트륨 용액(동물 체중의 그램당 3 μL)을 피하적으로 투여합니다. 젖산 나트륨 용액은 단일 주사로 빠른 투여를 위해 진통제와 혼합 될 수 있습니다.
   참고 : 젖산 나트륨 용액에는 염화 나트륨, 염화 칼륨, 염화 칼슘 및 젖산 나트륨이 혼합되어 있습니다. 이 단계는 유체와 전해질을 대체하여 회복을 돕습니다.
5. 마우스의 머리를 무게 드롭튜브(그림 1A)아래에 놓고 평평한 스테인리스 디스크(직경 1.3cm, 두께 1mm, 무게 880mg)를 머리와 귀 의 선 사이에 놓습니다.
   참고: 이 디스크는 두개골 표면에 미치는 영향을 확산시킵니다(그림1B).
6. 무게 드롭 튜브의 핀을 제거하여 50cm 높이에서 100g의 웨이트 로드를 놓습니다. 대조군 마우스에 대한 가짜 손상을 유도하기 위해, 핀의 우발적 인 방출과 체중 감소를 방지하기 위해 튜브에서 웨이트 로드를 제거하십시오.
   참고: 동물의 머리를 평평하게 배치해야 로드가 디스크 의 전체 표면에 자유 낙하되도록하십시오.
7. 무의식적인 동물을 등에 두어 무균 폴리안드 흡수 수건으로 덮인 가열 패드에 회복하십시오. 오른쪽 반사 복구 시간 (즉, 마우스가 뒤에서 오른쪽으로 걸리는 시간)은 의식이 없는 시간을 판독값으로 측정할 수 있습니다.
8. 동물이 의식을 되찾을 때, 45 분 동안 회복하기 위해 복구 젤과 몇 가지 축축한 차우 조각으로 가열 패드에 따뜻하게 된 깨끗한 케이지에 놓습니다. 동물을 과열하면 마우스가 너무 차가워질 수 있으므로 회복에 큰 장애물이 될 수 있습니다.
9. 45 분 후, 2.1-2.8 단계를 두 번 반복하고 2.3 단계를 생략하십시오 (즉, 진통제 및 항 염증 약물의 투여).
10. EEG 전극 이식 수술이 같은 날에 수행되는 경우 동물이 1-2 시간 동안 회복되도록 하십시오.

3. EEG 전극의 이식을위한 외과 분야 준비

참고: 수술 도구와 나사를 수술 전에 오토클레이브하십시오. 동물, 비멸균 물질, 그리고 동물을 다루기 전과 접촉 후 70% 에탄올로 분무하고 문지르면서 수술용 장갑을 청소합니다. 동물 사이에 2-3 분 동안 수술 도구를 살균하십시오 (재료 표참조). 새 동물을 입체 장치에 넣기 전에 멸균 드레이프를 변경합니다. 수술 장에 수술에 필요한 모든 구성 요소가 포함되어 있는지 확인합니다(그림2). 이 모델에서 TBI를 유도하는 침습적 외과 적 수술의 부재는 몇 가지 장점이 있습니다 : 1) 전극의 이식은 유연하며 TBI와 같은 날 또는 정해진 기간 후에 수행 될 수있다; 2) 동물의 회복 시간이 더 빠릅니다. 3) 두개골은 그대로 유지되어 전극을 이식하기위한 더 많은 표면적과 유연성을 허용합니다.

1. 5 분 동안 유도 챔버에서 3 %-5 % 이소플루란 가스에서 마우스를 마취.
2. 유도 챔버에서 입체 장치로 마우스를 전송하고 이소플루란 가스와 코 콘에 연결된 진공 튜브와 가열 패드에 멸균 드레이프에 배치합니다.
3. 수술 과정 동안 37 °C에서 체온을 유지하십시오. 온도 센서를 놓아 마우스의 가슴이나 복벽과 접촉합니다.
4. 이어 바를 사용하여 동물의 머리를 제자리에 고정시하십시오.
5. 마취를 1.5%-3.5% 이소플루란 또는 수술면에서 ~60회 호흡/분(발가락이나 꼬리 핀치에 반응하지 않고)으로 유지하십시오.
6. 동물의 눈에 눈 연고를 바르고 수술 내내 윤활유를 유지합니다.
7. 진통제 (0.1 mg / kg buprenorphine)와 비 스테로이드 성 항 염증 약물 (5 mg / kg 카프로펜)의 혼합물을 하루 일찍 TBI를 수행하지 않는 한 피하적으로 단일 주사로 투여하고, 이 경우 동물은 이미 진통제 및 항 염증을 받았다.
   참고 : 부프레 노르핀은 첫 번째 TBI와 EEG 배치 수술 사이의 시간이 8 시간을 초과하거나 동물이 첫 번째 투여 후 통증의 징후를 표시하는 경우 다시 투여해야하지만, 카프로펜을 추가하지 않고 주어져야한다.
8. 젖산 나트륨 용액 (동물 의 무게의 그램 당 3 μL)을 피하적으로 투여하여 동물의 유체와 전해질을 대체하십시오.
   참고: TBI 직후에 수술을 시행하는 경우 이 단계는 적절한 시간 지정을 받아야 합니다. 젖산 나트륨 용액은 동물이 수술을 받은 후 한 번, 이전 주사로부터 2 시간마다 투여되어야합니다.
9. 제모 크림을 사용하여 두피에서 머리카락을 제거하십시오.
10. 절개를하기 전에, povidone-요오드 수술 방부제로 두피의 피부를 소독하고 70 % 에탄올을 원형 운동3 x (매번 용액 당 20 s)로 멸균 거즈 패드로 번갈아 가며 소독하십시오.
11. 메스를 사용하여 눈 바로 위에서 머리 뒤쪽까지 두피 미드 라인에 로스트랄 코달 절개를합니다. 피부 플랩이 더 많은 안정성을 제공하는 EEG 캡 위에 또는 주위에 밀봉 될 수 있기 때문에 두피를 절단하는 이 방법은 두피를 절단하는 것이 바람직합니다.
    참고 : 3-EEG 헤드 마운트의 이식을 위해 두개골을 준비 할 때 헤드 마운트의 크기로 헤드 마운트의 크기로 헤드 마운트를 통해 피부 플랩의 폐쇄를 허용하지 않기 때문에 두피를 절단해야합니다.
12. 열린 피부 테두리에 작은 지혈을 적용하여 절개 영역을 확장합니다. 절개 후 출혈이 발생하면 멸균 면 거즈 또는 면봉으로 청소하십시오.
13. 메스 블레이드로 골막 (즉, 두개골 뼈 위에 얇은 막)을 부드럽게 제거하십시오. 이 단계에서 출혈이 발생하면 멸균 면봉으로 출혈 부위를 눌러 멈출 때까지 누르십시오.
14. 멸균 면봉을 사용하여 과산화수소로 두개골을 청소하지만 노출 된 두개골 영역을 둘러싼 연조직을 만지지 마십시오. 두개골이 연조직에서 깨끗이 씻어 내고 희끄무레한 모양이 될 때까지이 단계를 반복하십시오.
15. 멸균 거즈 또는 면봉으로 두개골을 건조시면 됩니다.
    참고: 3.12-3.15 단계는 전극과 치과 시멘트의 적절한 고정에 중요합니다. 연조직, 소작되지 않은 출혈 및 파편은 감염, 불안정한 헤드마운트 고정, 왜곡되거나 결석한 신호, 수술 후 며칠 또는 몇 주 이내에 임플란트 의 손실을 일으킬 수 있습니다.

4. 전극 배치

1. 단일 EEG(1EEG) 채널 헤드마운트를 이식합니다.
   참고: 입체 좌표의 약어는 공간 관계를 나타내고 동물의 머리에 지정된 방향에서 브레그마에서 대상의 밀리미터 거리를 지정합니다: 전방 후방(AP) 및 내측 측면(ML). 모든 전극이 뇌 내의 특정 구조가 아닌 경막외 공간에 배치되기 때문에 등쪽 복부는이 프로토콜에 적용되지 않습니다 .그림 3). Vin+는 활성 전극이며 Vin-는 기준 전극입니다.
   1. 강철 비트(0.5 mm, 원형, 1/4인치)가 있는 고속 드릴을 사용하여 ~5,000-6,000회(rpm)에서 6개의 버 홀(안정성 나사의 경우 3개, 전극의 경우 3개)을 생성하여 제공된 스테레오 좌표^12를사용합니다. 두 개의 전방 나사: AP = +1.5 mm, ML = ±1.5 mm; 하나의 후방 나사에 대한 : AP = -5.2 mm, ML = -1.5 mm; 접지 전극의 경우: AP = -5.2 mm, ML = +1.5 mm; 기록 전극의 경우: AP = -2.3 mm, ML = ±2.7 mm, 빈+를 오른쪽으로, 빈은 왼쪽에 있습니다.
   2. 헤드 스테이지의 안정성향상을 위해 3개의 나사를 추가합니다. 드라이버를 사용하여 나사를 각각 1-1.5 x 회전하여 두개골에 안정적으로 고정하십시오.
      참고: 나사를 더 깊게 놓면 뇌가 손상됩니다.
   3. 1EEG 헤드마운트를 입체 홀더 암에 삽입하고 헤드마운트를 배치하여 세 개의 전극이 두개골 중간선을 따라 배치되도록 합니다. 이 구성에서 접지 전극과 헤드 마운트의 상단에 각각의 개구부는 뒤쪽에, 중간에 Vin + 전극, 전면에 Vin- 전극. 영구 마커로 헤드마운트에 마크를 만들 수 있습니다.
   4. 각 전선의 끝이 아래쪽으로 구부러지고 해당 버 구멍 위에 위치되도록 각 전극을 90° 구부립니다. 그런 다음 버 구멍에 수직인 와이어 부분의 길이가 1mm를 측정하고 초과를잘라냅니다(그림 3). 이것은 전극의 경막 외 배치를 보장합니다. 전극은 경막 미더 표면에 거의 닿지 않아야 합니다.
   5. 헤드마운트를 낮추고 세 개의 전극을 모두 조정하여 각 버 구멍에 맞춥습니다. 경막외 기록의 경우, 전극을 위에 놓거나 경막미를 거의 만지지 않아야 합니다.
   6. 용매 의 여러 방울과 분말의 1/2 스쿱을 혼합하여 응용 프로그램에 대한 치과 시멘트를 준비합니다. 혼합 주걱을 사용하고 최종 혼합물이 퍼티와 비슷하지만 끈적거리지만 가단성이 높고 동물의 두개골에 놓일 때 제대로 응축될 정도로 뻣뻣해질 때까지 저어줍니다.
   7. 모든 나사와 전극을 덮고 있는 치과 용 시멘트 혼합물을 적용하고 고형화 될 때까지 ~ 3-5 분 기다립니다. 그것은 불가능 밧줄로 통근에 동물을 연결하게하기 때문에, 치과 시멘트플라스틱 받침대를 커버하지 않도록하십시오.
   8. 피부 플랩을 들고 지혈을 해제하고 플라스틱 받침대 주위에 피부 플랩을 연결하여 절개를 닫습니다. 여러 방울의 티슈접착제를 바르고(재료 표참조) 피부 플랩을 밀봉합니다.
   9. 감염을 피하기 위해 임플란트 주변 부위에 클로르헨시딘 방부제를 적용하십시오. 동물이 TBI 유도 중에 주어진 젖산 나트륨 용액을 이전 주입 한 후 2 시간 이상 마취를 받으면 다른 주사를 피하투여하십시오. 동물의 적절한 수분을 유지하려면 동물이 마취하에 소비하는 2 시간마다 주사를 반복하십시오.
   10. 수술 후, 이전 주사 후 젖산 나트륨 용액 2 h의 최종 주사를 준다. 수술이 2시간 미만이면, 첫 번째 주사로부터 젖산 나트륨 용액의 최종 회복 용량을 2시간 투여한다.
   11. 입체 장치에서 동물을 제거하고 향후 모니터링을 위한 참고 자료로 EEG 수술 후 동물의 체중을 측정합니다. 임플란트로 인해 동물의 체중은 수술 전보다 더 큽할 것입니다.
   12. 회복을 위해 동물을 따뜻한 가열 패드에 깨끗한 케이지에 놓습니다.
2. 2개의 EEG 및 1개의 EMG(2EEG/1EMG) 채널을 헤드마운트에 이식합니다.
   1. 헤드 마운트의 배치를위한 랜드 마크로 bregma를 사용합니다. 2EEG/1EMG 헤드마운트의 하단에 소량의 티슈 접착제(재료 표참조)를 적용하여 4개의 나사 구멍을 피하고 2EEG/1EMG 헤드마운트를 두개골 표면에 놓습니다.
      참고: 이 헤드마운트의 배치에 대한 특정 좌표는 없습니다. 헤드마운트는 길이 8mm, 너비 5mm로 대부분의 두개골 표면을 덮습니다. 헤드마운트를 앞쪽 가장자리로 배치하면 브레그마에 3.0mm 전방에 위치하는 것이 최적이고 좋은 신호 품질을 제공합니다. 조직 접착제 치료제를 떨어 뜨리기 전에 빠른 수동 배치가 필요합니다. 조직 접착제가 완전히 치료될 때 약 5분 정도 두도록 두드리라.
   2. 멸균 23G 바늘을 사용하여 헤드마운트의 네 개의 구멍을 통해 나사에 대한 파일럿 구멍을 만듭니다. 이를 위해 바늘을 부드럽게 밀고 바늘 끝이 뇌를 손상시키지 않고 두개골에 침투 할 때까지 천천히 회전하십시오. 멸균 면봉을 사용하여 파일럿 구멍에서 출혈을 제거하십시오.
   3. 파일럿 구멍에 나사에 0.10을 삽입하고 각각 두개골에 고정 될 때까지 회전. 이것은 나사 길이의 절반까지 될 수 있지만 전체 길이는 아닐 수 있습니다. 헤드마운트가 배치되어 두개골 표면과 헤드마운트의 후면 끝 사이에 간격이 있도록 위치하는 경우 후방 부에 2개의 0.12 나사를 사용한다.
   4. 두 성분 에폭시 (실버 에폭시) 트윈 팩 파우치의 측면에 작은 구멍을 확인합니다. 양면 주걱을 가지고 파우치에서 각 구성 요소의 작은 동일한 양을 국자와 함께 혼합하기 위해 각 측면을 사용합니다. 혼합물이 20 분 이내에 고형화되기 때문에 단일 수술에 충분한 소량만 사용하십시오.
      참고 : 실버 에폭시는 나사와 헤드 마운트 사이의 적절한 전기 접촉을 허용하고 나사의 안정성을 향상시킵니다.
   5. 나사와 나사 구멍 사이에 소량의 혼합물을 적용한 다음 머리가 임플란트 바닥에 놓일 때까지 각 나사를 조입니다. 각 나사가 개별 전극역할을 하기 때문에 은색 에폭시가 두 나사 사이에 접촉하지 않도록 하고 정확한 신호를 보장하기 위해 다른 나사와 접촉해서는 안 됩니다.
   6. 은-에폭시 혼합물이 잘못 배치된 경우, 연결을 분리하기 위해 과량의 것을 조심스럽게 떠낼 수 있는 몇 번째 창이 있습니다. 조심스럽게 동물의 머리와 목의 윤곽을 따라 헤드 마운트의 후방 가장자리에서 두 EMG 리드를 구부린 다음 nuchal 근육에 삽입합니다.
   7. 용매 의 여러 방울과 분말의 1/2 스쿱을 혼합하여 응용 프로그램에 대한 치과 시멘트를 준비합니다. 혼합 주걱을 사용하고 최종 혼합물이 퍼티와 비슷하지만 끈적거리지만 가단성이 높고 동물의 두개골에 놓일 때 제대로 응축될 정도로 뻣뻣해질 때까지 저어줍니다.
   8. 6 개의 핀 구멍을 덮는 것을 피하면서 전체 헤드 마운트를 덮는 치과 시멘트 혼합물을 적용하면 사전 증폭기를 연결하는 것이 불가능합니다. 시멘트가 굳어지때까지 ~3-5분 간 기다립니다. 피부가 치과 시멘트와 헤드 마운트에 밀봉되지 않았는지 확인하십시오.
   9. 피부 플랩을 들고 지혈을 해제하고 플라스틱 받침대 주위에 피부 플랩을 연결하여 절개를 닫습니다. 피부 플랩을 밀봉하기 위해 조직 접착제의 여러 방울을 적용합니다.
      참고 : 피부 절개가 EMG 와이어 리드의 교정을 허용하기 위해 더 이상 만들어진 경우, 피부는 조직 접착제 또는 봉합로 밀봉 될 수있다. 조직 접착제로 피부를 밀봉하는 것은 일반적으로 충분하다. 그러나 수술 후 모니터링 개구부가 관찰되는 경우 봉합사를 권장합니다.
   10. 감염을 피하기 위해 임플란트 주변 부위에 클로르헨시딘 방부제를 적용하십시오. 젖산 나트륨 용액 (동물 의 무게의 그램 당 3 μL)을 피하적으로 투여하여 동물이 이전 주사 후 2 시간 이상 마취를 하고 있는 경우 체액과 전해질을 대체합니다.
   11. 입체 장치에서 동물을 제거하고 향후 모니터링을 위한 참고 자료로 EEG 수술 후 동물의 체중을 측정합니다. 임플란트로 인해 동물의 체중은 수술 전보다 더 큽할 것입니다.
   12. 동물을 따뜻한 가열 패드에 깨끗한 케이지에 놓고 회복을 위해 회복 젤과 촉촉한 차우 조각 몇 개를 놓습니다.
3. 3개의 EEG 채널(3EEG) 헤드마운트를 이식합니다.
   1. ~5,000-6,000 rpm에서 강철 비트(0.5 mm, 원형, 1/4)가 있는 고속 드릴을 사용하여 제공된 입체 좌표^12를사용하여 6개의 버 구멍(안정성 나사의 경우 3개, 전극용 3개)을 생성합니다. EEG1 및 EEG2에 대한 접지 및 공통 참조: AP = 5.2 mm, ML = ±1.5 mm; EEG1 및 EEG2의 경우: AP = -3.0 mm, ML = ±3.0 mm; 독립 EEG3의 경우: AP =-1.4 mm, ML = ±1.5 mm.
   2. 6개의 나사 전극을 버 구멍에 넣습니다.
      참고 : 나사를 더 깊게 배치하면 뇌에 심각한 손상을 입힐 수 있습니다. 나사 전극은 헤드마운트의 안정성을 더 잘 제공합니다.
   3. 용매 의 여러 방울과 분말의 1/2 스쿱을 혼합하여 응용 프로그램에 대한 치과 시멘트를 준비합니다. 혼합 주걱을 사용하고 최종 혼합물이 퍼티와 비슷하지만 끈적거리지만 가단성이 높고 동물의 두개골에 놓일 때 제대로 응축될 정도로 뻣뻣해질 때까지 저어줍니다.
   4. 두개골과 각 나사 전극의 전체 노출 된 표면을 덮는 치과 시멘트 혼합물을 적용합니다. 피부가 치과 시멘트와 헤드 마운트에 밀봉되지 않았는지 확인하십시오. 시멘트가 약간 고형화될 때까지 ~1-2분 간 기다립니다. 다음 단계로 진행하기 전에 전체 응고 될 때까지 기다릴 필요가 없습니다.
   5. 납땜 인두를 켜서 가열하십시오. 3EEG 헤드마운트를 입체 홀더 암에 놓습니다.
      참고: 6개의 와이어 리드 위치가 각 나사 전극의 와이어 리드 위치와 일치되도록 헤드마운트를 배치합니다.
   6. 복부 부분이 치과 시멘트 위에 놓이게 되도록 헤드마운트를 낮춥춥습니다.
   7. 헤드마운트의 해당 와이어 리드로 각 나사 전극에서 각 리드의 와이어를 비틀어 보세요.
      참고: 잘못된 와이어 리드를 비틀면 데이터 해석이 복잡하거나 불가능해집니다.
   8. 가위를 사용하여 여분의 와이어를 조심스럽게 다듬습니다. 적절한 신호 전도를 위해 각 꼬인 와이어 쌍을 납땜합니다.
      참고 : 전선의 각 쌍은 그렇지 않으면 신호 품질과 데이터 해석이 손상될 것이다, 다른 쌍과 접촉해야합니다.
   9. 헤드마운트 주변에 납땜된 와이어 리드의 각 쌍을 구부려 각 쌍 간의 접촉을 피합니다.
      참고: 와이어 리드가 충분히 짧게 트리밍되지 않으면 다른 와이어를 건드리지 않고 헤드마운트 주변을 구부리기가 어려울 수 있습니다. 이 경우, 먼저 한 쌍을 구부리고 치과 시멘트 혼합물로 덮고 ~ 1-2 분 동안 기다렸다가 고형화 한 다음 같은 방식으로 다음 쌍을 진행하십시오.
   10. 치과 시멘트로 모든 와이어를 덮는 것을 마치면 헤드 마운트의 검은 부분만 노출됩니다.
       참고 : 구멍에 파편이나 시멘트가 접촉을 차단하고 신호 부재 또는 소음중 하나를 초래할 것 같은 헤드 마운트의 노출 된 부분의 상단에 치과 시멘트 분말이나 혼합물을 적용하지 않도록주의하십시오.
   11. 피부 플랩을 들고 지혈을 해제합니다. 감염을 피하기 위해 임플란트 주변 부위에 클로르헨시딘 방부제를 적용하십시오.
   12. 젖산 나트륨 용액 (동물 의 무게의 그램 당 3 μL)을 피하적으로 투여하여 동물이 이전 주사 후 2 시간 이상 마취를 한 경우 체액과 전해질을 대체하십시오.
   13. 입체 장치에서 동물을 제거하고 향후 모니터링을 위한 참고 자료로 EEG 수술 후 동물의 체중을 측정합니다. 임플란트로 인해 동물의 체중은 수술 전보다 더 큽할 것입니다.
   14. 동물을 따뜻한 가열 패드에 깨끗한 케이지에 놓고 회복을 위해 회복 젤과 촉촉한 차우 조각 몇 개를 놓습니다.
       참고 : 과산화수소는 두개골에서 남아있는 연조직을 제거하는 데 도움을 주었습니다.

5. 동물을 획득 시스템에 연결

1. 양손으로 동물을 컵에 넣어 수집 케이지에서 제거하고 동물 이송 스테이션(ATS)과 같이 평평한 표면으로 깨끗한 지역으로 옮김을 옮니다.
2. 부드럽게 뒷면의 피부에 의해 마우스를 잡아. 이 고통을 야기로, 꼬리에 의해 동물을 잡아하지 마십시오.
3. 접지 전극에 해당하는 EEG 헤드마운트의 개구부를 식별하고 적절한 연결을 위해 밧줄의 각 핀을 일치시다.
   참고: 통근기에서 동물 헤드마운트로 밧줄이 반대로 연결되면 전극과 잠재적으로 왜곡된 파형이 다르게 판독됩니다.
4. 동물을 수집 케이지로 되돌리고 테더(EEG System 1) 또는 프리 앰프(EEG System 2)의 다른 쪽 끝을 통근기에 연결합니다.
   참고: 사전 증폭기(EEG System 2)를 통근기의 밧줄에 연결할 때 두 테더의 끝에 있는 흰색 표시와 일치합니다. 역연결은 앰프가 영구적으로 손상되어 제조업체가 수리해야 하므로 비용이 많이 듭니다.
5. 동물을 통근기와 연결하는 밧줄이 부드럽게 회전하여 메커니즘이 제대로 작동하고 동물이 자유롭게 움직일 수 있도록 합니다.

6. 뇌파 데이터 수집 설정

1. EEG 시스템 1 수집 매개 변수를 설정합니다.
   1. 샘플링 속도를 500Hz로 설정합니다. 이득 5,000; 모드 규범 35 Hz; LPN 끄기. 하이 패스 필터를 0.5Hz로 설정합니다.
      참고: 100Hz(로우 패스)가 내장되어 있으며 수동 입력이 필요하지 않습니다.
2. EEG 시스템 2 획득 매개변수를 설정합니다.
   1. 샘플링 속도를 600Hz로 설정합니다. 프리앰프 게인 100; 게인 1 (EEG1,2) 로우 패스 필터를 100Hz로 설정합니다.
      참고: 1Hz(하이 패스)가 내장되어 있으며 수동 입력이 필요하지 않습니다.

7. 비디오 데이터 수집 설정

1. EEG 시스템 1에 대한 수집 매개 변수를 설정합니다.
   참고: 동시 비디오 데이터를 얻기 위해서는 타사 비디오 수집 시스템이 필요합니다.
   1. 적절한 비디오 품질을 위해 프레임 속도를 최소 15(최소 권장)에서 30(최대 사용 가능)으로 설정합니다. 해상도를 640 x 640 픽셀로 설정합니다. 압축 유형을 H.264H로 설정합니다.
2. EEG 시스템 2에 대한 수집 매개 변수를 설정합니다.
   참고: 이 EEG 시스템은 최대 4개의 동물에 대해 비디오 및 EEG 데이터를 단일 파일로 동기화하는 비디오 시스템과 소프트웨어를 제공합니다(재료 표참조).
   1. 적절한 비디오 품질을 위해 프레임 속도를 최소 15(최소 권장)에서 30(최대 사용 가능)으로 설정합니다. 해상도를 640 x 480 픽셀로 설정합니다. 압축 유형을 WebM 파일 형식으로 설정합니다.

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결과

여기서 설명된 프로토콜은 반복적인 확산 TBI의 마우스 모델을 사용하여 격리된 확산 상해의 유도 방법(예를 들어, 국소 병변이 없는 경우)을설명한다(도 1). 그림 1A는 이 모델에서 TBI의 유도에 사용되는 중량 투하 장치 및 그 구성 요소(그림1A, a1−a5)와절차 동안의 중요한 단계를 도시한다(그림

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토론

초점 과 확산 상해의 초점 또는 조합을 유도하는 CCI 및 FPI 모형과는 대조적으로, 이 프로토콜에 기술된 반복적인 확산 TBI의 모형은 초점 두뇌 상해의 부재에 확산 상해의 유도를 허용하고 두피 또는 두개골 개구부 및 관련염증을 요구하지 않습니다. 이 모델에서 두개골 절제술의 부재의 추가 장점은 만성 연속 EEG 기록을 위한 전극을 이식할 수 있다는 것입니다, 또한 동물의 만성 생체 내 2 광자 화...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.10" screw	Pinnacle Technology Inc., KS, USA	8209	0.10 inch long stainless steel
0.10" screw	Pinnacle Technology Inc., KS, USA	8403	0.10 inch long with pre-soldered wire lead
0.12" screw	Pinnacle Technology Inc., KS, USA	8212	0.12 inch long stainless steel
1EEG headmount	Invitro1 (subsidiary of Plastics One), VA, USA	MS333/8-A/SPC	3 individually Teflon-insulated platinum iridium wire electrodes (twisted or untwisted, 0.005 inch diameter) extending below threaded plastic pedestal
2EEG/1EMG headmount	Pinnacle Technology Inc., KS, USA	8201	2EEG/1EMG channels
3% hydrogen peroxide			Pharmacy
3EEG headmount	Pinnacle Technology Inc., KS, USA	8235-SM-C	custom 6-Pin Connector for 3EEG channels
Buprenorphine	Par Pharmaceuticals, Cos. Inc., Spring Valley, NY, USA	060969
Buprenorphine	Par Pharmaceuticals, Cos. Inc., Spring Valley, NY, USA	060969
C57BL/6 mice	Harlan/Envigo Laboratories Inc		male, 12-16 weeks old
C57BL/6 mice	The Jackson Laboratory		male, 12-16 weeks old
Carprofen	Zoetis Services LLC, Parsippany, NJ, USA	026357	NOTE: this drug is added during weight drop only if stereotactic electrode implantation will be performed on the same day
Chlorhexidine antiseptic			Pharmacy
Dental cement and solvent kit	Stoelting Co., USA	51459
Drill	Foredom	HP4-917
Drill bit	Meisinger USA, LLC, USA	HM1-005-HP	0.5 mm, Round, 1/4, Steel
Dry sterilizer	Cellpoint Scientific, USA		Germinator 500
EEG System 1	Biopac Systems, CA, USA
EEG System 2	Pinnacle Technology Inc., KS, USA
Ethanol ≥70%	VWR, USA	71001-652	KOPTEC USP, Biotechnology Grade (140 Proof)
Eye ointment	Pro Labs Ltd, USA		Puralube Vet Ointment Sterile Ocular Lubricant available in general online stores and pharmacies
Fluriso liquid for inhalation anesthesia	MWI Veterinary Supply Co., USA	502017
Hair removal product	Church & Dwight Co., Inc., USA		Nair cream
Isoflurane	MWI Veterinary Supply Co., USA	502017
Povidone-iodine surgical solution	Purdue Products, USA	004677	Betadine
Rimadyl/Carprofen	Zoetis Services LLC, Parsippany, NJ, USA	026357
Solder			Harware store
Soldering iron	Weller, USA	WP35	ST7 tip, 0.8mm
Stainless steel disc			Custom made
Sterile cotton swabs
Sterile gauze pads	Fisher Scientific, USA	22362178
Sterile poly-lined absorbent towels pads	Cardinal Health, USA	3520
Tissue adhesive	3M Animal Care Products, USA	1469SB