Induzir epilepsia pós-traumática em um modelo de camundongo de lesão cerebral traumática difusa repetitiva

Resumo

Este protocolo sistemático descreve um novo modelo animal de epilepsia pós-traumática após lesão cerebral traumática repetitiva. A primeira parte detalha etapas para indução traumática de lesão cerebral usando um modelo modificado de queda de peso. A segunda parte fornece instruções sobre a abordagem cirúrgica para sistemas de aquisição de dados eletroencefalográficos de um único e multicanal.

Resumo

Lesão cerebral traumática (TBI) é uma das principais causas de epilepsia adquirida. O TBI pode resultar em uma lesão cerebral focal ou difusa. A lesão focal é resultado de forças mecânicas diretas, às vezes penetrando pelo crânio, criando uma lesão direta no tecido cerebral. Estes são visíveis durante a imagem cerebral como áreas com contusão, laceração e hemorragia. Lesões focais induzem a morte neuronal e a formação de cicatrizes gliais e estão presentes em 20%-25% de todas as pessoas que incorrem em um TCE. No entanto, na maioria dos casos de TBI, a lesão é causada por forças de aceleração-desaceleração e posterior escofeteca de tecido, resultando em danos não focais e difusos. Uma subpopulação de pacientes com TBI continua a desenvolver epilepsia pós-traumática (EPT) após um período de latência de meses ou anos. Atualmente, é impossível prever quais pacientes desenvolverão PTE, e as convulsões em pacientes com PTE são desafiadoras de controlar, necessitando de mais pesquisas. Até recentemente, o campo se limitava a apenas dois modelos de animais/roedores com convulsões pós-traumáticas validadas, ambos apresentando grandes lesões focais com perda maciça de tecido no córtex e às vezes estruturas subcorticais. Ao contrário dessas abordagens, foi determinado que o TBI difuso induzido usando um modelo modificado de queda de peso é suficiente para iniciar o desenvolvimento de convulsões convulsivas espontâneas e não convulsivas, mesmo na ausência de lesões focais ou perda de tecido. Semelhante a pacientes humanos com epilepsia pós-traumática adquirida, este modelo apresenta um período de latência após lesão antes do início da convulsão. Neste protocolo, a comunidade receberá um novo modelo de epilepsia pós-traumática, detalhando como induzir TBI difuso não-lesão seguido de monitoramento contínuo de animais eletroencefalográficos de vídeo a longo prazo ao longo de vários meses. Este protocolo detalhará o manuseio de animais, o procedimento de queda de peso, a colocação de eletrodos para dois sistemas de aquisição e os desafios frequentes encontrados durante cada uma das etapas de cirurgia, monitoramento pós-operatório e aquisição de dados.

Introdução

Todos os anos, a TBI afeta cerca de 60 milhões de pessoas em todo o mundo. Indivíduos impactados têm maior risco de desenvolver epilepsia, o que pode se manifestar anos após a lesão inicial. Embora os TBIs graves estejam associados a um maior risco de epilepsia, mesmo o TBI leve aumenta a chance de um indivíduo desenvolver epilepsia^1,2,3,4. Todos os TBIs podem ser classificados como focas, difusos ou uma combinação de ambos. A lesão cerebral difusa, presente em muitos, se não todos os TBIs, é resultado de tecidos cerebrais de diferentes densidades se escorando uns contra os outros devido à aceleração-desaceleração e forças rotacionais. Por definição, a lesão difusa só ocorre isoladamente em lesão cerebral leve/concussiva, na qual não há lesões cerebrais visíveis em tomografiacomputadorizada^{computadorizada 5}.

Atualmente, há dois problemas críticos no manejo de pacientes que têm, ou estão em risco de desenvolver epilepsia pós-traumática (PTE). A primeira é que, uma vez manifestado pelo PTE, as apreensões são resistentes às drogas antiepilépticas disponíveis (AEDs)⁶. Em segundo lugar, os AEDs são igualmente ineficazes na prevenção da epilepileptogênese, e não há abordagens terapêuticas alternativas eficazes. Para enfrentar esse déficit e encontrar melhores metas terapêuticas e candidatos ao tratamento, será necessário explorar novos mecanismos celulares e moleculares na raiz do PTE⁶.

Uma das características proeminentes da epilepsia pós-traumática é o período latente entre o evento traumático inicial e o início de convulsões espontâneas, não provocadas e recorrentes. Os eventos que ocorrem dentro dessa janela temporal são um foco natural para os pesquisadores, pois desta vez a janela pode permitir o tratamento e a prevenção do PTE completamente. Os modelos animais são mais utilizados para esta pesquisa porque oferecem vários benefícios distintos, e não menos importante é que o monitoramento contínuo de pacientes humanos seria ao mesmo tempo impraticável e caro ao longo de tais períodos potencialmente longos de tempo. Além disso, mecanismos celulares e moleculares na raiz da epileptogênese só podem ser explorados em modelos animais.

Modelos animais com convulsões pós-traumáticas espontâneas e epilepsia são preferidos em modelos onde as convulsões são induzidas após o TBI por meios menos fisiologicamente relevantes, como por quimioconvulsivos ou estimulação elétrica agudamente, cronicamente ou por acender. Modelos espontâneos de convulsão pós-traumática testam como o TBI modifica a rede cerebral saudável que leva à epilofegênese. Estudos utilizando estimulação adicional após o TBI avaliar como a exposição ao TBI reduz o limiar de convulsão e afeta a suscetibilidade às convulsões. As vantagens dos modelos animais com convulsões induzidas quimicamente ou com estimulação elétrica estão em testar os mecanismos específicos de refratividade aos AEDs e a eficácia dos AEDs existentes e novos. No entanto, o grau de relevância e tradução desses dados para humanos pode ser ambíguo⁷ devido ao seguinte: 1) mecanismos de apreensão podem ser diferentes daqueles induzidos apenas pelo TBI; 2) nem todos esses modelos levam a convulsões espontâneas^7; 3) lesões criadas pelo próprio agente convulsivo, com a cânula necessária para sua entrega, ou estimulando a colocação de eletrodos em estruturas de profundidade (por exemplo, o hipocampo ou amilgdala) já podem causar maior suscetibilidade de convulsões e até mesmo potenciais de campo epilépformehipo⁷. Além disso, alguns agentes convulsivos (ou seja, ácido kainic) produzem lesões hipocampais diretas e esclerose, o que não é típico após tbi difuso.

Até recentemente, existiam apenas dois modelos animais de epilepsia pós-traumática: impacto cortical controlado (CCI, focal) ou lesão de percussão fluida (FPI, focal e difusa)⁸. Ambos os modelos resultam em grandes lesões focais ao lado da perda de tecido, hemorragia e gliose em roedores⁸. Esses modelos imitam epilepsia pós-traumática induzida por grandes lesões focais. Um estudo recente demonstrou que o TBI difuso repetido (3x) é suficiente para o desenvolvimento de convulsões espontâneas e epilepsia em camundongos mesmo na ausência de lesões focais^9,adicionando um terceiro modelo de PTE roedor com convulsões espontâneas confirmadas. Este novo modelo imita mudanças celulares e moleculares induzidas pelo TBI difuso, representando melhor a população humana com TBIs leves e concussivos. Nesse modelo, o período latente de três semanas ou mais antes do início da convulsão e o surgimento de convulsões tardias, espontâneas e recorrentes permite investigar as causas básicas da epileptogênese pós-traumática, testando a eficácia de abordagens preventivas e novos candidatos terapêuticos após o início da convulsão, e tem potencial para o desenvolvimento de biomarcadores de epileptogênese pós-traumática porque aproximadamente metade dos animais desenvolvem epilepsia pós-traumática.

A escolha do modelo animal para o estudo da epilepsia pós-traumática depende da questão científica, do tipo de lesão cerebral investigada e de quais ferramentas serão usadas para determinar os mecanismos celulares e moleculares subjacentes. Em última análise, qualquer modelo de epilepsia pós-traumática deve demonstrar tanto o surgimento de convulsões espontâneas após o TBI quanto um período inicial de latência em um subconjunto de animais TBI, porque nem todos os pacientes que incorrem em um TBI passam a desenvolver epilepsia. Para isso, a eletroencefalografia (EEG) com aquisição simultânea de vídeo é utilizada neste protocolo. Entender os aspectos técnicos por trás do hardware e abordagens de aquisição de dados é fundamental para uma interpretação precisa dos dados. Os aspectos críticos do hardware incluem o tipo de sistema de gravação, tipo de eletrodos (parafuso ou suporte de arame) e material de que são feitos, aquisição sincronizada de vídeo sincronizado (como parte do sistema EEG ou terceiros) e propriedades do sistema de computador. É imprescindível definir os parâmetros de aquisição adequados em qualquer tipo de sistema, dependendo da meta de estudo, eventos de interesse eEG, método de análise adicional e sustentabilidade do armazenamento de dados. Por fim, o método de configuração de eletrodos (montagem) deve ser considerado, pois cada um tem vantagens e desvantagens e afetará a interpretação dos dados.

Este protocolo detalha como usar o modelo de queda de peso marmarou modificado^10,11 para induzir lesões difusas resultando em convulsões espontâneas, não provocadas e recorrentes em camundongos, descreve abordagens cirúrgicas para adquirir um EEG de vídeo contínuo e multicanal único e sincronizado usando a montagem monopolar, bipolar ou mista.

Protocolo

Todos os procedimentos em animais descritos neste protocolo foram realizados de acordo com o Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Virginia Tech e em conformidade com o 'Guia para o Cuidado e Uso de Animais De Laboratório' dos Institutos Nacionais de Saúde. .

1. Protocolo de manuseio de animais

NOTA: Este protocolo destina-se a habituar animais encomendados de um fornecedor para a instalação após a chegada e condicioná-los a serem manuseados pelo experimentador. Isso melhora o bem-estar animal reduzindo o estresse e a ansiedade e simplifica certos procedimentos que requerem o manuseio de animais, incluindo induzir o TCE, o monitoramento pós-operatório e conectar o animal ao sistema de aquisição.

1. Quando muitos animais são recebidos do vendedor, a orelha e os atribuem aleatoriamente a um grupo experimental (TBI) ou grupo de controle (cirurgia falsa) enquanto os combinam em gaiolas de 2-5 animais. Casa tbi animais separadamente de animais falsos porque ratos falsos ocasionalmente agem agressivamente em relação a ratos que foram submetidos a TBI.
2. Manuseio do dia 1 (24-48 h após a marcação de ouvido): Prepare um gráfico para registrar etiquetas de ouvido animal, data de nascimento, datas de manuseio, peso animal nos dias de manuseio, duração do manuseio e uma seção para comentários e observações.
3. Bata suavemente o animal usando as duas mãos. Não agarre o animal pela cauda, pois ele induz mecanismos de defesa e uma resposta ao estresse.
4. Verifique e grave a etiqueta de ouvido do animal.
5. Coloque o animal no recipiente na balança de peso e grave o peso.
6. Bata suavemente o animal com as duas mãos novamente e manuseie-o por 1 min, permitindo que ele se mova e explore dentro das mãos. Faça isso em cima de um banco na sala de procedimentos e tenha cuidado para não deixar o animal cair no chão.
7. Depois de 1 min de manuseio, coloque o animal de volta em sua gaiola.
8. Repita os passos 1.3-1,7 para os outros animais na gaiola.
9. Manuseio dia 2 (no dia seguinte): Repita as etapas 1.2-1.5.
10. Bata suavemente o animal com as duas mãos novamente e manuseie-o por 2 minutos, permitindo que ele se mova e explore dentro das mãos. Faça isso em cima de um banco na sala de procedimentos e tenha cuidado para não deixar o animal cair no chão.
11. Depois de 2 min de manuseio, coloque o animal de volta em sua gaiola.
12. Repita os passos 1.10-1.11 para os outros animais na gaiola.
13. Manuseio dia 3 (no dia seguinte): Repita as etapas 1.2-1.5.
14. Bata suavemente o animal com as duas mãos novamente e manuseie-o por 4 minutos, permitindo que ele se mova e explore dentro das mãos. Faça isso em cima de um banco na sala de procedimentos e tenha cuidado para não deixar o animal cair no chão.
15. Depois de 4 min de manuseio, coloque o animal de volta em sua gaiola.
16. Repita os passos 1.14-1,15 para os outros animais na gaiola.
17. Manuseio dia 4 (dia de controle, 1 semana a partir do dia 1): Repita as etapas 1.2-1.5.
18. Bata suavemente o animal com as duas mãos novamente e manuseie-o por 4 minutos, permitindo que ele se mova e explore dentro das mãos. Faça isso em cima de um banco na sala de procedimentos e tenha cuidado para não deixar o animal cair no chão.
19. Depois de 4 min manuseando, coloque o animal de volta em sua gaiola.
20. Repita os passos 1.18-1.1.19 para os outros animais na gaiola.
    NOTA: O dia de manuseio de controle testa a retenção do comportamento calmo após um protocolo de manuseio de três dias.

2. Procedimento de queda de peso

1. Coloque o rato em uma câmara de indução. Defina o fluxo de oxigênio e vácuo tanto para 1 L/min quanto ao nível de gás isoflurano para 3%-5%. Anestesiar o rato por 5 min.
2. Retire o mouse da câmara de indução e coloque-o em uma almofada de espuma. Teste para a ausência de uma resposta a uma pitada de dedo ou cauda.
3. Administrar um analgésico (0,1 mg/kg buprenorfina) subcutânea. Se a cirurgia do EEG for realizada no mesmo dia, administre a subcutânea de buprenorfina em combinação com o carprofeno anti-inflamatório não esteroide (5 mg/kg).
4. Adminisão a solução de lactato de sódio (3 μL por grama do peso do animal) subcutâneamente antes ou depois do último impacto. A solução de lactato de sódio pode ser misturada com os analgésicos para administração rápida em uma única injeção.
   NOTA: A solução de lactato de sódio contém uma mistura de cloreto de sódio, cloreto de potássio, cloreto de cálcio e lactato de sódio na água. Esta etapa ajuda a substituir fluidos e eletrólitos, auxiliando na recuperação.
5. Posicione a cabeça do mouse o tubo de queda de peso (Figura 1A) e coloque um disco de aço inoxidável plano (1,3 cm de diâmetro, 1 mm de espessura e 880 mg de peso) no centro da cabeça, entre a linha dos olhos e orelhas.
   NOTA: Este disco difunde o impacto através da superfície do crânio (Figura 1B).
6. Retire o pino no tubo de queda de peso para soltar a haste de peso de 100 g de uma altura de 50 cm. Para induzir a lesão falsa para os camundongos de controle, remova a haste de peso do tubo para evitar a liberação acidental do pino e queda de peso.
   NOTA: A cabeça do animal deve ser posicionada plana, de modo que a haste cai livremente em toda a superfície do disco.
7. Coloque o animal inconsciente nas costas para recuperação em uma almofada de aquecimento coberta com uma toalha absorvente polilined estéril. O tempo de recuperação do reflexo de direita (ou seja, o tempo que leva o mouse para se corrigir de suas costas) pode ser medido como uma leitura para o tempo gasto inconsciente.
8. Quando o animal recuperar a consciência, coloque-o em uma gaiola limpa que foi aquecida em uma almofada de aquecimento, com gel de recuperação e algumas peças de comida umedecida para se recuperar por 45 minutos. Certifique-se de que há lixo suficiente para que a gaiola não fique superaquecida. Superaquecer o animal pode ser um grande obstáculo para a recuperação como permitir que o rato fique muito frio.
9. Após 45 min, repita as etapas 2.1-2,8 duas vezes, omitindo a etapa 2.3 (ou seja, administração de analgésicos e anti-inflamatórios).
10. Permita que os animais se recuperem por 1-2 h se a cirurgia de implantação de eletrodos EEG for realizada no mesmo dia.

3. Preparação de campo cirúrgico para implantação de eletrodos EEG

NOTA: Autoclave as ferramentas cirúrgicas e parafusos antes da cirurgia. Limpe as luvas cirúrgicas pulverizando e esfregando com 70% de etanol antes e depois de tocar o animal, materiais não estéreis e entre o manuseio dos animais. Esterilizar as ferramentas cirúrgicas de 2 a 3 min no esterilizador de bicos (ver Tabela de Materiais) entre os animais. Troque a cortina estéril antes de colocar um novo animal no aparelho estereotático. Certifique-se de que o campo cirúrgico contenha todos os componentes necessários para a cirurgia (Figura 2). A ausência de um procedimento cirúrgico invasivo para induzir o TBI neste modelo tem várias vantagens: 1) a implantação dos eletrodos é flexível e pode ser realizada no mesmo dia do TBI ou após um período definido de tempo; 2) o tempo de recuperação do animal é mais rápido; 3) o crânio permanece intacto, permitindo mais área superficial e flexibilidade para implantar eletrodos.

1. Anestesiar o rato em 3%-5% de gás isoflurano em uma câmara de indução por 5 min.
2. Transfira o mouse da câmara de indução para o aparelho estereotático e coloque-o em uma cortina estéril em uma almofada de aquecimento com gás isoflurano e tubos de vácuo conectados ao cone do nariz.
3. Mantenha a temperatura corporal em 37 °C ao longo da cirurgia. Coloque o sensor de temperatura para que faça contato com o peito ou a parede abdominal do mouse.
4. Conserte a cabeça do animal no lugar usando as barras de ouvido.
5. Mantenha a anestesia em 1,5%-3,5% isoflurane ou a ~60 respirações/min no plano cirúrgico (sem resposta ao dedo do dodo ou na pitada de cauda).
6. Aplique uma pomada ocular aos olhos do animal para mantê-los lubrificados durante toda a cirurgia.
7. Administrar uma mistura de analgésicos (0,1 mg/kg buprenorfina) e a droga anti-inflamatória não esteroide (5 mg/kg carprofeno) em uma única injeção subcutânea, a menos que o TBI tenha sido realizado mais cedo durante o dia, nesse caso o animal já recebeu analgésicos e anti-inflamatórios.
   NOTA: Buprenorfina deve ser administrada novamente se o tempo entre a primeira cirurgia de colocação tbi e EEG exceder 8h ou se o animal apresenta sinais de dor 8h após a primeira administração, mas deve ser dado sem a adição de carprofeno.
8. Administrar a solução de lactato de sódio (3 μL por grama do peso do animal) subcutâneamente para substituir fluidos e eletrólitos no animal.
   NOTA: Se a cirurgia for realizada imediatamente após o TCE, esta etapa tem que ser cronometrada corretamente. A solução de lactato de sódio deve ser administrada a cada 2h enquanto o animal passa pelos procedimentos e uma vez após a cirurgia, a 2h da injeção anterior.
9. Retire o cabelo do couro cabeludo usando um creme de depilação.
10. Antes de fazer a incisão, desinfete a pele do couro cabeludo com solução antisséptica cirúrgica povido-iodo e 70% de etanol em cotonetes alternados com almofadas de gaze estéreis em um movimento circular 3x (20 s por solução cada vez).
11. Usando um bisturi, faça uma incisão rostral-caudal no couro cabeludo da linha central do couro cabeludo de logo acima dos olhos para a parte de trás da cabeça. Este método de abertura do couro cabeludo é preferido ao cortar o couro cabeludo, já que os retalhos de pele podem ser selados sobre ou ao redor da tampa EEG proporcionando mais estabilidade.
    NOTA: Ao preparar o crânio para implantação do headmount 3-EEG, é necessário cortar o couro cabeludo, pois o tamanho do suporte de cabeça não permitirá o fechamento dos retalhos da pele sobre o suporte da cabeça.
12. Expanda a área de incisão aplicando pequenos hemostatos nas fronteiras de pele abertas. Se ocorrer algum sangramento após a incisão, limpe com uma gaze de algodão estéril ou cotonete.
13. Remova suavemente o periosteum (ou seja, a fina membrana sobre o osso craniano) com uma lâmina bisturi. Se ocorrer algum sangramento durante esta etapa, pressione o local sangrando com um cotonete de algodão estéril até parar.
14. Use cotonetes de algodão estéreis para limpar o crânio com peróxido de hidrogênio, mas evite tocar o tecido mole ao redor da área craniana exposta. Repita este passo até que o crânio seja limpo de qualquer tecido mole e tenha uma aparência esbranquiçada.
15. Seque o crânio com uma gaze estéril ou cotonete de algodão.
    NOTA: As etapas 3.12-3.15 são importantes para a fixação adequada dos eletrodos e cimento dentário. Qualquer tecido mole, sangramento não cauterizado e detritos podem causar infecção, fixação instável do headmount, sinal distorcido ou ausente e perda do implante dentro de vários dias ou semanas após a cirurgia.

4. Colocação de eletrodo

1. Implante o único headmount do canal EEG (1EEG).
   NOTA: Abreviaturas nas coordenadas estereotáticas representam relações espaciais e especificam a distância em milímetros do alvo do bregma em uma determinada orientação na cabeça do animal: anterior-posterior (AP) e medial-lateral (ML). A dorsal-ventral não é aplicável neste protocolo porque todos os eletrodos são colocados no espaço peridural em vez de em uma determinada estrutura dentro do cérebro (Figura 3). Vin+ é um eletrodo ativo e Vin- é seu eletrodo de referência.
   1. Use uma broca de alta velocidade com um bit de aço (0,5 mm, redondo, 1/4 in.) em ~5.000-6.000 rodadas por min (rpm) para criar seis furos de rebarba (três para parafusos de estabilidade e três para eletrodos) usando as coordenadas estereotáticas fornecidas¹². Para os dois parafusos anteriores: AP = +1,5 mm, ML = ±1,5 mm; para o parafuso um posterior: AP = -5,2 mm, ML = -1,5 mm; para o eletrodo moído: AP = -5,2 mm, ML = +1,5 mm; para os eletrodos de gravação: AP = -2,3 mm, ML = ±2,7 mm, com Vin+ à direita e Vin- à esquerda.
   2. Adicione três parafusos para maior estabilidade do estágio da cabeça. Usando uma chave de fenda, gire parafusos 1-1,5 x cada para serem fixados no crânio.
      NOTA: Colocar os parafusos mais fundo danificará o cérebro.
   3. Insira o headmount 1EEG em um braço de suporte estereotático e posicione o suporte de cabeça para que os três eletrodos estejam localizados ao longo da linha média craniana. Nesta configuração, o eletrodo moído e sua respectiva abertura em cima do headmount estão na parte de trás, o eletrodo Vin+ no meio, e o vin-eletrodo na frente. Uma marca pode ser feita no headmount com um marcador permanente.
   4. Dobre cada eletrodo de 90° para que a extremidade de cada fio seja dobrada para baixo e esteja posicionada acima do orifício de rebarba correspondente. Em seguida, meça 1 mm de comprimento da porção do fio que agora é perpendicular ao orifício da rebarba e corte o excesso(Figura 3). Isso garantirá a colocação peridural dos eletrodos. Os eletrodos mal devem tocar na superfície dura mater.
   5. Abaixe o suporte da cabeça e ajuste os três eletrodos para combinar com o respectivo buraco de rebarba. Para gravação peridural, os eletrodos devem ser colocados acima ou mal tocar na dura mater.
   6. Prepare cimento dentário para aplicação misturando uma colher de 1/2 de pó com várias gotas de solvente. Use uma espátula de mistura e mexa até que a mistura final seja parecida, brega, mas maleável, e rígida o suficiente para ser devidamente condensada quando colocada no crânio do animal.
   7. Aplique mistura de cimento dentário cobrindo todos os parafusos e eletrodos e espere ~3-5 min para que ele se solidifique. Certifique-se de não cobrir o pedestal plástico com cimento dentário, pois será impossível conectar o animal ao deslocamento com uma corda.
   8. Solte os aquecedores segurando os retalhos da pele e feche a incisão conectando os retalhos da pele ao redor do pedestal de plástico. Aplique várias gotas de adesivo tecidual (ver Tabela de Materiais) para selar os retalhos da pele.
   9. Aplique cloroxidina antisséptica na área ao redor do implante para evitar infecções. Se o animal estiver anestesia por mais de 2h após a injeção anterior de solução de lactato de sódio, dada durante a indução do TCE, ametre outra injeção subcutâneamente. Para manter a hidratação adequada do animal, repita a injeção a cada 2h que o animal passa anestesia.
   10. Após a cirurgia, dê uma injeção final de solução de lactato de sódio 2h após a injeção anterior. Se a cirurgia tiver menos de 2h de duração, administre a dose final de recuperação da solução de lactato de sódio 2 h da primeira injeção.
   11. Remova o animal do aparelho estereotático e meça o peso do animal após a cirurgia do EEG como referência para o monitoramento futuro. Devido ao implante, o peso do animal será maior do que antes da cirurgia.
   12. Coloque o animal em uma gaiola limpa em uma almofada de aquecimento quente para recuperação.
2. Implante os dois canais EEG e um EMG (2EEG/1EMG).
   1. Use o bregma como um marco para colocação do headmount. Aplique uma pequena quantidade de adesivo tecidual (ver Tabela de Materiais) no lado inferior do headmount 2EEG/1EMG, evitando os quatro orifícios de parafuso e coloque o suporte de cabeça 2EEG/1EMG na superfície do crânio.
      NOTA: Não há coordenadas específicas para colocação deste headmount. O suporte de cabeça tem 8 mm de comprimento e 5 mm de largura, que cobre a maior parte da superfície craniana. Posicionar o suporte de cabeça com sua borda dianteira 3,0 mm anterior ao bregma é ótimo e proporciona boa qualidade de sinal. A colocação manual rápida é necessária antes da queda das curas adesivos do tecido. Permita aproximadamente 5 min para a cola de tecido curar completamente.
   2. Use uma agulha estéril de 23 G para criar buracos piloto para os parafusos através das quatro aberturas no headmount. Para isso, empurre suavemente a agulha e gire lentamente até que a ponta da agulha penetre no crânio sem danificar o cérebro. Remova qualquer sangramento dos buracos do piloto usando um cotonete de algodão estéril.
   3. Insira o 0.10 em parafusos nos orifícios do piloto e gire-os até que cada um esteja fixado no crânio. Isso pode ser até metade do comprimento do parafuso, mas não o comprimento total, pois isso danificaria a dura mater e o córtex. Se o suporte de cabeça estiver posicionado para que haja uma lacuna entre a superfície do crânio e a extremidade traseira do suporte da cabeça use dois 0,12 em parafusos na parte posterior.
   4. Faça pequena abertura nas laterais da bolsa de dois componentes (silver-epóxi) de embalagem dupla. Pegue uma espátula dupla e use cada lado para colher uma pequena e igual quantidade de cada componente da bolsa e misturá-los. Use apenas uma pequena quantidade suficiente para uma única cirurgia, pois a mistura se solidifica dentro de 20 minutos. Selar as laterais da bolsa para evitar a secagem.
      NOTA: O epóxi prateado permite o contato elétrico adequado entre o parafuso e o suporte da cabeça e aumenta a estabilidade dos parafusos.
   5. Aplique uma pequena quantidade dessa mistura entre cabeça de fenda e orifício de parafuso, em seguida, aperte cada parafuso até que sua cabeça repode sobre a base do implante. Certifique-se de que nenhum epóxi prateado está fazendo contato entre os dois parafusos porque cada parafuso serve como um eletrodo individual e, para garantir um sinal preciso, ele não deve fazer contato com o outro parafuso.
   6. Se a mistura de epóxi prateado foi extraviada, há uma janela de poucas segundas vezes para colher cuidadosamente o excesso para separar a conexão. Dobre cuidadosamente ambas as pistas EMG da borda posterior do headmount para seguir o contorno da cabeça e pescoço do animal, e depois inseri-los nos músculos nuchal.
   7. Prepare cimento dentário para aplicação misturando uma colher de 1/2 de pó com várias gotas de solvente. Use uma espátula de mistura e mexa até que a mistura final seja parecida, brega, mas maleável, e rígida o suficiente para ser devidamente condensada quando colocada no crânio do animal.
   8. Aplique a mistura de cimento dentário cobrindo todo o suporte da cabeça, evitando cobrir os orifícios de seis pinos, pois isso tornará impossível conectar o pré-amplificador. Espere ~3-5 min para que o cimento se solidifique. Certifique-se de que a pele não está selada para o headmount com cimento dentário.
   9. Solte os aquecedores segurando os retalhos da pele e feche a incisão conectando os retalhos da pele ao redor do pedestal de plástico. Aplique várias gotas de adesivo tecidual para selar os retalhos da pele.
      NOTA: Se a incisão da pele for feita mais tempo para permitir o endireitamento dos fios EMG, a pele pode ser selada com adesivo tecidual ou suturado. Selar a pele com adesivo tecidual geralmente é suficiente. No entanto, se durante a abertura de monitoramento pós-operatório da incisão for observada, as suturas são recomendadas em vez disso.
   10. Aplique cloroxidina antisséptica na área ao redor do implante para evitar infecções. Administrar a solução de lactato de sódio (3 μL por grama do peso do animal) subcutâneamente para substituir fluidos e eletrólitos se o animal estiver anestesia por mais de 2h após a injeção anterior.
   11. Remova o animal do aparelho estereotático e meça o peso do animal após a cirurgia do EEG como referência para o monitoramento futuro. Devido ao implante, o peso do animal será maior do que antes da cirurgia.
   12. Coloque o animal em uma gaiola limpa em uma almofada de aquecimento quente, com gel de recuperação e algumas peças de chow umedecidas para recuperação.
3. Implante um headmount de três canais EEG (3EEG).
   1. Use broca de alta velocidade com um bit de aço (0,5 mm, redondo, 1/4) a ~5.000-6.000 rpm para criar seis furos de rebarba (três para parafusos de estabilidade e três para eletrodos) usando as coordenadas estereotáticas fornecidas¹². Para referência moída e comum para EEG1 e EEG2: AP = 5,2 mm, ML = ±1,5 mm; para EEG1 e EEG2: AP = -3,0 mm, ML = ±3,0 mm; para EEG3 independente: AP =-1,4 mm, ML = ±1,5 mm.
   2. Coloque os seis eletrodos de parafuso nos buracos de rebarba.
      NOTA: Colocar os parafusos mais fundo criará danos significativos ao cérebro. Eletrodos de parafuso proporcionam melhor estabilidade do suporte de cabeça.
   3. Prepare cimento dentário para aplicação misturando uma colher de 1/2 de pó com várias gotas de solvente. Use uma espátula de mistura e mexa até que a mistura final seja parecida, brega, mas maleável, e rígida o suficiente para ser devidamente condensada quando colocada no crânio do animal.
   4. Aplique a mistura de cimento dentário cobrindo toda a superfície exposta do crânio e cada eletrodo de parafuso. Certifique-se de que a pele não está selada para o headmount com cimento dentário. Espere ~1-2 min para que o cimento se solidifique levemente. Não há necessidade de esperar até a solidificação total antes de seguir para o próximo passo.
   5. Ligue o ferro de solda para aquecê-lo. Coloque o suporte de cabeça 3EEG em um braço de suporte estereotático.
      NOTA: Posicione o suporte de cabeça para que as seis posições de chumbo de arame correspondam à posição dos cabos do fio de cada eletrodo de parafuso.
   6. Abaixe a cabeça para que sua parte ventral repoque em cima do cimento dentário.
   7. Torça o fio de cada chumbo de cada um dos eletrodos do parafuso com o suporte de arame correspondente do suporte da cabeça.
      NOTA: Torcer os cabos de fio errados tornará a interpretação dos dados complicada ou impossível.
   8. Corte cuidadosamente o excesso de fio usando tesouras. Solde cada par de arame torcido para condução adequada do sinal.
      NOTA: Cada par de fios deve fazer contato com outro par, caso contrário, a qualidade do sinal e a interpretação dos dados serão comprometidas.
   9. Dobre cada par de fios soldados ao redor do suporte da cabeça, evitando o contato entre cada par.
      NOTA: Se os fios não forem aparados curtos o suficiente, pode ser difícil dobrá-los ao redor da cabeça sem tocar em outro fio. Neste caso, dobre um par primeiro, cubra-o com mistura de cimento dentário, espere ~1-2 min para solidificar, em seguida, prossiga com o próximo par da mesma forma.
   10. Finalize cobrindo todo o fio com cimento dentário deixando apenas a porção preta do suporte de cabeça exposto.
       NOTA: Tenha cuidado para não aplicar qualquer pó de cimento dentário ou mistura na parte superior da parte exposta do headmount, pois qualquer detrito ou cimento nos orifícios bloqueará o contato e levará a ausência de sinal ou ruído.
   11. Solte os aquecedores segurando os retalhos da pele. Aplique cloroxidina antisséptica na área ao redor do implante para evitar infecções.
   12. Administrar a solução de lactato de sódio (3 μL por grama do peso do animal) subcutâneamente para substituir fluidos e eletrólitos se o animal estiver anestesia por mais de 2h após a injeção anterior.
   13. Remova o animal do aparelho estereotático e meça o peso do animal após a cirurgia do EEG como referência para o monitoramento futuro. Devido ao implante, o peso do animal será maior do que antes da cirurgia.
   14. Coloque o animal em uma gaiola limpa em uma almofada de aquecimento quente, com gel de recuperação e algumas peças de chow umedecidas para recuperação.
       NOTA: O peróxido de hidrogênio auxilia na remoção do tecido mole restante do crânio.

5. Conectando animais ao sistema de aquisição

1. Cupoo o animal com as duas mãos para removê-lo da gaiola de aquisição e transferi-lo para uma área limpa com superfície plana, como uma Estação de Transferência de Animais (ATS).
2. Pegue suavemente o rato pela pele de suas costas. Não agarre o animal pela cauda, pois isso causa angústia.
3. Identifique a abertura no headmount Do EEG correspondente ao eletrodo do solo e combine o respectivo pino da corda para conexão adequada.
   NOTA: A conexão reversa da corda do deslocamento ao headmount animal resultará em uma leitura diferente dos eletrodos e formas de onda potencialmente distorcidas.
4. Devolva o animal à gaiola de aquisição e conecte a outra extremidade da corda (Sistema EEG 1) ou pré-amplificador (Sistema EEG 2) ao commuta.
   NOTA: Ao conectar o pré-amplificador (Sistema EEG 2) à corda do deslocamento, combine as marcas brancas nas extremidades de ambas as amarras. A conexão reversa resultará em danos permanentes do amplificador e requer reparos do fabricante, que são caros.
5. Gire suavemente a corda que liga o animal ao deslocamento para garantir que o mecanismo funcione corretamente e o animal possa se mover livremente.

6. Configurações de aquisição de dados da EEG

1. Defina os parâmetros de aquisição do EEG System 1.
   1. Definir a taxa de amostragem para 500 Hz; ganhar 5.000; modo Norma 35 Hz; LPN desligado. Defina o filtro de passe alto a 0,5 Hz.
      NOTA: 100 Hz (passe baixo) é embutido e não requer entrada manual.
2. Defina os parâmetros de aquisição do EEG System 2.
   1. Definir a taxa de amostragem para 600 Hz; pré-amp ganhar 100; ganho 1 (EEG1,2). Defina o filtro de passe baixo a 100 Hz.
      NOTA: 1 Hz (passe alto) é embutido e não requer entrada manual.

7. Configurações de aquisição de dados de vídeo

1. Defina parâmetros de aquisição para o Sistema EEG 1.
   NOTA: Um sistema de aquisição de vídeo de terceiros é necessário para obter dados de vídeo simultâneos.
   1. Definir a taxa de quadros entre 15 (mínimo recomendado) e 30 (máximo disponível) para a qualidade de vídeo adequada. Defina a resolução para 640 x 640 pixels. Definir o tipo de compressão em H.264H.
2. Defina parâmetros de aquisição para o Sistema EEG 2.
   NOTA: Este sistema EEG oferece um sistema de vídeo e um software que sincronizam os dados de vídeo e EEG juntos em um único arquivo para até quatro animais (ver Tabela de Materiais).
   1. Definir a taxa de quadros entre 15 (mínimo recomendado) e 30 (máximo disponível) para a qualidade de vídeo adequada. Defina a resolução para 640 x 480 pixels. Defina o tipo de compressão ao formato de arquivo WebM.

Resultados

O protocolo aqui descrito descreve o método de indução de uma lesão difusa isoladamente (por exemplo, na ausência de uma lesão focal) utilizando um modelo de camundongo de TBI difuso repetitivo (Figura 1). A Figura 1A retrata o dispositivo de queda de peso e seus componentes (Figura 1A, a1-a5) usadopara indução de TBI neste modelo e passos cruciais durante o procedimento (

Discussão

Em contraste com os modelos CCI e FPI induzindo ou focal ou combinação de lesão focal e difusa, o modelo de TBI difuso repetitivo descrito neste protocolo permite a indução de lesão difusa na ausência de lesão cerebral focal e não requer aberturas de couro cabeludo ou craniana e a inflamação associada. Um benefício adicional da ausência de craniectomia neste modelo é que ele permite não só implantar os eletrodos para gravação crônica contínua de EEG, mas também a criação de uma janela craniana de c...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.10" screw	Pinnacle Technology Inc., KS, USA	8209	0.10 inch long stainless steel
0.10" screw	Pinnacle Technology Inc., KS, USA	8403	0.10 inch long with pre-soldered wire lead
0.12" screw	Pinnacle Technology Inc., KS, USA	8212	0.12 inch long stainless steel
1EEG headmount	Invitro1 (subsidiary of Plastics One), VA, USA	MS333/8-A/SPC	3 individually Teflon-insulated platinum iridium wire electrodes (twisted or untwisted, 0.005 inch diameter) extending below threaded plastic pedestal
2EEG/1EMG headmount	Pinnacle Technology Inc., KS, USA	8201	2EEG/1EMG channels
3% hydrogen peroxide			Pharmacy
3EEG headmount	Pinnacle Technology Inc., KS, USA	8235-SM-C	custom 6-Pin Connector for 3EEG channels
Buprenorphine	Par Pharmaceuticals, Cos. Inc., Spring Valley, NY, USA	060969
Buprenorphine	Par Pharmaceuticals, Cos. Inc., Spring Valley, NY, USA	060969
C57BL/6 mice	Harlan/Envigo Laboratories Inc		male, 12-16 weeks old
C57BL/6 mice	The Jackson Laboratory		male, 12-16 weeks old
Carprofen	Zoetis Services LLC, Parsippany, NJ, USA	026357	NOTE: this drug is added during weight drop only if stereotactic electrode implantation will be performed on the same day
Chlorhexidine antiseptic			Pharmacy
Dental cement and solvent kit	Stoelting Co., USA	51459
Drill	Foredom	HP4-917
Drill bit	Meisinger USA, LLC, USA	HM1-005-HP	0.5 mm, Round, 1/4, Steel
Dry sterilizer	Cellpoint Scientific, USA		Germinator 500
EEG System 1	Biopac Systems, CA, USA
EEG System 2	Pinnacle Technology Inc., KS, USA
Ethanol ≥70%	VWR, USA	71001-652	KOPTEC USP, Biotechnology Grade (140 Proof)
Eye ointment	Pro Labs Ltd, USA		Puralube Vet Ointment Sterile Ocular Lubricant available in general online stores and pharmacies
Fluriso liquid for inhalation anesthesia	MWI Veterinary Supply Co., USA	502017
Hair removal product	Church & Dwight Co., Inc., USA		Nair cream
Isoflurane	MWI Veterinary Supply Co., USA	502017
Povidone-iodine surgical solution	Purdue Products, USA	004677	Betadine
Rimadyl/Carprofen	Zoetis Services LLC, Parsippany, NJ, USA	026357
Solder			Harware store
Soldering iron	Weller, USA	WP35	ST7 tip, 0.8mm
Stainless steel disc			Custom made
Sterile cotton swabs
Sterile gauze pads	Fisher Scientific, USA	22362178
Sterile poly-lined absorbent towels pads	Cardinal Health, USA	3520
Tissue adhesive	3M Animal Care Products, USA	1469SB