البنكرياس المشتقة الانسجه المستمدة مصفوفة بيونك للطباعة 3D خلايا البنكرياس لادن الانسجه يبني

Summary

مصفوفة خارج الخلية المكررة (dECM) يمكن ان توفر العظة البيئية الدقيقة مناسبه لتلخيص الوظائف المتاصله في الانسجه المستهدفة في بناء هندسيا. توضح هذه المقالة البروتوكولات الخاصة بالتقطير الوراثي لأنسجه البنكرياس ، وتقييم الحبر الحيوي dECM المشتق من انسجه البنكرياس ، وإنشاء انسجه البنكرياس ثلاثية الابعاد باستخدام تقنيه القرصنة البيولوجية.

Abstract

زرع الجزر البنكرياس هو علاج واعده للمرضي الذين يعانون من النوع 1 مرض السكري يرافقه نقص السكر في الكبد والمضاعفات الثانوية. ومع ذلك ، زرع جزيرة لا يزال لديها العديد من القيود مثل انخفاض القدرة علي البقاء من الجزر المزروعة بسبب الفقراء جزيرة البيئة المحيطة وعدائيه. الاضافه إلى ذلك ، الخلايا المنتجة للانسولين المتمايزة من الخلايا الجذعية مستحث الإنسان لديها قدره محدوده علي إفراز الهرمونات الكافية التي يمكن ان تنظم مستوي الجلوكوز في الدم. ولذلك ، فان تحسين النضج عن طريق الخلايا مع العظة المناسبة البيئية الدقيقة مطلوب بشده. في هذه المقالة ، ونحن توضيح البروتوكولات لاعداد مصفوفة الخلايا السرطانية المشتقة من انسجه البنكرياس (pdECM) بيونك لتوفير البيئة الدقيقة المفيدة التي يمكن ان تزيد من حساسية الجلوكوز من الجزر البنكرياس ، تليها وصف العمليات الخاصة بإنشاء انسجه البنكرياس ثلاثية الابعاد باستخدام تقنيه القرصنة المجهرية المستندة إلى الميكروبثق.

Introduction

في الاونه الاخيره ، يعتبر زرع جزيرة البنكرياس علاجا واعدا للمرضي الذين يعانون من مرض السكري من النوع 1. السلامة النسبية والحد الأدنى من الغزو من الاجراء هي مزايا كبيره لهذا العلاج¹. ومع ذلك ، لديها العديد من القيود مثل معدل النجاح المنخفض لعزل الجزر والآثار الجانبية للادويه المثبطة للمناعة. علاوة علي ذلك, ينخفض الرقم من [اينغرتد] جزائر باطراد بعد عمليه زرع واجبه إلى البيئة عدائيه². وقد تم تطبيق العديد من المواد الحيوية المتوافقة مثل الجينات ، الكولاجين ، بولي (حمض اللاكتيك-شارك-غليكوليك) (PLGA) أو البولي إيثيلين غليكول (PEG) لزرع جزيرة البنكرياس للتغلب علي هذه الصعوبات.

تظهر تقنيه الطباعة الخلوية ثلاثية الابعاد في هندسه الانسجه نظرا لإمكاناتها الكبيرة وأداءها العالي. وغني عن القول ان الأحبار الحيوية معروفه بأنها مكونات هامه لتوفير بيئة دقيقه مناسبه وتمكين تحسين العمليات الخلوية في تراكيب الانسجه المطبوعة. ويستخدم علي نطاق واسع عدد كبير من الهلام المائي ترقق القص مثل الليفينات ، الجينات ، والكولاجين والأحبار الحيوية. ومع ذلك ، تظهر هذه المواد نقص الهيكلية والكيميائية والبيولوجية والميكانيكية التعقيد مقارنه مع مصفوفة خارج الخلية (ECM) في الانسجه الاصليه³. الإشارات البيئية الدقيقة مثل التفاعلات بين الجزر الصغيرة و ECM هي إشارات هامه لتعزيز وظيفة الجزر. يمكن ان يعيد التركيب النوعي النسيجي لمكونات ECM المختلفة ، بما في ذلك الكولاجين ، الغليكوسامينوجليكانز ، والبروتينات السكرية (dECM). علي سبيل المثال ، الجزر الاساسيه التي تحتفظ ECMs الطرفية (علي سبيل المثال ، النوع الأول ، الثالث ، الرابع ، الخامس ، والسادس الكولاجين ، laminin ، وفيبروكتين) تظهر منخفضه المبرمج وحساسية الانسولين أفضل ، مما يدل علي ان التفاعلات خليه مصفوفة^{الانسجه}الخاصة مهمة لتعزيز قدرتها علي العمل

في هذه الورقة ، نقوم بتوضيح البروتوكولات الخاصة باعداد مصفوفة الخلايا السرطانية المشتقة من انسجه البنكرياس (pdECM) لتوفير الإشارات البيئية الدقيقة المفيدة لتعزيز نشاط ووظائف الجزر البنكرياس ، تليها عمليات توليد انسجه البنكرياس ثلاثية الابعاد باستخدام تقنيه القرصنة المجهرية (الشكل 1).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

تم جمع انسجه البنكرياس الخنازير من مسلخ محلي. تمت الموافقة علي التجارب الحيوانية من قبل لجنه الرعاية الحيوانية المؤسسية والاستخدام (IACUC) من مركز أسان الطبي ، سيول ، كوريا.

1-التقطير النسيجي

1. اعداد الحلول الخاصة بالتقطير.
   ملاحظه: يتم تخفيف 1x الفوسفات-مخزنه المالحة (تلفزيوني) المستخدمة في جميع الاستعدادات الحل عن طريق أضافه الماء المقطر إلى 10x تلفزيوني.
   1. ل 1 ٪ تريتون-X حل 100 ، تذوب 100 مل من 100 ٪ تريتون-X 100 حل في 900 mL من 1x تلفزيوني باستخدام شريط المغناطيسي ضجة مع التحريك في 150 rpm ل 6 ح. جعل 400 mL من 1 ٪ تريتون-X حل 100 مع 40 مل من 10 ٪ تريتون-X 100 الحل و 360 مل من 1x [ببس] أعدت فقط قبل استعمال.
      ملاحظه: يمكن تخزين حل 10 ٪ تريتون-X 100 في درجه حرارة الغرفة حتى الحاجة.
   2. لمحلول حمض البيروكسي 0.1 ٪ ، تمييع 8.5 مل من حمض البيرواستيك 4.7 ٪ إلى 22.8 مل من الايثانول 70 ٪ مع 368.7 مل من الماء المقطر فقط قبل الاستخدام.
2. أزاله الانسجه الطرفية من البنكرياس وشريحة الانسجه قبل التقطير.
   1. غسل البنكرياس الخنازير التي تم تقسيمها مع تشغيل مياه الصنبور وأزاله الانسجه الطرفية باستخدام مقص معقم.
   2. نقل البنكرياس إلى كيس من البلاستيك مع ملقط وتجميد في-80 درجه مئوية لمده 1 ساعة للمساعدة في خفض البنكرياس بشكل فعال للخطوة التالية.
   3. شريحة البنكرياس المجمدة في 1 مم قطعه سميكه باستخدام مبشره.
   4. نقل 50 غرام من الانسجه المقطعة إلى حاويه بلاستيكية 500 mL.
      ملاحظه: ويوصي الحاويات البلاستيكية مع غطاء هنا لحماية الانسجه من التلوث ومنع التبخر الحل.
3. العلاج مع الكواشف.
   ملاحظه: يجب ان تتم عمليه التقطير بأكملها في 4 درجه مئوية علي شاكر المدارية الرقمية في 150 دوره في الدقيقة. في جميع خطوات التقطير ، مطلوب مفرزه الجسدية باستخدام ملقط لمنع شرائح البنكرياس من التصاق معا. غسل الحاوية مع الماء المقطر ضروري لأزاله الكواشف المتبقية تماما في الحاوية.
   1. قبل اي علاج الكاشف ، وغسل 50 غرام من شرائح البنكرياس مع 300 mL من الماء المقطر باستخدام شاكر.
   2. يحرك النسيج بشكل مستمر في 150 لفه في الدقيقة حتى يختفي الماء الغائم (بعد حوالي 12 ساعة). استبدل الماء المقطر كل 2 ساعة.
      ملاحظه: ينصح بتغيير الماء المقطر كل ساعة لكفاءة أزاله المياه الغائمة بسرعة أكبر.
   3. تجاهل الماء وعلاج 50 غرام من الانسجه مع 400 مل من 1 ٪ تريتون-X 100 في 1x الحل بالنسبة 84 ح. تحديث الحل كل 12 ساعة.
      ملاحظه: عند هذه النقطة ، سينخفض مقدار الانسجه بسبب بدء أزاله المكونات الخلوية.
   4. علاج مع 400 مل من ايزوبروبانول (IPA) ل 2 ح لأزاله الدهون المتبقية من البنكرياس.
      ملاحظه: من الطبيعي ان يصبح النسيج صعبا بسبب أزاله الدهون في هذه العملية.
   5. بعد 2 ح ، وأزاله IPA وغسل الانسجه مع 400 مل من 1x تلفزيوني ل 24 ح. تحديث التلفزيوني 1x كل 12 ساعة.
   6. لتعقيم الانسجه المكررة ، وتجاهل الحل السابق وعلاج مع 400 مل من 0.1 ٪ حمض البيرواستيك في الايثانول 4 ٪ لمده 2 ساعة.
   7. لأزاله المنظفات المتبقية ، وغسل الانسجه مع 400 mL من 1x تلفزيوني ل 6 ح. تحديث الحل كل 2 ح.
   8. جمع الانسجه المكررة في أنبوب مخروطي 50 مل مع ملقط.
   9. تجميد العينة في-80 درجه مئوية ل 1 ح. تغطيه الأنبوب المخروطي مع مسحه خاليه من الوبر بدلا من الغطاء والإصلاح مع الشريط المطاطي لتحقيق التجميد الفعال.
   10. التجفيف بالتجميد الانسجه المكررة في-50 درجه مئوية ل 4 د.
       ملاحظه: بالنسبة للخطوة 1.3 ، 1 غرام من الانسجه غير المكررة يجب أيضا ان يكون تجميد المجففة في ظل نفس الظروف.

2. تقييم الانسجه المكررة

ملاحظه: لتقييم الكمية المتبقية من dsDNA ، الغليكوسامينوجليكانز (الكمامات) ، والكولاجين في الانسجه المكررة مقارنه بالانسجه الاصليه ، لا يقل عن 1 غرام من كل من الانسجه غير المكررة (الانسجه الاصليه) والانسجه المكررة مطلوبه لأحد دفعه من التقييم. يمكن حساب كميه dsDNA ، الكمامات ، والكولاجين علي أساس الوزن الجاف للانسجه.

1. اعداد حلول لاختبارات الكيمياء الحيوية.
   1. اعداد الحل بابين لهضم العينة.
      ملاحظه: يمكن تعديل مقدار المخزن المؤقت الذي سيتم وفقا لعدد العينات.
      1. حل 119 ملغ من 0.1 فوسفات الصوديوم M (أحادي) ، 18.6 ملغ من 0.5 mM Na2 ، و 8.8 ملغ من 5 مم السيستين-HCl في 10 مل من المياه المعقمة.
      2. ضبط درجه الحموضة من الحل إلى 6.5 عن طريق أضافه 10 M NaOH الحل.
      3. أضافه 125 μl من 10 mg/mL الحل الأسهم بابين إلى الحل أعلاه ودوامه ، والسماح لكل عنصر لخلط بالتساوي.
   2. اعداد حلول لفحص ثنائي ميثيل الميثيلين الأزرق (DMMB).
      1. لجعل صبغ DMMB ، تذوب 8 ملغ من 1 ، 9-ثنائي ميثيل ميثيلين الأزرق الزنك كلوريد الملح المزدوج ، 1.52 غرام من الجليسين ، و 1.185 غرام من كلوريد الصوديوم في 500 mL من المياه المعقمة. ضبط درجه الحموضة إلى 3 عن طريق أضافه 0.5 M HCl الحل في حين قياس التغير في درجه الحموضة باستخدام مقياس الأس الهيدروجيني اعلي مقاعد البدلاء. ثم ، تصفيه هذا من خلال فلتر فراغ زجاجه 500 mL الأعلى.
      2. جعل 15 μL من 10 ملغ/مل كبريتات الكوندرويتين A حل للمعيار.
   3. اعداد الحلول لفحص هيدروكسي برولين.
      1. لحل الكلورامين العمل ، حل 2.4 غرام من خلات الصوديوم ، 1 غرام من حامض الستريك ، و 0.68 غرام من هيدروكسيد الصوديوم في 24 مل من الماء المقطر وأضافه 240 μL من حمض الخليك الجليدية ، 10 μL من تولوين ، و 6 مل من IPA.
         ملاحظه: حل جميع مساحيق في الحل باستخدام خلاط دوامه. ويمكن تخزين محلول الكلورامين العمل في 4 درجه مئوية لمده تصل إلى ثلاثه أشهر.
      2. لمحلول الكلورامين T ، حل 0.35 غرام من الكلورامين T في 20 مل من محلول الكلورامين العمل وأضافه 2.5 مل من IPA. دوامه لخلط جميع المكونات.
         ملاحظه: تحضير مباشره قبل الاستخدام.
      3. ل P-داب الحل ، ووضع 3.75 غرام من ف-داب في 6.5 مل من حمض البيروكلوريك و 15 مل من IPA ؛ التفاف عليه في رقائق ألومنيوم.
         ملاحظه: تحضير مباشره قبل الاستخدام.
2. أضافه 1 مل من محلول بابين إلى 10 ملغ من الانسجه المجففة في أنبوب الطرد المركزي 1.5 mL ودوامه أنبوب لهضم أفضل العينة.
3. وضع 1.5 mL أنبوب الطرد المركزي في رف المطاط وهضم العينات في الكاس 500 mL الذي يحتوي علي 300 mL من الماء في 60 درجه مئوية لمده 16 ساعة.
4. جهاز الطرد المركزي في 9,500 x g لمده 20 دقيقه ، وجمع supernatant ، ونقله إلى أنبوب جديد.
5. تحديد كميه الحمض النووي المتبقي والبروتينات الرئيسية في الانسجه المكررة.
   1. تحميل 1 μL من عينه هضمها في مطياف وقياس كميه dsDNA وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
      ملاحظه: يجب علي المجرب ربط شعرهم مره أخرى وارتداء قناع لتجنب تلويث العينة.
6. اجراء فحص DMMB لقياس كميه الكمامات التي لا تزال في الانسجه المكررة.
   1. مزيج 1 μL من كبريتات الكوندرويتين A حل و 499 μL من 1x تلفزيوني لجعل المعايير. تمييع كبريتات الكوندرويتين A حل مع الماء المقطر في تركيزات من 0, 4, 8, 12, 16, و 20 ميكروغرام/مل.
   2. تحميل تريبليكاتيس من 50 μl من كل تركيز من العينات القياسية وهضمها في لوحه 96-حسنا.
   3. أضافه 200 μL من صبغ DMMB لكل بئر باستخدام ماصه متعددة القناات.
   4. قراءه علي الفور الامتصاص في 525 nm علي قارئ اللوحة الدقيقة.
7. اجراء فحص هيدروكسيبرولاين لقياس كميه الكولاجين.
   1. لاجراء فحص هيدروكسيبرولين ، احتضان 250 μL من عينه هضمها مع كميات متساوية من HCl في 120 درجه مئوية ل 16 ساعة.
   2. تجفيف بقايا في درجه حرارة الغرفة لمده 3 ساعات لتبريد العينات ومن ثم أعاده حل العينات في 1 مل من 1x تلفزيوني.
   3. جهاز الطرد المركزي في 2,400 x g ل 10 دقيقه في 4 °c.
   4. اعداد 100 ميكروغرام/مل محلول هيدروكسيبرولين كمعيار.
   5. تمييع محلول هيدروكسيبرولين مع الماء المقطر بتركيز 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 15, 20, 30 ميكروغرام/مل للحل القياسي.
   6. تحميل تريبليكاتيس من 50 μl من العينات والحل القياسي في لوحه 96-حسنا.
   7. أضافه 50 μL من محلول الكلورامين T ثم احتضان لمده 20 دقيقه في درجه حرارة الغرفة.
   8. أضافه 50 μL من الحل ف-داب واحتضان لمده 30 دقيقه في 60 درجه مئوية.
      ملاحظه: Aliquot في غرفه مظلمة. بعد الاضافه ، التفاف لوحه مع رقائق ألومنيوم.
   9. احتضان في درجه حرارة الغرفة لمده 30 دقيقه.
   10. بعد التبريد ، وقياس الامتصاص في 540 نانومتر علي قارئ ميكروبلايت.

3-اعداد الحبر الحيوي

ملاحظه: يمكن تخزين مسحوق pdecm ثابت في-80 درجه مئوية لمده سنه واحده علي الأقل. قبل تعديل الأس الهيدروجيني ، يمكن تخزين محلول pdECM المهضوم عند-20 درجه مئوية لمده شهر واحد. قبل الاستخدام ، تذويب العينة من محلول pdECM المجمدة في 4 درجه مئوية بين عشيه وضحيها. يمكن تخزين محلول pdECM المعدل بدرجه الحموضة عند 4 درجات مئوية لمده تصل إلى أسبوع واحد. يمكن تخزين محلول pdECM المهضوم عند درجه حرارة 4 درجات مئوية لبضعة أيام علي الأقل ولكن يجب الا يتجاوز أسبوعا واحدا.

1. هضم التجميد المجفف pdECM مع البيبسين.
   1. للهضم الفعال للحبر الحيوي ، يطحن pdECM المجفف بالتجميد مع النيتروجين السائل باستخدام مدفع هاون ومدقه.
   2. جمع 200 ملغ من مسحوق pdECM في أنبوب مخروطي 50 mL وأضافه 20 ملغ من البيبسين و 8.4 mL من حمض الخليك 0.5 M (التركيز النهائي هو 2 w/v ٪).
   3. وضع شريط تحريك المغناطيسي في أنبوب مخروطي 50 mL ويحرك في 300 دوره في الدقيقة ل 96 h.
2. ضبط درجه الحموضة من محلول pdECM هضمها.
   ملاحظه: من أجل تجنب دبق قبل تعديل درجه الحموضة ، وينبغي اجراء هذه العملية علي الجليد.
   1. تصفيه الجزيئات غير مهضوم في محلول pdECM باستخدام مصفاه خليه 40 μm باستخدام ماصه الازاحه ايجابيه علي الجليد للحصول علي الهضم الأمثل للأجزاء.
   2. أضافه 1 مل من التلفزيونية 10x ودوامه قبل استخدام NaOH.
   3. ضبط درجه الحموضة إلى 7 مع NaOH 10 م التحقق من درجه الحموضة مع شرائط مؤشر الأس الهيدروجيني.
      ملاحظه: دوامه في كل مره يتم أضافه NaOH بحيث يتم خلط تماما الحبر الحيوي مع الكواشف الأخرى.

4. تحليل الريولوجيكال

1. الاعداد التجريبي
   1. اعداد 1.5% (w/v) من الحبر الحيوي pdECM لتقييم خصائص الريولوجيكال.
   2. إنشاء هندسه لوحه مخروط 20 مم (القطر المخروطي 20 ملم مع زاوية 2 °) في وضع التحكم في المعدل لمقياس الرطوبة.
   3. قم بإنشاء تسلسلات تجريبية في البرنامج المثبت (trios) لقياس اللزوجة ، وحركيه دبق ، والمعامل الديناميكي للحبر الحيوي pdecm.
      1. اللزوجة: ضع الحبر الحيوي pdECM علي اللوحة. قياس اللزوجة المعقدة (Pa · s) من pdECM بيونك تحت معدل القص المتزايد من 1 إلى 1,000 s^-1 في درجه حرارة ثابته من 15 درجه مئوية.
      2. حركيه gelation: وضع الحبر الحيوي pdECM علي لوحه. احسب المعامل المعقد (G *) عن طريق قياس معامل التخزين والخسارة الخاص بالحبر الحيوي pdECM عند 4-37 درجه مئوية بمعدل زيادة تزايدي يبلغ 5 درجات مئوية/دقيقه (وضع الاجتياح الزمني).
      3. المعامل الديناميكي: ضع الحبر الحيوي pdECM علي لوحه في 37 درجه مئوية لمده 60 دقيقه قبل القياس. قياس معامل التخزين المعتمد علي التردد (G ') ومعامل الخسارة (G ') من الحبر الحيوي pdECM في نطاق 0.1-100 راد/ثانيه في سلاله 2 ٪.

5.3D الطباعة الخلية من انسجه البنكرياس يبني باستخدام جزيرة

1. اعداد الجزر المنعزلة
   1. عزل الجزر الاساسيه من الفئران وفقا للبروتوكولات الموصوفة في العمل السابق⁵.
   2. لفصل الحطام والخلايا الميتة من جزيرة معزولة ، وتمرير تعليق الخلية من خلال مصفاه خليه 70 μm. تعتبر الجزر الصغيرة ذات القطر الأصغر من 70 ميكرومتر ميتة أو غير طبيعيه.
   3. تعليق الجزر المعزولة في RPMI-1640 المتوسطة ووضعها علي طبق بتري. أزاله الجزر أكبر من 300 μm في القطر باستخدام ماصه حجم P200 تحت المجهر (4x عدسه الهدف) في مجلس السلامة الاحيائيه.
2. جزيرة التغليف في الحبر الحيوي pdECM
   1. اعداد الأس الهيدروجيني المعدلة pdECM الحبر الحيوي وجزيرة معزولة.
      ملاحظه: لتجنب دبق قبل تعديل درجه الحموضة ، يجب ان يتم تنفيذ هذه العملية علي الجليد.
   2. امزج برفق الحبر الحيوي pdECM والوسائط المعلقة مع الجزر (النسبة 3:1) باستخدام ماصه الازاحه الموجبة حتى تمتزج بشكل متجانس.
      ملاحظه: التركيز النهائي للحبر الحيوي pdECM هو 1.5 ٪ وكثافة الخلايا في الحبر الحيوي pdECM هو 3,000 IEQ/mL.
3. 3D الطباعة الخلية من يبني انسجه البنكرياس
   1. اعداد حقنه معقمه و 22 G فوهه.
      ملاحظه: تم تحديد هذا المقياس لطباعه الجزر التي يبلغ قطرها 100-250 μm.
   2. تحميل جزيرة لادن pdECM بيونك في الحقنه.
   3. اطبع الحبر الحيوي مع حاله الطباعة المحسنة (معدل التغذية: 150 مم/دقيقه ؛ الضغط الهوائي: 15 كيلو باسكال) عند 18 درجه مئوية في شكل شعريه.
   4. للربط بين الحبر الحيوي ، ضع البناء المطبوع في الحاضنة لمده 30 دقيقه.
   5. تزج بناء المطبوعة في وسائل الاعلام جزيرة الثقافة التي هي RPMI-1640 المتوسطة تستكمل مع 10 ٪ الجنين البقري المصل (ار بي) ، 100 U/mL البنسلين و 100 اليورانيوم/mL ستربتوميسين.

6.3D الطباعة الخلية من بناء البنكرياس مع هيكل منقوشة

1. اعداد نوعين من الحبر الحيوي
   1. للتحقق من براعة الطباعة باستخدام الأحبار الحيوية متعددة ، واعداد مجموعتين من الأحبار الحيوية pdECM ووصمه عار لهم عن طريق أضافه 0.4 ٪ تريان الأزرق وارتفع البنغال الحل في كل pdECM bioinks بنسبه 1:20 ، علي التوالي.
      ملاحظه: لتجنب دبق قبل تعديل درجه الحموضة ، وينبغي اجراء هذه العملية علي الجليد.
   2. امزج برفق الحبر الحيوي pdECM والوسائط المعلقة مع الجزر (النسبة 3:1) باستخدام ماصه الازاحه الموجبة حتى تمتزج بشكل متجانس.
      ملاحظه: التركيز النهائي للحبر الحيوي pdECM هو 1.5 ٪ وكثافة الخلايا في الحبر الحيوي pdECM هو 3,000 IEQ/mL.
2. الطباعة الخلوية ثلاثية الابعاد لتركيبات انسجه البنكرياس المستندة إلى الأساس القضائي
   1. اعداد المحاقن المعقمة وفوهه 25 G.
   2. تحميل كل الحبر الحيوي (الأزرق والأحمر) في اثنين من المحاقن المختلفة ، علي التوالي.
   3. اطبع الحبر الحيوي مع حاله الطباعة المحسنة (معدل التغذية: 150 مم/دقيقه ؛ الضغط الهوائي: 15 كيلو باسكال) عند 18 درجه مئوية في شكل شعريه بخطوط متناوبه من اللونين الأزرق والأحمر.
   4. للربط بين الحبر الحيوي ، ضع البناء المطبوع في الحاضنة لمده 30 دقيقه.
   5. تزج بناء المطبوعة في وسائل الاعلام جزيرة الثقافة التي هي RPMI-1640 المتوسطة تستكمل مع 10 ٪ الجنين البقري المصل (ار بي) ، 100 U/mL البنسلين و 100 اليورانيوم/mL ستربتوميسين.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

التقطير من انسجه البنكرياس
طورنا عمليه اعداد الحبر الحيوي pdECM لتوفير بيئات مجهريه خاصه بانسجه البنكرياس لتعزيز وظائف الجزر الصغيرة في بناء الانسجه البيولوجية ثلاثية الابعاد (الشكل 2ا). بعد عمليه التقطير ، تمت أزاله 97.3% من dsDNA وبقيت مكو?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

وقد وصف هذا البروتوكول تطور الأحبار الحيوية pdECM وتصنيع انسجه البنكرياس ثلاثية الابعاد باستخدام تقنيات الطباعة الخلوية ثلاثية الابعاد. لتلخيص البيئة المجهرية للانسجه المستهدفة في بناء الانسجه المهندسة ثلاثية الابعاد ، يعتبر اختيار الحبر الحيوي أمرا حاسما. في دراسة سابقه ، قمنا بالتحقق م...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Biological Safety Cabinets	CRYSTE	PURICUBE 1200
Deep Freezer	Thermo Scientific Forma	957
Digital orbital shaker	DAIHAN Scientific	DH.WSO04010
Dry oven	DAIHAN Scientific	WON-155
Freeze dryer	LABCONCO	7670540
Fridge	SANSUNG	CRFD-1141
Grater	ABM	1415605793
Inverted Microscopes	Leica	DMi1
Microcentrifuge	CRYSTE	PURISPIN 17R
Microplate reader	Thermo Fisher Scientific	Multiskan GO
Mini centrifuge	DAIHAN Scientific	CF-5
Multi-Hotplate Stirrers	DAIHAN Scientific	SMHS-6
Nanodrop	Thermo Fisher Scientific	ND-LITE-PR
pH benchtop meter	Thermo Fisher Scientific	STARA2110
Rheometer	TA Instrument	Discovery HR-2
Vortex Mixer	DAIHAN Scientific	VM-10
Cirurgical Instruments
Operating Scissors	Hirose	HC.13-122
Forcep	Korea Ace Scientific	HC.203-30
Materials
1.7 mL microcentrifuge tube	Axygen	MCT-175-C
10 ml glass vial	Scilab	SL.VI1243
40 µm cell strainer	Falcon	352340
5 L beaker	Dong Sung Science	SDS 2400
50 mL cornical tube	Falcon	352070
500 mL beaker	Korea Ace Scientific	KA.23-08
500 mL bottle-top vacuum filter	Corning	431118
500 mL plastic container	LOCK&LOCK	INL301
96well plate	Falcon	353072
Aluminum foil	DAEKYO
Kimwipe	Kimtech
Magnetic bar	Korea Ace Scientific	BA.37110-0003
Mortar and pestle	DAIHAN Scientific	SC.MG100
Multi-channel pipettor	Eppendorf	4982000314
Petri Dish	SPL	10100
pH indicator strips	Sigma-Aldrich	1095350001
Sieve filter mesh	DAIHAN Scientific
Decellularization
10x pbs	Hyclone	SH30258.01
4.7% Peracetic acid	Omegafarm
70% ethanol	SAMCHUN CHEMICALS	E0220 SAM
Distilled water
IPA	SAMCHUN CHEMICALS	samchun I0348
Triton-X 100	Biosesang	T1020
Biochemical assay
1,9-Dimethyl-Methylene Blue zinc chloride double salt	Sigma-Aldrich	341088
10 N NaOH	Biosesang	S2018
Chloramine T	Sigma-Aldrich	857319
Chondroitin sulfate A	Sigma-Aldrich	C4384
Citric acid	Supelco	46933
Cysteine-HCl	Sigma-Aldrich	C1276
Glacial acetic acid	Merok	100063
Glycine	Sigma-Aldrich	410225
HCl	Sigma-Aldrich	H1758
Na2-EDTA	Sigma-Aldrich	E5134
NaCl	SAMCHUN CHEMICALS	S2097
Papain	Sigma-Aldrich	p4762
P-DAB	Sigma-Aldrich	D2004
Perchloric acid	Sigma-Aldrich	311421
Sodium acetate	Sigma-Aldrich	S5636
Sodium hydroxide	Supelco	SX0607N
Sodium phosphate(monobasic)	Sigma-Aldrich	RDD007
Toluene	Sigma-Aldrich	244511
Bioink
Charicterized FBS	Hyclone	SH30084.03
Penicillin-Streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140122
Pepsin	Sigma-Aldrich	P7215
Rose bengal	Sigma-Aldrich	198250
RPMI-1640 medium	Thermo Fisher Scientific	11875093
Trypan Blue solution	Sigma-Aldrich	T8154