גרימת אפילפסיה פוסט טראומטית במודל עכבר של פגיעה במוח החוזר ומפוזר טראומטי

Summary

פרוטוקול שיטתי זה מתאר מודל חדש לבעלי חיים של אפילפסיה פוסט-טראומטית לאחר פגיעה קלה במוח הטראומטי. החלק הראשון לפרטים צעדים לפגיעה מוחית טראומטית אינדוקציה באמצעות מודל שונה ירידה במשקל. החלק השני מספק הנחיות לגבי הגישה הכירורגית עבור מערכות מידע חד-ערוצית לרכישת נתונים אלקטרונצלוגרפיה.

Abstract

פגיעה מוחית טראומטית (TBI) היא גורם מוביל של אפילפסיה נרכש. TBI יכול לגרום נזק המוח מוקד או לפזר. פגיעה מוקד היא תוצאה של כוחות מכניים ישירים, החודרים לעיתים דרך הגולגולת, ויוצרים פגיעה ישירה ברקמת המוח. אלה גלויים במהלך הדמיה מוחית כאזורים עם חבלה, קרע, דימום. נגעים מוקד לגרום מוות עצבי והיווצרות צלקת גליה נמצאים 20%-25% של כל האנשים שישאו tbi. עם זאת, ברוב המקרים TBI, הפציעה נגרמת על ידי כוחות האצה ההאטה הרקמות העוקבות, והתוצאה היא ללא מוקד, לפזר נזק. אוכלוסיית משנה של מטופלים TBI ממשיכה לפתח אפילפסיה פוסט-טראומטית (PTE) לאחר תקופת השהיה של חודשים או שנים. כיום, אי אפשר לנבא אילו מטופלים יפתחו PTE, והתקפים בחולים PTE מאתגרים לשלוט, המחייב מחקר נוסף. עד לאחרונה, השדה היה מוגבל רק לשני מודלים בעלי חיים/מכרסמים עם אימות ספונטני פוסט טראומטית התקפים, הן הצגת עם נגעים מוקד גדול עם אובדן רקמות מסיבי בקליפת המוח ולפעמים מבנים משנית. בניגוד לגישות אלה, נקבע כי מפוזר TBI המושרה באמצעות מודל שונה ירידה במשקל מספיק כדי ליזום פיתוח של ויהיו התקפי המושרה ובלתי מנוצעי, גם בהעדר נגעים מוקד או אובדן רקמות. בדומה לחולי אנוש עם אפילפסיה פוסט טראומטית שנרכש, מודל זה מציג עם תקופת השהיה לאחר פציעה לפני התקף התפרצות. בפרוטוקול זה, הקהילה תסופק עם מודל חדש של אפילפסיה פוסט טראומטית, המפרט כיצד לגרום לפזר TBI שאינם להטיות ואחריו ניטור לטווח ארוך של בעלי חיים באמצעות וידאו-electro, במהלך מספר חודשים. פרוטוקול זה יפרט את הטיפול בבעלי חיים, את הליך ירידה במשקל, מיקום האלקטרודה עבור שתי מערכות רכישה, ואת האתגרים התכופים שאירעו במהלך כל אחד מהצעדים של ניתוח, ניטור הדואר, ורכישת נתונים.

Introduction

כל שנה TBI משפיעה על האומדן 60,000,000 אנשים ברחבי העולם. אנשים מושפעים נמצאים בסיכון גבוה יותר לפתח אפילפסיה, אשר יכול להתבטא שנים לאחר הפציעה הראשונית. אם כי tbis חמורים קשורים עם סיכון גבוה יותר של אפילפסיה, אפילו tbis מתון מגביר את הסיכוי של האדם לפתח אפילפסיה^1,2,3,4. כל TBIs ניתן לסווג כמוקד, לפזר, או שילוב של שניהם. לפזר פגיעה מוחית, נוכח רבים אם לא כל TBIs, היא תוצאה של רקמות המוח של צפיפויות שונות הטיית אחד נגד השני בשל האצה-האטה וכוחות הסיבוב. על פי ההגדרה, פגיעה מפוזר מתרחשת רק בבידוד בפגיעה מוחית מתונה/זעזוע מוח, שבה אין נגעים במוח גלויים על סריקות טומוגרפיה ממוחשבת⁵.

קיימות כעת שתי בעיות קריטיות בניהול חולים שיש להם, או נמצאים בסיכון, פיתוח אפילפסיה פוסט טראומטית (PTE). הראשון הוא שפעם PTE התבטא, התקפים עמידים בפני תרופות נגד אפילפסיה זמין (AEDs)⁶. שנית, העורכים אינם יעילים באותה מידה במניעת epileptogenesis, ואין גישות טיפוליות יעילות חלופיות. על מנת לטפל בגרעון זה ולמצוא מטרות טיפוליות טובות יותר ומועמדים לטיפול, יהיה צורך לחקור מנגנונים סלולריים ומולקולריים חדשים בשורש של PTE⁶.

אחת התכונות הבולטות של אפילפסיה פוסט טראומטית היא התקופה הסמויה בין האירוע הטראומטי הראשוני והתחלתה של ספונטנית, תגרות, התקפים חוזרים. האירועים המתרחשים בתוך החלון הזמני הזה הם מוקד טבעי עבור החוקרים, כי חלון הזמן הזה עשוי לאפשר טיפול ומניעה של PTE לחלוטין. מודלים בעלי חיים הם הנפוצים ביותר עבור מחקר זה, כי הם מציעים מספר יתרונות ברורים, לא הפחות שהוא כי ניטור רציפה של חולים אנושיים יהיה גם מעשי ויקר בגלל מעבר מתמשך של זמן. בנוסף, ניתן לחקור מנגנונים סלולאריים ומולקולריים בשורש epileptogenesis רק בדגמי בעלי חיים.

מודלים בעלי חיים עם התקפים פוסט טראומטיים ספונטנית ואפילפסיה הם העדיפו על פני דגמים בהם התקפים הם המושרה לאחר TBI על ידי פחות מבחינה פיזיולוגית האמצעים, כגון על ידי כימופרכוסים או גירוי חשמלי בחריפות, כרוני, או על ידי הבזק. מודלים ספונטנית פוסט טראומטית התפיסה מבחן כיצד TBI משנה את רשת המוח בריא המוביל epileptogenesis. מחקרים באמצעות גירוי נוסף לאחר TBI להעריך כיצד חשיפה TBI מפחיתה את הסף התפיסה משפיע על הרגישות להתקפים. היתרונות של מודלים בעלי חיים עם התקפים המושרה כימית או עם גירוי חשמלי הם בדיקת המנגנונים הספציפיים של refractoriness העורכים ואת היעילות של הקיימים והרומן של העורכים. ובכל זאת, מידת הרלוונטיות והתרגום של נתונים אלה לבני אדם עשויה להיות מעורפלת⁷ בגלל המנגנונים הבאים: 1) מנגנוני התפיסה עשויים להיות שונים מאלה המושרה על ידי tbi בלבד; 2) לא כל הדגמים האלה להוביל ויהיו ספונטניים⁷; 3) נגעים שנוצרו על ידי הסוכן פרכוסים עצמה, עם צינורית נדרש עבור מסירתו, או על ידי עירור מיקום האלקטרודה במבני עומק (למשל, ההיפוקמפוס או האמיגדלה) יכול כבר לגרום להתקף רגישות מוגברת ואפילו היפוקמאל אפילפטית בשדה פוטנציאל⁷. יתר על כן, כמה הסוכנים פרכוסים (כלומר, חומצה kainic) לייצר נגעים היפוקמאל ישירה טרשת, אשר אינה אופיינית לאחר מפוזר TBI.

עד לאחרונה, רק שתי מודלים של בעלי חיים של אפילפסיה פוסט טראומטית היו קיימים: השפעה מבוקרת בקליפת העור (CCI, מוקד) או פגיעה בכלי הקשה של נוזל (FPI, מוקד ולפזר)⁸. שני הדגמים לגרום לנגעים מוקד גדול לצד אובדן רקמות, דימום, ו gliosis ב מכרסמים⁸. מודלים אלו מחקים אפילפסיה פוסט-טראומטית. הנגרמת על ידי נגעים מוקד גדול מחקר שנערך לאחרונה הראה כי חוזר (3x) לפזר TBI מספיקה לפיתוח של ותקפים ואפילפסיה ספונטנית בעכברים גם בהעדר נגעים מוקד⁹, הוספת מודל PTE שלישי מכרסם עם מאושר ונשנים ספונטנית התקפים. מודל חדש זה מחקה שינויים סלולריים ומולקולריים הנגרמת על ידי מפוזר TBI, טוב יותר לייצג את אוכלוסיית האדם עם קל, זעזוע מוח מתון. במודל זה, התקופה הסמויה של שלושה שבועות או יותר לפני התקף התפרצות הופעתה של מאוחר, ספונטנית, חוזרים ונשנים מאפשר לחקור את הסיבות השורש של פוסט טראומטי epileptogenesis, בדיקות את היעילות של גישות מניעתי ומועמדים טיפוליים חדשים לאחר התקף התפתחות, ויש לו פוטנציאל להתפתחות של בסמנים הepileptogenesis פוסט טראומטית כי

הבחירה במודל החי לחקר אפילפסיה פוסט-טראומטית תלויה בשאלה המדעית, סוג הפגיעה במוח ובאילו כלים ישמשו לקביעת המנגנון הסלולארי והמולקולרי הבסיסי. בסופו של דבר, כל מודל של אפילפסיה פוסט טראומטית חייב להפגין הן הופעתה של התקפים ספונטניים לאחר TBI ותקופת השהיה הראשונית בקבוצת משנה של בעלי חיים TBI, כי לא כל החולים שישאו TBI להמשיך לפתח אפילפסיה. לעשות זאת, אלקטרונצגרפיה (EEG) עם רכישת וידאו סימולטני משמש בפרוטוקול זה. הבנת ההיבטים הטכניים מאחורי חומרת רכישת נתונים וגישות היא קריטית לפענוח נתונים מדויק. היבטים החומרה הקריטיים כוללים את סוג מערכת ההקלטה, סוג של אלקטרודות (בורג או חוט עופרת) וחומרים שהם עשויים, רכישת וידאו מסונכרן (כחלק ממערכת EEG או צד שלישי), ומאפיינים של מערכת המחשב. חובה לקבוע את פרמטרי הרכישה המתאימים בכל סוג של מערכת בהתאם למטרת המחקר, אירועי EEG של עניין, שיטת ניתוח נוספת, וקיימות של אחסון נתונים. לבסוף, יש לשקול את השיטה של תצורת האלקטרודה (מונטאז '), מאחר שלכל אחד יש יתרונות וחסרונות והוא ישפיע על פרשנות הנתונים.

פרוטוקול זה מפרט כיצד להשתמש במשקל Marmarou שונה להוריד משקל^10,11 כדי לגרום לפזר את הפציעה כתוצאה ספונטנית, תגרות, והתקפים חוזרים בעכברים, מתארת גישות כירורגית לרכוש יחיד, multi-channel רציפה, וידאו מסונכרן EEG באמצעות מונואואר, דו קוטבית, או משולבת מעורב.

Protocol

כל ההליכים בעלי החיים המתוארים בפרוטוקול זה בוצעו בהתאם לוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים ולשימוש (IACUC) של וירג טק ובציות למוסדות הבריאות הלאומיים ' מדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה ' .

1. פרוטוקול טיפול בבעלי חיים

הערה: פרוטוקול זה נועד לhabituate בעלי חיים שהוזמנו מספק למתקן לאחר הגעתם ולטפל בהם לטיפול בניסויים. זה משפר את בעלי החיים להיות על ידי הפחתת מתח וחרדה ומפשט הליכים מסוימים הדורשים טיפול בבעלי חיים, כולל גרימת TBI, ניטור לאחר הניתוח, וחיבור החיה למערכת הרכישה.

1. כאשר בעלי חיים רבים מתקבלים מהספק, מתייג את האוזן ומקצים אותם באופן אקראי לקבוצה ניסיונית (TBI) או לקבוצת בקרה (ניתוח מזויף) תוך שילוב אותם בכלובים של 2-5 בעלי חיים. בעלי חיים TBI בנפרד מחיות מזויף כי עכברים מזויפים לפעמים לפעול באגרסיביות לעבר עכברים שעברו TBI.
2. טיפול ביום 1 (24-48 שעות לאחר תיוג האוזניים): הכינו תרשים לרישום תגי אוזניים, תאריך לידה, תאריכי טיפול, משקל בעלי חיים בימי הטיפול, משך הטיפול ומקטע להערות ותצפיות.
3. מספל בעדינות את החיה בשתי הידיים. אל תתפסו את החיה בזנבו כפי שהיא מעוררת מנגנוני הגנה ותגובת דחק.
4. בדוק ותעד את. תג האוזן של בעל החיים
5. מניחים את החיה במיכל על קנה המידה במשקל ולהקליט את המשקל.
6. בעדינות ספל את החיה עם שתי הידיים שוב ולטפל בו 1 דקות, ומאפשר לו לנוע ולחקור בתוך הידיים. לבצע את זה על ספסל בחדר השגרה ולהיזהר לא להפיל את החיה על הרצפה.
7. לאחר 1 דקות של טיפול, למקם את החיה בכלוב שלו.
8. חזור על שלבים 1.3 ל-1.7 עבור שאר החיות בכלוב.
9. הטיפול ביום 2 (למחרת): חזור על שלבים 1.2-1.5.
10. בעדינות ספל את החיה עם שתי הידיים שוב ולטפל בו 2 דקות, ומאפשר לו לנוע ולחקור בתוך הידיים. לבצע את זה על ספסל בחדר השגרה ולהיזהר לא להפיל את החיה על הרצפה.
11. לאחר 2 דקות של טיפול, מניחים את החיה חזרה בכלוב.
12. חזרו על שלבים 1.10-1.11 עבור שאר החיות בכלוב.
13. הטיפול ביום 3 (למחרת): חזור על שלבים 1.2-1.5.
14. בעדינות ספל החיה עם שתי הידיים שוב ולטפל בו 4 דקות, ומאפשר לו לנוע ולחקור בתוך הידיים. לבצע את זה על ספסל בחדר השגרה ולהיזהר לא להפיל את החיה על הרצפה.
15. לאחר 4 דקות של טיפול, מניחים את החיה חזרה בכלוב.
16. חזרו על צעדים 1.14-1.15 לבעלי החיים האחרים בכלוב.
17. הטיפול ביום 4 (יום בקרה, 1 שבוע מטיפול יום 1): חזור על שלבים 1.2-1.5.
18. בעדינות ספל החיה עם שתי הידיים שוב ולטפל בו 4 דקות, ומאפשר לו לנוע ולחקור בתוך הידיים. לבצע את זה על ספסל בחדר השגרה ולהיזהר לא להפיל את החיה על הרצפה.
19. לאחר 4 דקות טיפול, למקם את החיה חזרה בכלוב שלו.
20. חזור על שלבים 1.18-1.19 עבור שאר החיות בכלוב.
    הערה: יום טיפול הבקרה מבחן את שימור ההתנהגות הרגועה לאחר פרוטוקול טיפול בן שלושה ימים.

2. הליך ירידה במשקל

1. מניחים את העכבר בתא אינדוקציה. הגדר את זרימת החמצן והוואקום הן ל-1 ל/דקה והן לרמת הגז של isofלוריאן ל-3%-5%. . לפני 5 דקות
2. להסיר את העכבר מן התא אינדוקציה ולמקם אותו על משטח קצף. בדיקת העדר תגובה לבוהן או לצביטה בזנב.
3. לנהל משכך כאבים (0.1 מ"ג/ק"ג בופרינורין) תת-עורי. אם ניתוח EEG מבוצע באותו היום, לנהל את בופרנורפין תת-עורי בשילוב עם carprofen שאינם סטרואידיות אנטי דלקתיות (5 מ"ג/ק"ג).
4. ניהול תמיסת נתרן לקטט (3 μL לכל גרם של משקל החיה) תת-עורי לפני או אחרי הפגיעה האחרונה. פתרון הנתרן לקטט יכול להיות מעורב עם משככי כאבים לניהול מהיר בזריקה אחת.
   הערה: תמיסת נתרן לקטט מכילה תערובת של נתרן כלוריד, אשלגן כלורי, סידן כלוריד, נתרן לקטט במים. שלב זה מסייע להחלפת נוזלים ואלקטרוליטים, ומסייע להחלמה.
5. מקמו את ראשו של העכבר מתחת לצינור השחרור במשקל (איור 1א) ומניחים דיסק נירוסטה שטוח (1.3 ס"מ קוטר, 1 מ"מ עובי, ו 880 mg משקל) במרכז הראש, בין קו העיניים והאוזניים.
   הערה: דיסק זה מפזר את ההשפעה על פני השטח של הגולגולת (איור 1B).
6. להסיר את הסיכה בצינור ירידה במשקל כדי לשחרר את המוט 100 g במשקל מגובה 50 ס"מ. כדי לגרום לפציעה המזויף עבור עכברים בקרת, להסיר את המוט משקל מהצינור כדי למנוע שחרור בשוגג של הסיכה ואת ירידה במשקל.
   הערה: הראש של בעל החיים חייב להיות ממוקם שטוח, כך מוט חופשי נופל על פני השטח כולו של הדיסק.
7. מניחים את החיה התת-מודע על גבו להתאוששות על משטח חימום מכוסה מגבת ספיגה מרופדת וסטרילית. הזמן התאוששות רפלקס מחמיר (כלומר, הזמן שלוקח את העכבר לימין עצמו מגבו) ניתן למדוד כבדיקה עבור הזמן המושקע בחוסר הכרה.
8. כאשר החיה לחזור להכרה, מניחים אותו בכלוב נקי כי כבר מחומם על כרית חימום, עם ג'ל שחזור וכמה חתיכות הלחלח להתאושש עבור 45 דקות. ודא שיש מספיק פסולת כדי שהכלוב לא יהיה מחומם מדי. התחממות יתר החיה יכולה להוכיח בדיוק כמו מכשול התאוששות כמו מאפשר לעכבר להיות קר מדי.
9. לאחר 45 דקות, חזור על שלבים 2.1-2.8 פעמיים, תוך השמטת שלב 2.3 (כלומר, ניהול משככי כאבים ותרופות אנטי דלקתיות).
10. הרשו לבעלי החיים להתאושש 1 עד 2 h אם ניתוח ה השרשה של EEG מבוצע באותו יום.

3. הכנת שדה כירורגי לשרשה של אלקטרודות EEG

הערה: אוטוקלב את כלי הניתוח והברגים לפני הניתוח. נקו את כפפות הניתוח על ידי ריסוס ושפשוף עם 70% אתנול לפני ואחרי נגיעה בבעלי חיים, חומרים לא סטריליים, ובין טיפול בבעלי חיים. מעקר את כלי הניתוח ל -2-3 דקות בתוך העיקור (ראה טבלת חומרים) בין בעלי חיים. לפני הצבת חיה חדשה. במנגנון הסטרטקטיק ודא שהשדה הכירורגי מכיל את כל הרכיבים הנחוצים לניתוח (איור 2). העדר הליך כירורגי פולשני כדי לגרום TBI במודל זה יש כמה יתרונות: 1) השרשה של האלקטרודות הוא גמיש יכול להתבצע באותו יום כמו TBI או לאחר פרק זמן מוגדר; 2) זמן ההחלמה של בעל החיים הוא מהיר יותר; 3) הגולגולת נותרה שלמה, ומאפשרת יותר שטח וגמישות לנטיעת אלקטרודות.

1. . בחדר אינדוקציה במשך 5 דקות
2. העבר את העכבר מחדר אינדוקציה למנגנון סטריאוטקטיקה ומניחים אותו על העטוף סטרילי על משטח חימום עם גז isof, שפופרות ואקום מחובר לקונוס האף.
3. שמרו על טמפרטורת הגוף ב-37 ° c במהלך הניתוח. מניחים את חיישן הטמפרטורה כך שהוא יוצר קשר עם החזה או קיר הבטן של העכבר.
4. תקן את ראשו של בעל החיים במקום באמצעות פסי האוזן.
5. שמרו על ההרדמה ב-1.5%-3.5% לערך או בשעה ~ 60 נשימות/דקות במישור הכירורגי (ללא תגובה לבוהן או לצביטה בזנב).
6. החילו משחת עיניים על עיני החיה כדי לשמור עליהם משומנים במהלך הניתוח.
7. לנהל תערובת של משככי כאבים (0.1 mg/ק"ג בופרנורפין) ואת התרופה שאינה סטרואידיות אנטי דלקתיות (5 מ"ג/ק"ג carprofen) בזריקה אחת תת-עורי אלא אם כן התבצע מוקדם יותר במהלך היום, ובמקרה כזה החיה כבר קיבלה משככי כאבים ואנטי-דלקות.
   הערה: בופראורפין צריך להיות מנוהל שוב אם הזמן בין ניתוח המיקום הראשון TBI ו EEG עולה 8 h או אם בעל החיים מציג סימנים של כאב 8 h לאחר המינהל הראשון, אבל זה צריך להינתן ללא תוספת של carprofen.
8. ניהול תמיסת נתרן לקטט (3 μL לכל גרם של משקל החיה) תת-עורי להחליף נוזלים ואלקטרוליטים בבעלי חיים.
   הערה: אם מבוצעת ניתוח מיד לאחר ה-TBI, שלב זה חייב להיות מתוזמן כראוי. תמיסת נתרן לקטט צריך להיות מנוהל כל 2 h בעוד בעל החיים עובר את ההליכים ופעם אחרי הניתוח, 2 h מן הזריקה הקודמת.
9. להסיר את השיער מן הקרקפת באמצעות קרם להסרת שיער.
10. לפני ביצוע החתך, לחטא את העור של הקרקפת עם povidone-יוד הפתרון חיטוי כירורגי ו 70% אתנול לסירוגין משטחי עם תחבושות גזה סטרילית בתנועה מעגלית 3x (20 s לכל פתרון בכל פעם).
11. באמצעות אזמל, לעשות חתך rostral-caudal על קו האמצע של הקרקפת מעבר לעיניים אל גב הראש. שיטה זו של פתיחת הקרקפת מועדף על חיתוך הקרקפת, כמו מדפים העור ניתן לאטום מעל או סביב EEG-cap מתן יציבות יותר.
    הערה: בעת הכנת הגולגולת עבור השרשה של 3-EEG הר, חיתוך הקרקפת נדרש, כמו בגודל של הר הראש לא יאפשר סגירה של מדפים העור מעל הר הראש.
12. הרחב את אזור החיתוך על-ידי החלת הומוסטטיסטיקה קטנים על גבולות העור הפתוח. אם מתרחשת דימום כלשהו לאחר החתך, נקי עם גזה כותנה סטרילית או ספוגית.
13. הסר בעדינות את הקרום (כלומר, הקרום הדק מעל עצם הגולגולת) עם להב אזמל. אם מתרחש דימום כלשהו במהלך שלב זה, לחץ על אתר הדימום באמצעות ספוגית כותנה סטרילית עד שייעצר.
14. השתמש משטחי כותנה סטרילי לנקות את הגולגולת עם חמצן מימן, אבל להימנע מלגעת רקמות רכות סביב אזור הגולגולת חשוף. חזרו על שלב זה עד לניקוי הגולגולת מכל רקמה רכה ומראה לבנבן.
15. ייבש את הגולגולת עם. גזה סטרילית או ספוגית כותנה
    הערה: שלבים 3.12-3.15 חשובים לקיבוע הנכון של האלקטרודות והשיניים בצמנט. כל רקמה רכה, דימום לא מעורער, ופסולת יכול לגרום לזיהום, הקיבעון הראש לא יציב, מעוות או חסר האות, ואובדן של השתל בתוך מספר ימים או שבועות לאחר הניתוח.

4. מיקום אלקטרודה

1. שתל את ה-EEG היחיד (1EEG) כותרת הערוץ.
   הערה: קיצורים בקואורדינטות הסטריאוטקטיקה מייצגים קשרים מרחביים ומציינים את המרחק במילימטרים של המטרה מהמגמה בכיוון מסוים על ראש החיה: האחורי הקדמי (AP) והמדילי-לרוחב (ML). הדבר אינו ישים בפרוטוקול זה משום שהאלקטרודות ממוקמות לתוך החלל האפידורל ולא במבנה מסוים בתוך המוח (איור 3). וין + הוא אלקטרודה פעילה ווין-הוא התייחסות האלקטרודה שלה.
   1. השתמש מקדחה במהירות גבוהה עם סיבית פלדה (0.5 מ"מ, עגול, 1/4 בתוך.) ב ~ 5000-6000 סיבובים לדקה (rpm) כדי ליצור שישה חורים בגולגולת (שלושה עבור ברגים יציבות ושלושה אלקטרודות) באמצעות קואורדינטות סטריאוטקטיקה שסופקו¹². עבור שני ברגים קדמי: AP = + 1.5 מ"מ, ML = ± 1.5 mm; עבור הבורג האחורי האחד: AP =-5.2 מ"מ, ML =-1.5 מ"מ; עבור האלקטרודה הקרקעית: AP =-5.2 מ"מ, ML = + 1.5 מ"מ; עבור אלקטרודות ההקלטה: AP =-2.3 מ"מ, ML = ± 2.7 mm, עם וין + לימין ווין-שמאלה.
   2. הוסף שלושה ברגים ליציבות משופרת של השלב הראשי. באמצעות מברג, הפעל את הברגים 1-1.5 x כל אחד להיות קבוע בצורה בלתי נשכח בגולגולת.
      הערה: הצבת הברגים עמוק יותר תגרום נזק למוח.
   3. הכנס את הר EEG לתוך זרוע של מחזיק סטריאוטקטיקה ומקם את הר הראש כך ששלושת האלקטרודות ממוקמות לאורך קו האמצע הגולגולתית. בתצורה זו את הקרקע האלקטרודה ואת הפתיחה המתאימה שלה על גבי הר הראש הוא בגב, האלקטרודה וין + באמצע, ו-האלקטרודה ווין בחזית. ניתן לעשות סימון על הר הראש עם סמן קבוע.
   4. לכופף את כל האלקטרודה 90 °, כך הסוף של כל חוט הוא כפוף כלפי מטה והוא ממוקם מעל חור הגולגולת המקביל. לאחר מכן, למדוד את אורך 1 מ"מ של החלק של החוט הניצב כעת לחור בגולגולת לקצץ את עודף (איור 3). זה יבטיח הצבת אפידורל. של האלקטרודות האלקטרודות אמורות להיות בקושי. נוגעות במשטח הדורא
   5. הנמך את הראש וכוונן את כל שלושת האלקטרודות שיתאימו לחור הגולגולת המתאים. עבור הקלטה אפידורל, האלקטרודות חייב להיות ממוקם מעל או בקושי לגעת מאטר דורא.
   6. הכנת מלט שיניים ליישום על ידי ערבוב של 1/2 סקופ של אבקה עם מספר טיפות של ממס. השתמשו במרית ערבוב ומערבבים עד שהתערובת הסופית היא המרק, הדביק אך מחושל, ונוקשה מספיק כדי לדחוס כראוי כאשר מניחים על הגולגולת של בעל החיים.
   7. החלת תערובת בטון שיניים המכסה את כל הברגים והאלקטרודות ולחכות ~ 3 עד 5 דקות על זה כדי לגבש. הקפידו לא לכסות את המעמד הפלסטי במלט שיניים, כי זה יהיה בלתי אפשרי לחבר את החיה לקומוטטור עם קשר.
   8. שחררו את החומרים המחזיקים את מדפים העור וסגרו את החתך על ידי חיבור מדפים סביב המעמד הפלסטי. החלת מספר טיפות של דבק רקמה (ראה טבלת חומרים) כדי לאטום את מדפים העור.
   9. החלת חומר חיטוי כלורהקדין לאזור סביב השתל כדי למנוע זיהום. אם בעל החיים הוא תחת הרדמה עבור יותר מ 2 h לאחר ההזרקה הקודמת של תמיסת נתרן לקטט, נתון במהלך אינדוקציה TBI, ניהול אחר הזרקה תת-עורי. כדי לשמור על הידרציה נכונה של בעל החיים, חזור על הזריקה כל 2 h כי החיה מבלה בהרדמה.
   10. לאחר הניתוח, לתת הזרקה סופית של תמיסת נתרן לקטט 2 h לאחר הזריקה הקודמת. אם הניתוח הוא פחות מ 2 שעות, לנהל את מינון ההתאוששות הסופי של תמיסת נתרן לקטט 2 h מן הזריקה הראשונה.
   11. הסר את בעל החיים ממנגנון הסטריאוטקטיקה וממד את משקלו של בעל החיים לאחר ניתוח EEG כהתייחסות לניטור עתידי. בשל השתל, משקלו של בעל החיים יהיה גדול יותר מאשר לפני הניתוח.
   12. מניחים את החיה בכלוב נקי על משטח חימום חם להחלמה.
2. שתל את שני EEG ו-EMG אחד (2EEG/1EMG) ערוצים ראש.
   1. השתמשו בברגמה כנקודת ציון למיקום של הר הראש. החל כמות קטנה של דבק רקמות (ראה טבלת חומרים) לצדו התחתון של הר הראש 2EEG/1emg, הימנעות ארבעה חורים בורג ומניחים את הכותרת 2EEG/1emg על פני הגולגולת.
      הערה: אין קואורדינטות ספציפיות למיקום של הר הראש הזה. הר הראש הוא 8 מ"מ אורך ו 5 מילימטר רחב, אשר מכסה את רוב משטח הגולגולת. מיקום הראש עם הקצה הקדמי ͂ 3.0 מ"מ הקדמי של ברז הוא אופטימלי ומספק איכות האות טוב. מיקום ידני מהיר הכרחי לפני ירידה של מרפא דבק רקמות. לאפשר כ 5 דקות לדבק רקמות לרפא לחלוטין.
   2. השתמש במחט סטרילית 23 G כדי ליצור חורים טייס עבור ברגים דרך ארבעת הפתחים בראש ההר. כדי להשיג זאת, בעדינות לדחוף את המחט לאט לסובב עד קצה המחט חודר לגולגולת מבלי לפגוע במוח. הסירו את כל הדימום מחורי הטייס בעזרת ספוגית כותנה סטרילית.
   3. הכנס את 0.10 ברגים בחורי הטייס וסובב אותם עד שכל אחד מהם יתוקן בתוך הגולגולת. זה יכול להיות עד למחצית אורך הבורג, אבל לא את האורך המלא, כי זה יגרום לנזק בקרום המוח והקליפה. אם הר הראש ממוקם כך יש פער בין משטח הגולגולת ואת הקצה האחורי של הראש להשתמש בשני 0.12 ברגים בחלק האחורי.
   4. הפוך את הפתח הקטן בצידי הנרתיק של שני המרכיבים (האפוקסי הכסוף) למארז התאום. קחו מרית דו צדדית והשתמשו בכל צד כדי לגרוף סכום קטן ושווה של כל רכיב מהתיק וערבבו אותם יחד. השתמש רק כמות קטנה מספיקה עבור ניתוח יחיד, כי התערובת מתגבש בתוך 20 דקות. לאטום את צדי הנרתיק כדי למנוע ייבוש.
      הערה: האפוקסי הכסוף מאפשר מגע חשמלי תקין בין הבורג לראש הכותרת ומגביר את יציבות הברגים.
   5. החל כמות קטנה של התערובת הזאת בין חור הברגה לבין הבורג, ולאחר מכן הדק כל בורג עד שראשו מונח על בסיס השתל. ודא שאין אפוקסי כסוף יוצר קשר בין שני הברגים מכיוון שכל בורג משמש כאלקטרודה בודדת, כדי להבטיח אות מדויק, אין ליצור קשר עם הבורג השני.
   6. אם תערובת האפוקסי הכסוף הייתה במקומה, יש חלון זמן שניות להוציא בזהירות את העודף כדי להפריד את החיבור. לכופף בזהירות את EMG מוביל מהקצה האחורי של הר הראש כדי לעקוב אחר המתאר של ראשו של בעל החיים וצווארו, ולאחר מכן להכניס אותם השרירים הקרה.
   7. הכנת מלט שיניים ליישום על ידי ערבוב של 1/2 סקופ של אבקה עם מספר טיפות של ממס. השתמשו במרית ערבוב ומערבבים עד שהתערובת הסופית היא המרק, הדביק אך מחושל, ונוקשה מספיק כדי לדחוס כראוי כאשר מניחים על הגולגולת של בעל החיים.
   8. החלת תערובת המלט שיניים המכסה את הראש כולו תוך הימנעות כיסוי החורים שישה פינים, כמו זה יהפוך את זה בלתי אפשרי לחבר את מגבר טרום. המתן ~ 3 עד 5 דקות עבור מלט לגבש. ודא כי העור אינו חתום על הר הראש עם מלט שיניים.
   9. שחררו את החומרים המחזיקים את מדפים העור וסגרו את החתך על ידי חיבור מדפים סביב המעמד הפלסטי. החלת מספר טיפות של דבק רקמה כדי לאטום את מדפים העור.
      הערה: אם חתך העור נעשה זמן רב יותר כדי לאפשר יישור של מוביל חוט EMG, העור יכול להיות אטום עם דבק רקמה או משמים. איטום העור עם דבק רקמה מספיקה בדרך כלל. עם זאת, אם במהלך פתיחת ניטור לאחר הניתוח של החתך הוא נצפתה, תפרים מומלצים במקום.
   10. החלת חומר חיטוי כלורהקדין לאזור סביב השתל כדי למנוע זיהום. ניהול תמיסת נתרן לקטט (3 μL לכל גרם של משקל החיה) תת-עורי להחליף נוזלים ואלקטרוליטים אם בעל החיים הוא תחת הרדמה עבור יותר מ 2 h לאחר הזריקה הקודמת.
   11. הסר את בעל החיים ממנגנון הסטריאוטקטיקה וממד את משקלו של בעל החיים לאחר ניתוח EEG כהתייחסות לניטור עתידי. בשל השתל, משקלו של בעל החיים יהיה גדול יותר מאשר לפני הניתוח.
   12. מניחים את בעל החיים בכלוב נקי על משטח חימום חם, עם ג'ל להחלמה ומספר חתיכות של לחלח להחלמה.
3. שתל שלושה ערוצי EEG (3EEG) ראש.
   1. השתמש מקדחה במהירות גבוהה עם סיבית פלדה (0.5 מ"מ, עגול, 1/4) ב ~ 5000-6000 סל ד כדי ליצור שישה חורים בגולגולת (שלושה עבור ברגים יציבות שלושה עבור אלקטרודות) באמצעות קואורדינטות סטריאוטקטיקה שסופקו¹². עבור קרקע והתייחסות משותפת עבור EEG1 ו-EEG2: AP = 5.2 מ"מ, ML = ± 1.5 mm; עבור EEG1 ו EEG2: AP =-3.0 מ"מ, ML = ± 3.0 mm; עבור EEG3 עצמאי: AP =-1.4 מ"מ, ML = ± 1.5 mm.
   2. הניחו את ששת אלקטרודות הברגים לתוך חורי הגולגולת.
      הערה: הצבת הברגים עמוק יותר תיצור נזק משמעותי למוח. אלקטרודות בורג מספקות יציבות טובה יותר של הר הראש.
   3. הכנת מלט שיניים ליישום על ידי ערבוב של 1/2 סקופ של אבקה עם מספר טיפות של ממס. השתמשו במרית ערבוב ומערבבים עד שהתערובת הסופית היא המרק, הדביק אך מחושל, ונוקשה מספיק כדי לדחוס כראוי כאשר מניחים על הגולגולת של בעל החיים.
   4. החלת תערובת בטון שיניים המכסה את המשטח החשוף כולו של הגולגולת וכל אלקטרודה בורג. ודא כי העור אינו חתום על הר הראש עם מלט שיניים. המתן ~ 1-2 דקות עבור מלט לחזק במקצת. אין צורך להמתין עד למיצוק מלא לפני שתמשיך לשלב הבא.
   5. תדליק את ברזל ההלחמה. כדי לחמם אותו הצב את ראש הדור השלישי בזרוע של בעל סטרטקטיקה.
      הערה: הצב את הר הכיוון כך שששת מיקומי העופרת בחוט יתאימו למיקום החוט המוביל של כל אלקטרודה בורג.
   6. הנמך את הראש כך שהחלק הגייתי שלו מונח על גבי מלט שיניים.
   7. סובב את התיל של כל הפניה מכל אחד מאלקטרודות הברגים עם קצה חוט התיל המתאים של הר הראש.
      הערה: הפיכת מוביל התיל השגוי תגרום לפענוח נתונים מורכב או בלתי אפשרי.
   8. חתוך בזהירות את החוט העודף באמצעות מספריים. הלחמה כל זוג חוט מעוות. בשביל הולכה האות הנכון
      הערה: כל זוג חוטים חייבים ליצור מגע עם זוג אחר, אחרת איכות האות ופענוח הנתונים יהיו בסכנה.
   9. כופף כל זוג מולחם של חוט מוביל סביב הר הראש, הימנעות קשר בין זוג.
      הערה: אם החוט המוביל לא נחתך מספיק קצר זה יכול להיות קשה לכופף אותם סביב הר הראש בלי לגעת בחוט אחר. במקרה זה, לכופף זוג אחד קודם, לכסות את זה עם תערובת בטון שיניים, לחכות ~ 1-2 דקות כדי לגבש, ולאחר מכן להמשיך עם הזוג הבא באותה צורה.
   10. סיים לכסות את כל החוט עם בטון דנטלי עוזב רק את החלק השחור של הר הראש חשוף.
       הערה: להיזהר לא להחיל כל אבקת בטון שיניים או תערובת לראש החלק החשוף של הכותרת כמו כל פסולת או מלט בחורים יחסום את הקשר ויוביל להיעדרות האות או רעש.
   11. שחררו את הדימום. מחזיק את מדפים העור החלת חומר חיטוי כלורהקדין לאזור סביב השתל כדי למנוע זיהום.
   12. ניהול תמיסת נתרן לקטט (3 μL לכל גרם של משקל החיה) תת-עורי להחליף נוזלים ואלקטרוליטים אם בעל החיים היה תחת הרדמה במשך יותר מ 2 h לאחר הזריקה הקודמת.
   13. הסר את בעל החיים ממנגנון הסטריאוטקטיקה וממד את משקלו של בעל החיים לאחר ניתוח EEG כהתייחסות לניטור עתידי. בשל השתל, משקלו של בעל החיים יהיה גדול יותר מאשר לפני הניתוח.
   14. מניחים את בעל החיים בכלוב נקי על משטח חימום חם, עם ג'ל להחלמה ומספר חתיכות של לחלח להחלמה.
       הערה: מי חמצן מימן מסייע בהסרת כל הרקמה הרכה הנותרים מן הגולגולת.

5. חיבור בעלי חיים למערכת הרכישה

1. ספל את בעל החיים בשתי הידיים כדי להסירו מכלוב הרכישה ולהעבירו לאזור נקי עם משטח שטוח, כמו למשל תחנת העברת בעלי חיים (ATS).
2. בעדינות לתפוס את העכבר על ידי העור של גבו. אל תתפסו את החיה בזנבו, כי זה גורם למצוקה.
3. לזהות את הפתיחה ב-EEG ראש המתאים אלקטרודה הקרקע ולהתאים את הסיכה המתאימה של הקשר לחיבור הנכון.
   הערה: חיבור הפוך מהקומוטטור לראש החיה יביא לקריאה שונה מהאלקטרודות ומצורות הגל המעוותות.
4. החזר את בעל החיים אל כלוב הרכישה וחבר את הקצה השני של החבל (EEG System 1) או טרום מגבר (EEG System 2) אל הקומוטטור.
   הערה: בעת חיבור הקדם-מגבר (EEG System 2) אל החבל מפני הקומוטטור, התאימו את הסימנים הלבנים בקצות שני הקצוות. חיבור הפוך יגרום נזק תמידי של המגבר ודורש תיקונים על ידי היצרן, אשר יקרים.
5. סובב בעדינות את הקשר בין בעל החיים לקומוטטור כדי להבטיח שמנגנון פועל כראוי והחיה יכולה לנוע בחופשיות.

6. הגדרות רכישת נתוני EEG

1. הגדר פרמטרים של רכישת מערכת EEG.
   1. קבע קצב דגימה ל-500 Hz; להרוויח 5,000; מצב נורמה 35 Hz; . בסדר. הגדר מסנן מעבר גבוה ל-0.5 Hz.
      הערה: 100 הרץ (מעבר נמוך) מובנה ואינו מחייב קלט ידני.
2. הגדר פרמטרים לרכישה של מערכת EEG.
   1. קבע קצב דגימה ל-600 Hz; יחידות פרה להרוויח 100; להשיג 1 (EEG1, 2). הגדר מסנן מעבר נמוך ל-100 Hz.
      הערה: 1 הרץ (מעבר גבוה) מובנה ואינו מחייב קלט ידני.

7. הגדרות רכישת נתוני וידאו

1. הגדר פרמטרי רכישה עבור מערכת EEG 1.
   הערה: יש צורך במערכת רכישת וידאו של צד שלישי לקבלת נתוני וידאו בו.
   1. קבע קצב מסגרות בין 15 (מינימום מומלץ) ו-30 (מקסימום זמין) לאיכות וידאו מתאימה. הגדר את הרזולוציה ל640 x 640 פיקסלים. הגדר סוג דחיסה ל-H. 264H.
2. הגדר פרמטרי רכישה עבור מערכת EEG 2.
   הערה: מערכת EEG זו מציעה מערכת וידאו ותוכנה אשר מסנכרנים וידאו ונתוני EEG יחד בקובץ יחיד עד ארבע בעלי חיים (ראו טבלת חומרים).
   1. קבע קצב מסגרות בין 15 (מינימום מומלץ) ו-30 (מקסימום זמין) לאיכות וידאו מתאימה. הגדר את הרזולוציה ל640 x 480 פיקסלים. הגדר את סוג הדחיסה בתבנית הקובץ WebM.

תוצאות

הפרוטוקול המתואר כאן מתאר את השיטה לאינדוקציה של פציעה מפוזרת בבידוד (למשל, בהעדר נגע מוקד) באמצעות מודל עכבר של TBI מפוזר חוזר ונשנה (איור 1). איור 1a מתאר את מכשיר הירידה במשקל ואת מרכיביו (איור 1א, a1-a5) משמש לאינדוקציה של tbi במ?...

Discussion

בניגוד CCI ו-FPI מודלים הגורם מיקוד או שילוב של פציעה מיקוד ומפוזר, המודל של TBI מפוזר חוזרים שתוארו בפרוטוקול זה מאפשר אינדוקציה של פציעה מפוזר בהעדר פגיעה במוח מוקד ואינו דורש פתחי הקרקפת או הגולגולת ואת הדלקת הקשורה. יתרון נוסף של היעדר כריתת הגולגולת במודל זה הוא שהוא מאפשר לא רק להשתיל את ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.10" screw	Pinnacle Technology Inc., KS, USA	8209	0.10 inch long stainless steel
0.10" screw	Pinnacle Technology Inc., KS, USA	8403	0.10 inch long with pre-soldered wire lead
0.12" screw	Pinnacle Technology Inc., KS, USA	8212	0.12 inch long stainless steel
1EEG headmount	Invitro1 (subsidiary of Plastics One), VA, USA	MS333/8-A/SPC	3 individually Teflon-insulated platinum iridium wire electrodes (twisted or untwisted, 0.005 inch diameter) extending below threaded plastic pedestal
2EEG/1EMG headmount	Pinnacle Technology Inc., KS, USA	8201	2EEG/1EMG channels
3% hydrogen peroxide			Pharmacy
3EEG headmount	Pinnacle Technology Inc., KS, USA	8235-SM-C	custom 6-Pin Connector for 3EEG channels
Buprenorphine	Par Pharmaceuticals, Cos. Inc., Spring Valley, NY, USA	060969
Buprenorphine	Par Pharmaceuticals, Cos. Inc., Spring Valley, NY, USA	060969
C57BL/6 mice	Harlan/Envigo Laboratories Inc		male, 12-16 weeks old
C57BL/6 mice	The Jackson Laboratory		male, 12-16 weeks old
Carprofen	Zoetis Services LLC, Parsippany, NJ, USA	026357	NOTE: this drug is added during weight drop only if stereotactic electrode implantation will be performed on the same day
Chlorhexidine antiseptic			Pharmacy
Dental cement and solvent kit	Stoelting Co., USA	51459
Drill	Foredom	HP4-917
Drill bit	Meisinger USA, LLC, USA	HM1-005-HP	0.5 mm, Round, 1/4, Steel
Dry sterilizer	Cellpoint Scientific, USA		Germinator 500
EEG System 1	Biopac Systems, CA, USA
EEG System 2	Pinnacle Technology Inc., KS, USA
Ethanol ≥70%	VWR, USA	71001-652	KOPTEC USP, Biotechnology Grade (140 Proof)
Eye ointment	Pro Labs Ltd, USA		Puralube Vet Ointment Sterile Ocular Lubricant available in general online stores and pharmacies
Fluriso liquid for inhalation anesthesia	MWI Veterinary Supply Co., USA	502017
Hair removal product	Church & Dwight Co., Inc., USA		Nair cream
Isoflurane	MWI Veterinary Supply Co., USA	502017
Povidone-iodine surgical solution	Purdue Products, USA	004677	Betadine
Rimadyl/Carprofen	Zoetis Services LLC, Parsippany, NJ, USA	026357
Solder			Harware store
Soldering iron	Weller, USA	WP35	ST7 tip, 0.8mm
Stainless steel disc			Custom made
Sterile cotton swabs
Sterile gauze pads	Fisher Scientific, USA	22362178
Sterile poly-lined absorbent towels pads	Cardinal Health, USA	3520
Tissue adhesive	3M Animal Care Products, USA	1469SB