Induire l’épilepsie post-traumatique dans un modèle de souris de lésions cérébrales traumatiques diffuses répétitives

Résumé

Ce protocole systématique décrit un nouveau modèle animal de l’épilepsie post-traumatique après des dommages légers répétitifs de cerveau. La première partie détaille les étapes de l’induction des lésions cérébrales traumatiques à l’aide d’un modèle modifié de baisse de poids. La deuxième partie fournit des instructions sur l’approche chirurgicale pour les systèmes d’acquisition de données électroencéphalographiques à un seul et à plusieurs canaux.

Résumé

Les lésions cérébrales traumatiques (ITT) sont l’une des principales causes d’épilepsie acquise. TBI peut entraîner une lésion cérébrale focale ou diffuse. Les lésions focales sont le résultat de forces mécaniques directes, pénétrant parfois à travers le crâne, créant une lésion directe dans le tissu cérébral. Ceux-ci sont visibles pendant l’imagerie cérébrale comme zones avec la contusion, la cécité, et l’hémorragie. Les lésions focales induisent la mort neuronale et la formation de cicatrices gliales et sont présentes dans 20% -25% de toutes les personnes qui encourent un TBI. Cependant, dans la majorité des cas de TBI, les dommages sont provoqués par des forces d’accélération-décélération et le cisaillement suivant de tissu, ayant pour résultat des dommages non focals et diffus. Une sous-population de patients atteints de TBI continue de développer une épilepsie post-traumatique (TP) après une période de latence de mois ou d’années. Actuellement, il est impossible de prédire quels patients développeront le PTE, et les saisies dans les patients de PTE sont difficiles à commander, nécessitant davantage de recherche. Jusqu’à récemment, le champ était limité à seulement deux modèles d’animaux/rongeurs avec des saisies post-traumatiques spontanées validées, présentant toutes deux de grandes lésions focales avec la perte massive de tissu dans le cortex et parfois les structures subcorticales. Contrairement à ces approches, il a été déterminé que le TBI diffus induit à l’aide d’un modèle modifié de baisse de poids est suffisant pour initier le développement des saisies convulsives spontanées et non convulsives, même en l’absence de lésions focales ou de perte de tissu. Semblable aux patients humains présentant l’épilepsie post-traumatique acquise, ce modèle présente avec une période de latence après des dommages avant le début de saisie. Dans ce protocole, la communauté recevra un nouveau modèle d’épilepsie post-traumatique, détaillant comment induire le TBI diffus non-lésionnel suivi d’une surveillance continue à long terme des animaux vidéo-électroencéphalographiques au cours de plusieurs mois. Ce protocole détaillera la manipulation des animaux, la procédure de chute de poids, le placement d’électrodes pour deux systèmes d’acquisition, et les défis fréquents rencontrés pendant chacune des étapes de la chirurgie, de la surveillance postopératoire et de l’acquisition de données.

Introduction

Chaque année, l’ITC touche environ 60 millions de personnes dans le monde. Les personnes touchées sont plus à risque de développer une épilepsie, qui peut se manifester des années après la blessure initiale. Bien que les TBI graves soient associés à un risque plus élevé d’épilepsie, même l’ITC léger augmente le risque d’épilepsie d’une personne^1,2,3^,4. Tous les TBI peuvent être classés comme focaux, diffus ou une combinaison des deux. Les lésions cérébrales diffuses, présentes dans de nombreux, sinon tous les TCI, sont le résultat de tissus cérébraux de différentes densités de cisaillement les uns contre les autres en raison de l’accélération-décélération et des forces de rotation. Par définition, les dommages diffus se produit seulement dans l’isolement dans les dommages non-pénétrants doux/châtessifs de cerveau, dans lesquels aucune lésion de cerveau n’est visible sur des balayages de tomographie^{calculées 5.}

Il y a actuellement deux problèmes critiques dans la prise en charge des patients qui ont, ou sont à risque de développer, l’épilepsie post-traumatique (PTE). La première est qu’une fois que le PTE s’est manifesté, les convulsions sont résistantes aux médicaments antiépileptiques disponibles (DEA)⁶. Deuxièmement, les DEA sont également inefficaces pour prévenir l’épileptogénèse, et il n’existe pas d’approches thérapeutiques alternatives efficaces. Afin de combler ce déficit et de trouver de meilleures cibles thérapeutiques et des candidats pour le traitement, il sera nécessaire d’explorer de nouveaux mécanismes cellulaires et moléculaires à la racine de PTE⁶.

Une des caractéristiques principales de l’épilepsie post-traumatique est la période latente entre l’événement traumatique initial et le début des saisies spontanées, non provoquées, récurrentes. Les événements qui se produisent dans cette fenêtre temporelle sont un foyer naturel pour des chercheurs, parce que cette fenêtre de temps pourrait permettre le traitement et la prévention de PTE tout à fait. Les modèles animaux sont le plus couramment utilisés pour cette recherche parce qu’ils offrent plusieurs avantages distincts, dont le moindre n’est pas que la surveillance continue des patients humains serait à la fois peu pratique et coûteux sur de telles périodes potentiellement longues. En outre, les mécanismes cellulaires et moléculaires à la racine de l’épileptogenèse ne peuvent être explorés que dans les modèles animaux.

Les modèles animaux avec des crises post-traumatiques spontanées et l’épilepsie sont préférés aux modèles où les saisies sont induites après TBI par des moyens moins physiologiquement pertinents, tels que par des chimioconvulsants ou la stimulation électrique aigu, chronique, ou par l’allumeur. Les modèles post-traumatiques spontanés de saisie testent comment TBI modifie le réseau sain de cerveau menant à l’épileptogenèse. Les études utilisant la stimulation additionnelle après TBI évaluent comment l’exposition au TBI réduit le seuil de saisie et affecte la susceptibilité aux saisies. Les avantages des modèles animaux avec des saisies induites chimiquement ou avec la stimulation électrique sont en testant les mécanismes spécifiques de réfractaire aux DEA et l’efficacité des DEA existants et nouveaux. Pourtant, le degré de pertinence et de traduction de ces données à l’homme peut être ambigu⁷ en raison de ce qui suit: 1) les mécanismes de saisie peuvent être différents de ceux induits par TBI seul; 2) tous ces modèles ne conduisent pas à des crises spontanées⁷; 3) les lésions créées par l’agent convulsif lui-même, avec la canule requise pour sa livraison, ou en stimulant le placement d’électrodes dans les structures de profondeur (par exemple, l’hippocampe ou l’amygdale) peuvent déjà causer une susceptibilité accrue de saisie et même des potentiels épileptiformes hippocampiformes de champ^7. En outre, certains agents convulsivants (c.-à-d., acide kainique) produisent des lésions hippocampales directes et la sclérose, qui n’est pas typique après TBI diffus.

Jusqu’à récemment, il n’existait que deux modèles animaux d’épilepsie post-traumatique : l’impact cortical contrôlé (ICC, focal) ou les blessures par percussion selle fluide (FPI, focale et diffuse)⁸. Les deux modèles ont comme conséquence de grandes lésions focales à côté de la perte de tissu, de l’hémorragie, et de la gliose dans les rongeurs^8. Ces modèles imitent l’épilepsie post-traumatique induite par de grandes lésions focales. Une étude récente a démontré que le TBI diffus répété (3x) est suffisant pour le développement des saisies spontanées et de l’épilepsie chez les souris même en l’absence des lésions focales^9,ajoutant un troisième modèle de PTE de rongeur avec des saisies récurrentes spontanées confirmées. Ce nouveau modèle imite les changements cellulaires et moléculaires induits par l’ITC diffuse, représentant mieux la population humaine avec des TBI légers et cisussifs. Dans ce modèle, la période latente de trois semaines ou plus avant l’apparition de la crise et l’émergence de crises tardives, spontanées et récurrentes permet d’étudier les causes profondes de l’épileptogenèse post-traumatique, de tester l’efficacité des approches préventives et de nouveaux candidats thérapeutiques après l’apparition de la crise, et a le potentiel pour le développement de biomarqueurs de l’épileptogénèse post-traumatique parce qu’environ la moitié des animaux développent une épilepsie post-traumatique.

Le choix du modèle animal pour l’étude de l’épilepsie post-traumatique dépend de la question scientifique, du type de lésions cérébrales étudiées et des outils qui seront utilisés pour déterminer les mécanismes cellulaires et moléculaires sous-jacents. En fin de compte, tout modèle d’épilepsie post-traumatique doit démontrer à la fois l’émergence de crises spontanées après TBI et une période de latence initiale dans un sous-ensemble d’animaux TBI, parce que pas tous les patients qui encourent un TBI continuer à développer l’épilepsie. Pour ce faire, l’électroencéphalographie (EEG) avec acquisition vidéo simultanée est utilisée dans ce protocole. Comprendre les aspects techniques qui sous-tendent le matériel et les approches d’acquisition de données est essentiel pour une interprétation précise des données. Les aspects matériels critiques comprennent le type de système d’enregistrement, le type d’électrodes (plomb visousé ou fil) et le matériel dont ils sont faits, l’acquisition vidéo synchronisée (dans le cadre du système EEG ou tiers), et les propriétés du système informatique. Il est impératif de définir les paramètres d’acquisition appropriés dans n’importe quel type de système en fonction de l’objectif de l’étude, des événements d’intérêt de l’EEG, de la méthode d’analyse plus poussée et de la durabilité du stockage des données. Enfin, la méthode de configuration des électrodes (montage) doit être envisagée, car chacune présente des avantages et des inconvénients et affectera l’interprétation des données.

Ce protocole détaille comment utiliser le modèle modifié de chute de poids de Marmarou^10,11 pour induire des dommages diffus ayant pour résultat des saisies spontanées, non provoquées, récurrentes chez les souris, décrit des approches chirurgicales pour acquérir un EEG continu et multicanal simple et multicanal, et l’EEG continu et synchronisé de vidéo utilisant le montage monopolaire, bipolaire, ou mélangé.

Protocole

Toutes les procédures animales décrites dans ce protocole ont été exécutées conformément au Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) de Virginia Tech et conformément au « Guide for the Care and Use of Laboratory Animals » des National Institutes of Health. .

1. Protocole de manipulation des animaux

REMARQUE : Ce protocole vise à s’habituer aux animaux commandés par un vendeur à l’installation après l’arrivée et à les conditionner à être manipulés par l’expérimentateur. Cela améliore le bien-être des animaux en réduisant le stress et l’anxiété et simplifie certaines procédures qui nécessitent la manipulation des animaux, y compris l’induire le TBI, la surveillance postopératoire, et la connexion de l’animal au système d’acquisition.

1. Lorsque de nombreux animaux sont reçus du vendeur, l’étiquette d’oreille et les assignent au hasard à un groupe expérimental (TBI) ou à un groupe témoin (chirurgie fictive) tout en les combinant dans des cages de 2 à 5 animaux. Les animaux de TBI de maison séparément des animaux faux parce que les souris de bidon agissent de temps en temps agressivement vers des souris qui ont subi TBI.
2. Manipulation du jour 1 (24 à 48 h après le marquage des oreilles) : Préparer un tableau pour l’enregistrement des étiquettes d’oreilles des animaux, la date de naissance, les dates de manipulation, le poids des animaux les jours de manipulation, la durée de la manipulation et une section pour les commentaires et les observations.
3. Coupez doucement l’animal à l’aide des deux mains. Ne saisissez pas l’animal par la queue car il induit des mécanismes de défense et une réponse au stress.
4. Vérifier et enregistrer l’étiquette d’oreille de l’animal.
5. Placez l’animal dans le récipient sur l’échelle de poids et enregistrez le poids.
6. Coupez doucement l’animal avec les deux mains à nouveau et manipulez-le pendant 1 min, lui permettant de se déplacer et d’explorer dans les mains. Effectuez ceci au-dessus d’un banc dans la salle d’intervention et faites attention de ne pas laisser tomber l’animal sur le plancher.
7. Après 1 min de manipulation, remettre l’animal dans sa cage.
8. Répétez les étapes 1.3-1.7 pour les autres animaux dans la cage.
9. Manipulation du jour 2 (le lendemain) : Répétez les étapes 1,2 à 1,5.
10. Coupez doucement l’animal avec les deux mains à nouveau et manipulez-le pendant 2 min, lui permettant de se déplacer et d’explorer dans les mains. Effectuez ceci au-dessus d’un banc dans la salle d’intervention et faites attention de ne pas laisser tomber l’animal sur le plancher.
11. Après 2 min de manipulation, remettre l’animal dans sa cage.
12. Répétez les étapes 1.10-1.11 pour les autres animaux dans la cage.
13. Manipulation du jour 3 (le lendemain) : Répétez les étapes 1,2 à 1,5.
14. Coupez doucement l’animal avec les deux mains à nouveau et manipulez-le pendant 4 min, lui permettant de se déplacer et d’explorer dans les mains. Effectuez ceci au-dessus d’un banc dans la salle d’intervention et faites attention de ne pas laisser tomber l’animal sur le plancher.
15. Après 4 min de manipulation, remettre l’animal dans sa cage.
16. Répétez les étapes 1.14-1.15 pour les autres animaux dans la cage.
17. Manipulation du jour 4 (jour de contrôle, 1 semaine à partir du jour de manutention 1) : Répétez les étapes 1.2-1.5.
18. Coupez doucement l’animal avec les deux mains à nouveau et manipulez-le pendant 4 min, lui permettant de se déplacer et d’explorer dans les mains. Effectuez ceci au-dessus d’un banc dans la salle d’intervention et faites attention de ne pas laisser tomber l’animal sur le plancher.
19. Après 4 min de manipulation, remettre l’animal dans sa cage.
20. Répétez les étapes 1.18-1.19 pour les autres animaux dans la cage.
    REMARQUE : Le jour de manipulation de commande teste la conservation du comportement calme après un protocole de manipulation de trois jours.

2. Procédure de chute de poids

1. Placer la souris dans une chambre d’induction. Définir le flux d’oxygène et de vide à la fois à 1 L/min et le niveau de gaz isoflurane à 3% à 5%. Anesthésiez la souris pendant 5 min.
2. Retirez la souris de la chambre d’induction et placez-la sur un tampon en mousse. Test ezif pour l’absence de réponse à un pincement à l’orteil ou à la queue.
3. Administrer un analgésique (0,1 mg/kg de buprénorphine) sous-cutané. Si la chirurgie de l’EEG est effectuée le même jour, administrer la buprénorphine sous-cutanée en combinaison avec le carprofène anti-inflammatoire non stéroïdien (5 mg/kg).
4. Administrer la solution de lactate de sodium (3 ll par gramme de poids de l’animal) sous-cutanée avant ou après le dernier impact. La solution de lactate de sodium peut être mélangée avec les analgésiques pour une administration rapide en une seule injection.
   REMARQUE : La solution de lactate de sodium contient un mélange de chlorure de sodium, de chlorure de potassium, de chlorure de calcium et de lactate de sodium dans l’eau. Cette étape aide à remplacer les fluides et les électrolytes, ce qui facilite la récupération.
5. Placez la tête de la souris sous le tube de chute de poids (Figure 1A) et placez un disque plat en acier inoxydable (1,3 cm de diamètre, 1 mm d’épaisseur et 880 mg de poids) au centre de la tête, entre la ligne des yeux et des oreilles.
   REMARQUE : Ce disque diffuse l’impact sur la surface du crâne (Figure 1B).
6. Retirez la goupille dans le tube de chute de poids pour libérer la tige de poids de 100 g d’une hauteur de 50 cm. Pour induire la blessure de faux pour les souris témoins, retirez la tige de poids du tube pour empêcher la libération accidentelle de la goupille et la baisse de poids.
   REMARQUE : La tête de l’animal doit être placée à plat, de sorte que la tige tombe librement sur toute la surface du disque.
7. Placez l’animal inconscient sur le dos pour la récupération sur un coussin chauffant recouvert d’une serviette absorbante polydoublée stérile. Le temps de récupération réflexe de redressement (c.-à-d., le temps qu’il prend la souris à droite elle-même de son dos) peut être mesuré comme une lecture pour le temps passé inconscient.
8. Lorsque l’animal reprend conscience, placez-le dans une cage propre qui a été réchauffée sur un coussin chauffant, avec du gel de récupération et quelques morceaux de chow humidifiés pour récupérer pendant 45 min. Assurez-vous qu’il y a suffisamment de litière pour que la cage ne soit pas surchauffée. La surchauffe de l’animal peut s’avérer tout aussi grand obstacle à la récupération que de permettre à la souris de devenir trop froide.
9. Après 45 min, répétez les étapes 2,1 à 2,8 deux fois, en omettant l’étape 2.3 (c.-à-d. l’administration d’analgésiques et d’anti-inflammatoires).
10. Permettre aux animaux de récupérer pendant 1 h et 2 h si la chirurgie d’implantation d’électrodes EEG est effectuée le même jour.

3. Préparation chirurgicale sur le terrain pour l’implantation d’électrodes EEG

REMARQUE : Autoclave zona les outils chirurgicaux et les vis avant la chirurgie. Nettoyez les gants chirurgicaux en pulvérisant et en frottant avec 70 % d’éthanol avant et après avoir touché l’animal, les matériaux non stériles et entre la manipulation des animaux. Stériliser les outils chirurgicaux pendant 2 à 3 min dans le stérilisateur de perles (voir Tableau des matériaux) entre les animaux. Changez le drapé stérile avant de placer un nouvel animal dans l’appareil stéréotaxique. S’assurer que le champ chirurgical contient tous les composants nécessaires à la chirurgie (Figure 2). L’absence d’une intervention chirurgicale invasive pour induire le TBI dans ce modèle présente plusieurs avantages : 1) l’implantation des électrodes est flexible et peut être effectuée le même jour que le TBI ou après une période de temps définie; 2) le temps de récupération de l’animal est plus rapide; 3) le crâne reste intact, permettant plus de surface et de flexibilité pour implanter des électrodes.

1. Anesthésiez la souris en gaz isoflurane de 3 % à 5 % dans une chambre à induction pendant 5 min.
2. Transférer la souris de la chambre d’induction à l’appareil stéréotaxique et la placer sur un drapé stérile sur un coussin chauffant avec du gaz isoflurane et des tubes à vide reliés au cône du nez.
3. Maintenir la température corporelle à 37 oC au cours de la chirurgie. Placez le capteur de température de sorte qu’il entre en contact avec la poitrine ou la paroi abdominale de la souris.
4. Fixer la tête de l’animal en place à l’aide des barres d’oreilles.
5. Maintenir l’anesthésie à 1,5 % à 3,5 % d’isoflurane ou à 60 respirations/min dans l’avion chirurgical (sans réponse à l’orteil ou au pincement de la queue).
6. Appliquez une pommade pour les yeux de l’animal pour les garder lubrifiés tout au long de la chirurgie.
7. Administrer un mélange d’analgésiques (0,1 mg/kg de buprénorphine) et de l’anti-inflammatoire non stéroïdien (5 mg/kg de carprofène) en une seule injection sous-cutanée à moins que le TBI n’ait été effectué plus tôt dans la journée, auquel cas l’animal a déjà reçu des analgésiques et des anti-inflammatoires.
   REMARQUE: Buprenorphine doit être administré à nouveau si le temps entre la première chirurgie de placement TBI et EEG dépasse 8 h ou si l’animal affiche des signes de douleur 8 h après la première administration, mais il doit être donné sans l’ajout de carprofène.
8. Administrer la solution de lactate de sodium (3 ll par gramme du poids de l’animal) sous-cutanée pour remplacer les liquides et les électrolytes chez l’animal.
   REMARQUE : Si la chirurgie est effectuée immédiatement après le TBI, cette étape doit être chronométrée correctement. La solution de lactate de sodium doit être administrée tous les 2 h pendant que l’animal subit les procédures et une fois après la chirurgie, 2 h de l’injection précédente.
9. Retirer les cheveux du cuir chevelu à l’aide d’une crème d’épilation.
10. Avant de faire l’incision, désinfecter la peau du cuir chevelu avec la solution antiseptique chirurgicale povidone-iode et 70% d’éthanol en alternant les écouvillons avec des tampons de gaze stériles dans un mouvement circulaire 3x (20 s par solution à chaque fois).
11. À l’aide d’un scalpel, faire une incision rostrale-caudale sur la ligne médiane du cuir chevelu, juste au-dessus des yeux jusqu’à l’arrière de la tête. Cette méthode d’ouverture du cuir chevelu est préférable à la coupe du cuir chevelu, car les rabats de la peau peuvent être scellés sur ou autour de l’EEG-cap offrant plus de stabilité.
    REMARQUE : Lors de la préparation du crâne pour l’implantation du front 3-EEG, il est nécessaire de couper le cuir chevelu, car la taille du front ne permettra pas la fermeture des ailerons de la peau au-dessus du front.
12. Élargir la zone d’incision en appliquant de petits hemostats sur les bordures de peau ouvertes. Si un saignement survient après l’incision, nettoyez avec une gaze ou un écouvillon de coton stérile.
13. Enlever délicatement le périosteume (c.-à-d. la fine membrane au-dessus de l’os crânien) à l’arme à scalpel. Si un saignement se produit au cours de cette étape, appuyez sur le site de saignement avec un coton-tige stérile jusqu’à ce qu’il s’arrête.
14. Utilisez des cotons-tiges stériles pour nettoyer le crâne avec du peroxyde d’hydrogène, mais évitez de toucher les tissus mous entourant la zone crânienne exposée. Répétez cette étape jusqu’à ce que le crâne soit nettoyé de tout tissu mou et ait un aspect blanchâtre.
15. Séchez le crâne à l’œil d’une gaze stérile ou d’un coton-tige.
    REMARQUE : Les étapes 3.12-3.15 sont importantes pour la fixation appropriée des électrodes et du ciment dentaire. Tout tissu mou, saignement non cautérisé, et les débris peuvent causer une infection, fixation instable du front, signal déformé ou absent, et la perte de l’implant dans les jours ou les semaines suivant la chirurgie.

4. Placement d’électrode

1. Implanter le front unique eEG (1EEG).
   REMARQUE : Les abréviations dans les coordonnées stéréotaxiques représentent les relations spatiales et spécifient la distance en millimètres de la cible à partir du bregma à une orientation donnée sur la tête de l’animal : antérieure-postérieure (AP) et médial-latérale (ML). Dorsal-ventral n’est pas applicable dans ce protocole parce que toutes les électrodes sont placées dans l’espace épidurale plutôt que dans une certaine structure dans le cerveau (Figure 3). Vineste est une électrode active et Vin- est son électrode de référence.
   1. Utilisez une perceuse à grande vitesse avec un bit d’acier (0,5 mm, rond, 1/4 po) à 5 000 à 6 000 tours par min (rpm) pour créer six trous de bavures (trois pour les vis de stabilité et trois pour les électrodes) en utilisant les coordonnées stéréotaxiques^{fournies 12}. Pour les deux vis antérieures : AP 1,5 mm, ML et 1,5 mm; pour la vis postérieure : AP -5,2 mm, ML -1,5 mm; pour l’électrode au sol : AP -5,2 mm, ML et 1,5 mm; pour les électrodes d’enregistrement : AP -2,3 mm, ML et 2,7 mm, avec Vinà vers la droite et Vin- à gauche.
   2. Ajouter trois vis pour une meilleure stabilité de l’étage de la tête. À l’aide d’un tournevis, tourner les vis 1 à 1,5 x chacune pour qu’elles soient fixées de façon stable dans le crâne.
      REMARQUE : Placer les vis plus profondément endommagera le cerveau.
   3. Insérez le front 1EEG dans un bras stéréotaxique et placez le front de sorte que les trois électrodes soient situées le long de la ligne médiane crânienne. Dans cette configuration, l’électrode au sol et son ouverture respective au-dessus du front se trouve à l’arrière, l’électrode VinmD au milieu et l’électrode Vin-à-l’avant. Une marque peut être faite sur le front avec un marqueur permanent.
   4. Pliez chaque électrode de 90 degrés de sorte que l’extrémité de chaque fil soit pliée vers le bas et placée au-dessus du trou de bavure correspondant. Ensuite, mesurez 1 mm de longueur de la partie du fil qui est maintenant perpendiculaire au trou de bavure et coupez l’excédent(figure 3). Cela assurera le placement péridural des électrodes. Les électrodes doivent toucher à peine la surface du dura mater.
   5. Abaissez le front et ajustez les trois électrodes pour qu’elles correspondent au trou de bavure respectif. Pour l’enregistrement péridural, les électrodes doivent être placées au-dessus ou à peine toucher le dura mater.
   6. Préparer le ciment dentaire pour l’application en mélangeant une demi-cuillère de poudre avec plusieurs gouttes de solvant. Utilisez une spatule de mélange et remuer jusqu’à ce que le mélange final soit mastic-like, collant mais malléable, et assez raide pour être correctement condensé une fois placé sur le crâne de l’animal.
   7. Appliquer le mélange de ciment dentaire couvrant toutes les vis et les électrodes et attendre 3 à 5 min pour qu’il se solidifie. Assurez-vous de ne pas recouvrir le piédestal en plastique de ciment dentaire, car il sera impossible de connecter l’animal au navetteur avec une attache.
   8. Relâchez les hemostats tenant les rabats de peau et fermez l’incision en connectant les rabats de peau autour du piédestal en plastique. Appliquer plusieurs gouttes d’adhésif tissulaire (voir Tableau des matériaux) pour sceller les ailerons de la peau.
   9. Appliquer la chlorhexidine antiseptique à la zone autour de l’implant pour éviter l’infection. Si l’animal est sous anesthésie pendant plus de 2 h après l’injection précédente de solution de lactate de sodium, administrée lors de l’induction du TBI, administrer une autre injection sous-cutanée. Pour maintenir une bonne hydratation de l’animal, répétez l’injection tous les 2 h que l’animal passe sous anesthésie.
   10. Après la chirurgie, donner une injection finale de lactate de sodium solution 2 h après l’injection précédente. Si la chirurgie est inférieure à 2 h de long, administrer la dose finale de récupération de la solution de lactate de sodium 2 h à partir de la première injection.
   11. Retirez l’animal de l’appareil stéréotaxique et mesurez le poids de l’animal après la chirurgie de l’EEG comme référence pour la surveillance future. En raison de l’implant, le poids de l’animal sera plus grand qu’avant la chirurgie.
   12. Placez l’animal dans une cage propre sur un coussin chauffant chaud pour la récupération.
2. Implanter les deux EEG et un EMG (2EEG/1EMG) canaux headmount.
   1. Utilisez le bregma comme point de repère pour le placement du mont de la tête. Appliquer une petite quantité d’adhésif tissulaire (voir Tableau des matériaux) sur le côté inférieur du front 2EEG/1EMG, en évitant les quatre trous de vis et placez le mont de tête 2EEG/1EMG sur la surface du crâne.
      REMARQUE : Il n’y a pas de coordonnées spécifiques pour le placement de ce front. Le front est de 8 mm de long et 5 mm de large, ce qui couvre la majeure partie de la surface crânienne. Positionner le front avec son bord avant de 3,0 mm antérieur au bregma est optimal et fournit une bonne qualité de signal. Un placement manuel rapide est nécessaire avant la goutte de cures adhésives tissulaires. Laisser environ 5 min pour que la colle de tissu guérisse complètement.
   2. Utilisez une aiguille stérile de 23 G pour créer des trous pilotes pour les vis à travers les quatre ouvertures du front. Pour ce faire, poussez doucement l’aiguille et tournez lentement jusqu’à ce que la pointe de l’aiguille pénètre dans le crâne sans endommager le cerveau. Enlever tout saignement des trous du pilote à l’aide d’un coton-tige stérile.
   3. Insérez le 0,10 dans les vis dans les trous du pilote et faites-les pivoter jusqu’à ce que chacun soit fixé dans le crâne. Cela peut être jusqu’à la moitié de la longueur de la vis, mais pas la longueur complète, car cela endommagerait la dura mater et le cortex. Si le front est positionné de sorte qu’il y ait un espace entre la surface du crâne et l’extrémité arrière du front, utilisez deux 0,12 de vis dans la partie postérieure.
   4. Faire une petite ouverture sur les côtés de la pochette bi-pack à deux composants époxy (argent-époxy). Prendre une spatule à double face et utiliser chaque côté pour ramasser une petite quantité égale de chaque composant de la poche et les mélanger ensemble. Utilisez seulement une petite quantité suffisante pour une seule chirurgie, parce que le mélange se solidifie dans les 20 min. Sceller les côtés de la poche pour éviter le séchage.
      REMARQUE : L’époxy argenté permet un bon contact électrique entre la vis et le front et améliore la stabilité des vis.
   5. Appliquer une petite quantité de ce mélange entre la tête de vis et le trou à vis, puis serrer chaque vis jusqu’à ce que sa tête repose sur la base de l’implant. Assurez-vous qu’aucun époxy argenté n’entre les deux vis parce que chaque vis sert d’électrode individuelle et, pour assurer un signal précis, elle ne doit pas entrer en contact avec l’autre vis.
   6. Si le mélange argent-époxy a été égaré, il y a une fenêtre de quelques secondes pour enlever soigneusement l’excédent pour séparer la connexion. Pliez soigneusement les deux pistes EMG à partir du bord postérieur du front pour suivre le contour de la tête et du cou de l’animal, puis insérez-les dans les muscles nuchaux.
   7. Préparer le ciment dentaire pour l’application en mélangeant une demi-cuillère de poudre avec plusieurs gouttes de solvant. Utilisez une spatule de mélange et remuer jusqu’à ce que le mélange final soit mastic-like, collant mais malléable, et assez raide pour être correctement condensé une fois placé sur le crâne de l’animal.
   8. Appliquer le mélange de ciment dentaire couvrant tout le front tout en évitant de couvrir les trous à six broches, car cela rendra impossible de connecter le pré-amplificateur. Attendez que le ciment se solidifie. Assurez-vous que la peau n’est pas scellée au front avec du ciment dentaire.
   9. Relâchez les hemostats tenant les rabats de peau et fermez l’incision en connectant les rabats de peau autour du piédestal en plastique. Appliquer plusieurs gouttes d’adhésif tissulaire pour sceller les rabats cutanés.
      REMARQUE : Si l’incision de peau a été faite plus longtemps pour permettre le redressement des fils de fil d’EMG, la peau peut être scellée avec l’adhésif de tissu ou suture. Sceller la peau avec de l’adhésif tissulaire est généralement suffisant. Cependant, si pendant l’ouverture postopératoire de surveillance de l’incision est observée, des sutures sont recommandées à la place.
   10. Appliquer la chlorhexidine antiseptique à la zone autour de l’implant pour éviter l’infection. Administrer la solution de lactate de sodium (3 ll par gramme du poids de l’animal) sous-cutané pour remplacer les liquides et les électrolytes si l’animal est sous anesthésie pendant plus de 2 h après l’injection précédente.
   11. Retirez l’animal de l’appareil stéréotaxique et mesurez le poids de l’animal après la chirurgie de l’EEG comme référence pour la surveillance future. En raison de l’implant, le poids de l’animal sera plus grand qu’avant la chirurgie.
   12. Placer l’animal dans une cage propre sur un coussin chauffant chaud, avec un gel de récupération et quelques morceaux de chow humidifiés pour la récupération.
3. Implanter un front de trois canaux EEG (3EEG).
   1. Utilisez une perceuse à grande vitesse avec un bit d’acier (0,5 mm, rond, 1/4) à 5 000 à 6 000 tr/min pour créer six trous de bavures (trois pour les vis de stabilité et trois pour les électrodes) à l’aide des coordonnées stéréotaxiques fournies¹². Pour le sol et la référence commune pour l’EEG1 et l’EEG2 : AP 5,2 mm, ML et 1,5 mm; pour eEG1 et EEG2: AP -3,0 mm, ML - 3,0 mm; pour l’EEG3 indépendant : AP -1,4 mm, ML et 1,5 mm.
   2. Placez les six électrodes à vis dans les trous de bavure.
      REMARQUE : Placer les vis plus profondément créera des dommages significatifs au cerveau. Les électrodes à vis offrent une meilleure stabilité du front.
   3. Préparer le ciment dentaire pour l’application en mélangeant une demi-cuillère de poudre avec plusieurs gouttes de solvant. Utilisez une spatule de mélange et remuer jusqu’à ce que le mélange final soit mastic-like, collant mais malléable, et assez raide pour être correctement condensé une fois placé sur le crâne de l’animal.
   4. Appliquer le mélange de ciment dentaire couvrant toute la surface exposée du crâne et chaque électrode à vis. Assurez-vous que la peau n’est pas scellée au front avec du ciment dentaire. Attendez que le ciment se solidifie légèrement. Il n’est pas nécessaire d’attendre jusqu’à la solidification complète avant de passer à l’étape suivante.
   5. Allumez le fer à souder pour le réchauffer. Placez le front 3EEG dans un bras porte-supports stéréotaxique.
      REMARQUE : Placez le front de sorte que les six positions de plomb de fil correspondent à la position des fils de chaque électrode de vis.
   6. Baisser le front de sorte que sa partie ventrale repose sur le ciment dentaire.
   7. Tournez le fil de chaque plomb de chacune des électrodes à vis avec le fil correspondant du front.
      REMARQUE : Le fait de tourner les mauvaises pistes de fil rendra l’interprétation des données compliquée ou impossible.
   8. Couper soigneusement l’excédent de fil à l’aide de ciseaux. Souder chaque paire de fil tordue pour une conduction appropriée du signal.
      REMARQUE : Chaque paire de fils doit entrer en contact avec une autre paire, sinon la qualité du signal et l’interprétation des données seront compromises.
   9. Pliez chaque paire de fils soudé autour du front, évitant le contact entre chaque paire.
      REMARQUE : Si les fils de fil ne sont pas coupés assez courts, il peut être difficile de les plier autour du front sans toucher un autre fil. Dans ce cas, pliez d’abord une paire, couvrez-la d’un mélange de ciment dentaire, attendez une heure et deux min pour se solidifier, puis procédez avec la paire suivante de la même façon.
   10. Terminer de couvrir tout le fil avec du ciment dentaire en ne laissant que la partie noire du front exposé.
       REMARQUE : Veillez à ne pas appliquer de poudre de ciment dentaire ou de mélange sur le dessus de la partie exposée du mont, car tout débris ou ciment dans les trous bloquera le contact et entraînera une absence ou un bruit de signal.
   11. Relâchez les hemostats tenant les rabats de peau. Appliquer la chlorhexidine antiseptique à la zone autour de l’implant pour éviter l’infection.
   12. Administrer la solution de lactate de sodium (3 ll par gramme du poids de l’animal) sous-cutané pour remplacer les liquides et les électrolytes si l’animal a été sous anesthésie pendant plus de 2 h après l’injection précédente.
   13. Retirez l’animal de l’appareil stéréotaxique et mesurez le poids de l’animal après la chirurgie de l’EEG comme référence pour la surveillance future. En raison de l’implant, le poids de l’animal sera plus grand qu’avant la chirurgie.
   14. Placer l’animal dans une cage propre sur un coussin chauffant chaud, avec un gel de récupération et quelques morceaux de chow humidifiés pour la récupération.
       REMARQUE : Le peroxyde d’hydrogène aide à enlever les tissus mous restants du crâne.

5. Connecter les animaux au système d’acquisition

1. Coupez l’animal avec les deux mains pour le retirer de la cage d’acquisition et le transférer dans une zone propre avec une surface plane, comme une station de transfert d’animaux (ATS).
2. Saisissez doucement la souris par la peau de son dos. Ne prenez pas l’animal par la queue, car cela provoque de la détresse.
3. Identifiez l’ouverture dans le front eEG correspondant à l’électrode au sol et faites correspondre la broche respective de l’attache pour une connexion appropriée.
   REMARQUE : La connexion inversée de l’attache entre le navetteur et le front des animaux entraînera une lecture différente des électrodes et des formes d’onde potentiellement déformées.
4. Retournez l’animal dans la cage d’acquisition et connectez l’autre extrémité de l’attache (EEG System 1) ou préamplificateur (EEG System 2) au commutateur.
   REMARQUE : Lorsque vous connectez le préamplificateur (EEG System 2) à l’attache du navetteur, faites correspondre les marques blanches aux extrémités des deux attaches. La connexion inversée entraînera des dommages permanents de l’amplificateur et nécessite des réparations par le fabricant, qui sont coûteux.
5. Faites pivoter doucement l’attache reliant l’animal au navetteur pour s’assurer que le mécanisme fonctionne correctement et que l’animal peut se déplacer librement.

6. Paramètres d’acquisition de données EEG

1. Définir les paramètres d’acquisition d’EEG System 1.
   1. Définir le taux d’échantillonnage à 500 Hz; 5 000; mode Norm 35 Hz; LPN éteint. Définir le filtre passe élevé à 0,5 Hz.
      REMARQUE : 100 Hz (passage bas) est intégré et ne nécessite pas d’entrée manuelle.
2. Définir les paramètres d’acquisition d’EEG System 2.
   1. Définir le taux d’échantillonnage à 600 Hz; gain de préampli 100; 1 (EEG1,2). Définir le filtre passe bas à 100 Hz.
      REMARQUE : 1 Hz (passage élevé) est intégré et ne nécessite pas d’entrée manuelle.

7. Paramètres d’acquisition de données vidéo

1. Définir les paramètres d’acquisition pour EEG System 1.
   REMARQUE : Un système d’acquisition vidéo tiers est nécessaire pour obtenir des données vidéo simultanées.
   1. Définir la fréquence d’image entre 15 (minimum recommandé) et 30 (maximum disponible) pour une qualité vidéo appropriée. Définir la résolution à 640 x 640 pixels. Définir le type de compression à H.264H.
2. Définir les paramètres d’acquisition pour EEG System 2.
   REMARQUE : Ce système D’EEG offre un système vidéo et un logiciel qui synchronisent les données vidéo et EEG ensemble dans un seul fichier pour un plus grand pas de quatre animaux (voir Tableau des matériaux).
   1. Définir la fréquence d’image entre 15 (minimum recommandé) et 30 (maximum disponible) pour une qualité vidéo appropriée. Définir la résolution à 640 x 480 pixels. Définir le type de compression dans le format de fichier WebM.

Résultats

Le protocole décrit ici la méthode d’induction d’une blessure diffuse dans l’isolement (p. ex., en l’absence d’une lésion focale) à l’aide d’un modèle de souris de TBI diffus répétitif(figure 1). La figure 1A représente le dispositif de chute de poids et ses composants (Figure 1A, a1-a5) utilisés pour l’induction de tBI dans ce modèle et des étapes cruciales au cours de la...

Discussion

Contrairement aux modèles de l’ICC et du FPI induisant des lésions focales ou diffuses, le modèle de TBI diffus répétitif décrit dans ce protocole permet l’induction de lésions diffuses en l’absence de lésions cérébrales focales et ne nécessite pas d’ouvertures du cuir chevelu ou crâniennes et de l’inflammation associée. Un avantage supplémentaire de l’absence de craniectomy dans ce modèle est qu’il permet non seulement d’implanter les électrodes pour l’enregistrement continu chronique d...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.10" screw	Pinnacle Technology Inc., KS, USA	8209	0.10 inch long stainless steel
0.10" screw	Pinnacle Technology Inc., KS, USA	8403	0.10 inch long with pre-soldered wire lead
0.12" screw	Pinnacle Technology Inc., KS, USA	8212	0.12 inch long stainless steel
1EEG headmount	Invitro1 (subsidiary of Plastics One), VA, USA	MS333/8-A/SPC	3 individually Teflon-insulated platinum iridium wire electrodes (twisted or untwisted, 0.005 inch diameter) extending below threaded plastic pedestal
2EEG/1EMG headmount	Pinnacle Technology Inc., KS, USA	8201	2EEG/1EMG channels
3% hydrogen peroxide			Pharmacy
3EEG headmount	Pinnacle Technology Inc., KS, USA	8235-SM-C	custom 6-Pin Connector for 3EEG channels
Buprenorphine	Par Pharmaceuticals, Cos. Inc., Spring Valley, NY, USA	060969
Buprenorphine	Par Pharmaceuticals, Cos. Inc., Spring Valley, NY, USA	060969
C57BL/6 mice	Harlan/Envigo Laboratories Inc		male, 12-16 weeks old
C57BL/6 mice	The Jackson Laboratory		male, 12-16 weeks old
Carprofen	Zoetis Services LLC, Parsippany, NJ, USA	026357	NOTE: this drug is added during weight drop only if stereotactic electrode implantation will be performed on the same day
Chlorhexidine antiseptic			Pharmacy
Dental cement and solvent kit	Stoelting Co., USA	51459
Drill	Foredom	HP4-917
Drill bit	Meisinger USA, LLC, USA	HM1-005-HP	0.5 mm, Round, 1/4, Steel
Dry sterilizer	Cellpoint Scientific, USA		Germinator 500
EEG System 1	Biopac Systems, CA, USA
EEG System 2	Pinnacle Technology Inc., KS, USA
Ethanol ≥70%	VWR, USA	71001-652	KOPTEC USP, Biotechnology Grade (140 Proof)
Eye ointment	Pro Labs Ltd, USA		Puralube Vet Ointment Sterile Ocular Lubricant available in general online stores and pharmacies
Fluriso liquid for inhalation anesthesia	MWI Veterinary Supply Co., USA	502017
Hair removal product	Church & Dwight Co., Inc., USA		Nair cream
Isoflurane	MWI Veterinary Supply Co., USA	502017
Povidone-iodine surgical solution	Purdue Products, USA	004677	Betadine
Rimadyl/Carprofen	Zoetis Services LLC, Parsippany, NJ, USA	026357
Solder			Harware store
Soldering iron	Weller, USA	WP35	ST7 tip, 0.8mm
Stainless steel disc			Custom made
Sterile cotton swabs
Sterile gauze pads	Fisher Scientific, USA	22362178
Sterile poly-lined absorbent towels pads	Cardinal Health, USA	3520
Tissue adhesive	3M Animal Care Products, USA	1469SB