用于打印 3D 细胞-拉丹胰腺组织构造的胰腺组织衍生细胞外基质生物墨水

摘要

去细胞化细胞外基质（dECM）可以提供合适的微环境线索，以在工程结构中重述目标组织的固有功能。本文阐述了胰腺组织去细胞化、胰腺组织衍生dECM生物油墨评价以及利用生物印刷技术生成3D胰腺组织构造的方案。

摘要

胰腺胰岛移植是1型糖尿病患者有低血糖和继发性并发症的一种有前途的治疗方法。然而，胰岛移植仍然有几个限制，如移植胰岛由于贫困胰岛移植和恶劣环境而存活率低。此外，从人类多能干细胞中分化的胰岛素生成细胞具有有限的分泌足够的激素的能力，这些激素可以调节血糖水平;因此，迫切需要通过培养具有适当微环境线索的细胞来改善成熟。在本文中，我们阐明了制备胰腺组织衍生的细胞外基质 （pdECM） 生物墨水的协议，以提供一个可增加胰腺胰岛葡萄糖敏感性的有益微环境，然后描述使用基于微糊精的生物印版技术生成3D胰腺组织构建的过程。

引言

最近，胰腺胰岛移植被认为是对1型糖尿病患者的一种有前途的治疗方法。该手术的相对安全性和最小侵入性是这种治疗¹的很大优势。然而，它有一些限制，如分离胰岛的低成功率和免疫抑制药物的副作用。此外，由于恶劣的环境^2，移植后移植胰岛的数量稳步减少。各种生物相容性材料，如藻酸盐、胶原蛋白、聚（乳胶共甘油酸）或聚乙烯乙二醇（PEG）已应用于胰岛移植，以克服这些困难。

3D细胞打印技术以其巨大的潜力和高性能在组织工程中不断涌现。不用说，生物油墨被称为提供合适的微环境，并促成印刷组织结构中细胞过程改善的重要成分。大量的剪切变薄水凝胶，如纤维蛋白、藻酸盐和胶原蛋白被广泛用作生物油墨。然而，与原生组织³中的细胞外基质（ECM）相比，这些材料表现出缺乏结构、化学、生物和机械的复杂性。微环境提示，如胰岛和ECM之间的相互作用，是增强胰岛功能的重要信号。脱细胞化ECM（dECM）可以重新创建各种ECM成分的组织特异性组合物，包括胶原蛋白、糖氨基甘油（GAG）和糖蛋白。例如，保留其周围E意象带的初级胰岛（例如，I型、III型、IV型、V型和VI型胶原蛋白、拉米宁和纤维素）表现出低细胞凋亡和更好的胰岛素敏感性，这表明组织特异性细胞-基质相互作用对于增强其与原始组织⁴类似的功能能力非常重要。

在本文中，我们阐明了制备胰腺组织衍生的去细胞外基质（pdECM）生物油墨的方案，为增强胰腺胰岛的活性和功能提供有益的微环境提示，然后使用基于微糊精的生物印刷技术生成3D胰腺组织结构的过程（图1）。

研究方案

猪胰腺组织是从当地的屠宰场收集的。动物实验得到了韩国首尔亚山医学中心机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。

1. 组织去细胞化

1. 准备脱细胞化的解决方案。
   注:所有溶液制剂中使用的1倍磷酸盐缓冲盐水（PBS）通过向10x PBS中加入蒸馏水稀释。
   1. 对于 1% Triton-X 100 溶液，使用磁搅拌棒在 150 rpm 下搅拌 6 小时，在 900 mL 的 1x PBS 中溶解 100 mL 的 100% Triton-X 100 溶液。使用 40mL 的 Triton-X 100 溶液和 360 mL 的 1x 溶液，使 400 mL 的 Triton-X 100 溶液PBS 在使用前准备。
      注:10% Triton-X 100 溶液可在室温下储存，直到需要为止。
   2. 对于0.1%的过乙酸溶液，在使用前将8.5 mL的4.7%过氧乙酸稀释成22.8 mL的70%乙醇，使用前使用368.7 mL蒸馏水。
2. 在去细胞化之前，切除胰腺的周围组织并切片。
   1. 用自来水清洗被切除的猪胰腺，并用消毒剪刀去除周围组织。
   2. 将胰腺转移到塑料袋中，用钳子冷冻在-80°C下1小时，以帮助有效切割胰腺，为下一步。
   3. 使用搅拌机将冷冻胰腺切成 1 毫米厚的片件。
   4. 将50克切片组织转移到500 mL塑料容器中。
      注:此处推荐使用带盖子的塑料容器，以保护组织免受污染并防止溶液蒸发。
3. 用试剂治疗。
   注:整个去细胞化过程应在4°C下在150rpm的数字轨道摇床上进行。在所有去细胞化步骤中，需要使用钳子进行物理分离，以防止胰腺切片粘在一起。使用蒸馏水清洗容器是彻底去除容器中残留试剂所必需的。
   1. 在进行任何试剂处理之前，使用摇床用 300 mL 蒸馏水清洗 50 克切片胰腺。
   2. 在 150 rpm 转速下连续搅拌组织，直到浑浊的水消失（大约 12 小时后）。每 2 小时更换一次蒸馏水。
      注意:建议每小时更换蒸馏水一次，以提高效率，以更快地去除浑浊的水。
   3. 丢弃水，用 400 mL 的 1% Triton-X 100 在 1x PBS 溶液中处理 50 g 组织，每次 84 小时刷新一次溶液。
      注:此时，组织量将减少，因为细胞成分开始被移除。
   4. 用400 mL的异丙醇 （IPA） 治疗 2 小时，从胰腺中去除剩余的脂肪。
      注:由于在这个过程中去除脂肪，组织变得坚韧是正常的。
   5. 2小时后，取出 IPA，用 400 mL 的 1x PBS 清洗组织 24 小时。每 12 小时刷新 1x PBS。
   6. 要对脱细胞组织进行灭菌，丢弃以前的溶液，用4%乙醇中的400 mL 0.1%的过乙酸处理2小时。
   7. 要去除残留洗涤剂，请用 400 mL 的 1x PBS 清洗组织 6 小时，每 2 小时刷新一次溶液。
   8. 将脱细胞组织与钳子一起收集在50 mL锥形管中。
   9. 将样品在-80°C冷冻1小时。用无绒抹布代替盖子盖住圆锥管，并用橡皮筋固定，以便有效冻干。
   10. 在-50°C下使脱细胞组织冻干4d。
       注:对于步骤1.3，1克非细胞化组织也应在相同条件下冷冻干燥。

2. 脱细胞组织评估

注:要评估脱细胞组织中dsDNA、甘油糖和胶原蛋白与原生组织相比的残留量，一个非细胞化组织（原生组织）和脱细胞组织至少需要1克一批评估。dsDNA、GAG 和胶原蛋白的量可以根据组织的干重计算。

1. 为生化检测准备解决方案。
   1. 准备木瓜溶液进行样品消化。
      注: 可以根据样本数量调整要制作的缓冲器量。
      1. 在10 mL的高压水中溶解119毫克的0.1M磷酸钠（单基），18.6毫克的0.5m Na2-EDTA，以及8.8毫克的5mM半胱氨酸-HCl。
      2. 通过添加 10 M NaOH 溶液，将溶液的pH量调整到 6.5。
      3. 在上述溶液和涡旋中加入125 μL的10mg/mL木瓜素溶液，使每个元素均匀混合。
   2. 为二甲基亚甲蓝 （DMMB） 测定准备解决方案。
      1. 要制造DMMB染料，在500 mL的高压水中溶解8毫克1，9-二甲基-二甲基蓝色氯化锌双盐、1.52克甘氨酸和1.185克NaCl。通过添加 0.5 M HCl 溶液，同时使用台式 pH 计测量 pH 变化，将 pHH 调整为 3。然后，通过 500 mL 瓶顶真空过滤器进行过滤。
      2. 使15μL的10毫克/mL软骨素硫酸软骨素一种溶液为标准。
   3. 为羟丙氨酸测定准备解决方案。
      1. 对于氯胺工作溶液，在24 mL蒸馏水中溶解2.4克醋酸钠、1克柠檬酸和0.68克氢氧化钠，加入240μL的冰川醋酸、10μL的甲苯和6 mL的IPA。
         注:使用涡旋混合器溶解溶液中的所有粉末。氯胺工作溶液可在4°C下储存长达三个月。
      2. 对于氯胺T溶液，在20 mL的氯胺工作溶液中溶解0.35克氯胺T，并加入2.5 mL的IPA。涡旋混合所有组件。
         注:在使用前立即准备。
      3. 对于P-DAB溶液，将3.75克P-DAB放入6.5 mL的高氯酸和15 mL的IPA中;把它包裹在铝箔里。
         注:在使用前立即准备。
2. 在1.5 mL微离心管和涡流管中加入1mL的木瓜溶液到10mg的冻干组织中，以更好地消化样品。
3. 将 1.5 mL 微离心管放入橡胶架中，在含有 300 mL 水的 500 mL 烧杯中消化样品，在 60°C 下 16 小时。
4. 在9，500 x g下离心20分钟，收集上清液，并将其转移到新管中。
5. 量化脱细胞组织中的残留DNA和主要蛋白质。
   1. 将1μL的消化样品加载到光谱仪中，并根据制造商的说明测量dsDNA的量。
      注:实验者应把头发系在背上，戴上口罩，以免污染样品。
6. 执行 DMMB 测定，以量化非细胞化组织中残留的 GAG 量。
   1. 混合 1 μL 硫酸软骨素 A 溶液和 499 μL 的 1x PBS，以制定标准。用浓度为0、4、8、12、16和20 μg/mL的蒸馏水稀释硫酸软骨素溶液。
   2. 将标准浓度的50μL加载到96孔板中，并将样品消化成96孔板。
   3. 使用多通道移液器将 200 μL 的 DMMB 染料添加到每个井中。
   4. 立即读取微孔板读取器上 525 nm 处的吸光度。
7. 执行羟基丙氨酸测定，以量化胶原蛋白的量。
   1. 为了进行羟基丙氨酸测定，在120°C下孵育250μL的消化样品，在120°C下孵育16小时。
   2. 在室温下干燥残留物 3 小时，冷却样品，然后将样品重新溶解在 1 mL 的 1x PBS 中。
   3. 在 2，400 x g下在 4°C 下离心 10 分钟。
   4. 准备100微克/mL羟基丙氨酸溶液作为标准。
   5. 将羟基丙氨酸溶液与蒸馏水稀释，浓度为0、1、2、3、4、5、6、8、10、15、20、30 μg/mL，用于标准溶液。
   6. 将 50 μL 样品和标准溶液的三重装装入 96 孔板中。
   7. 加入50μL氯胺T溶液，然后在室温下孵育20分钟。
   8. 加入50μL的p-DAB溶液，在60°C下孵育30分钟。
      注:在黑暗的房间里，加后，用铝箔包裹板。
   9. 在室温下孵育30分钟。
   10. 冷却后，在微孔板读取器上测量 540 nm 处的吸光度。

3. 生物油墨制备

注:pdECM粉末可在-80°C下稳稳储存至少一年。在pH值调整之前，消化的pdECM溶液可以在-20°C下储存一个月。使用前，在4°C下解冻冷冻pdECM溶液样品过夜。pH 调节的 pdECM 溶液可在 4°C 下存储长达一周。消化的pdECM溶液可在4°C下储存至少几天，但不应超过1周。

1. 用胰蛋白酶消化冷冻干燥的pdECM。
   1. 为了有效消化生物墨水，使用砂浆和虫子用液氮粉碎冻干pdECM。
   2. 在 50 mL 锥形管中收集 200 mg 的 pdECM 粉末，加入 20 mg 的胰蛋白酶和 8.4 mL 的 0.5 M 醋酸（最终浓度为 2 w/v%）。
   3. 将磁力搅拌棒放入 50 mL 锥形管中，在 300 rpm 下搅拌 96 小时。
2. 调整消化的 pdECM 溶液的 pH。
   注:为了避免在pH调整前凝胶化，应在冰上进行此过程。
   1. 使用 40 μm 细胞过滤器在冰上使用正位移移液器过滤出 pdECM 溶液中的未消化颗粒，以获得部件的最佳消化。
   2. 在使用 NaOH 之前，添加 1mL 的 10x PBS 和涡流。
   3. 将 pH 调整为 7，使用 pH 指示器条检查 pH。
      注:每次添加 NaOH 时，涡旋，以便生物墨水与其他试剂彻底混合。

4. 学变分析

1. 实验设置
   1. 准备 pdECM 生物墨水的 1.5%（w/v）以评估变菌特性。
   2. 在流速计速率控制模式下建立 20 mm 锥形板几何形状（圆锥直径 20 mm，角度为 2°）。
   3. 在已安装的软件 （TRIOS） 中创建实验序列，以测量 pdECM 生物墨水的粘度、凝胶动力学和动态模量。
      1. 粘度:将 pdECM 生物墨水放在板上。在 15°C 的恒温下，在剪切速率从 1 到 1，000^s-1的剪切速率下测量 pdECM 生物油墨的复杂粘度 （Paμs）。
      2. 凝胶动力学:将 pdECM 生物墨水放在板上。通过测量 pdECM 生物墨水在 4-37 °C 下的存储和损耗模量，以 5 °C/min （时间扫描模式） 的增量增长率计算复模量 （G+）。
      3. 动态模量:在测量前将 pdECM 生物墨水置于 37°C 的板上 60 分钟。测量 pdECM 生物油墨的频率相关存储模量 （G'） 和损耗模量 （G''），在 2% 应变时，频率依赖存储模量 （G''） 在 0.1-100 rad/s 范围内。

5. 使用胰岛进行胰腺组织构造的三维细胞打印

1. 准备隔离小岛
   1. 根据先前工作⁵中描述的协议，从大鼠中分离出主胰岛。
   2. 要将碎片和死细胞从隔离的小岛中分离出来，请通过70μm细胞过滤器将细胞悬浮液通过。直径小于70μm的胰岛被认为是死岛或异常的。
   3. 在 RPMI-1640 介质中悬浮隔离的小岛，并将其放在培养皿上。在生物安全柜中使用显微镜下的 P200 体积移液器（4x 物镜）去除直径大于 300 μm 的小岛。
2. 滑入 pdECM 生物墨水的岛
   1. 准备pH调整的pdECM生物墨水和隔离小岛。
      注:为了避免在pH调整前凝胶化，应在冰上执行此过程。
   2. 使用正位移移液器将 pdECM 生物墨水和悬浮介质与胰岛（比 3:1）轻轻混合，直到均匀混合。
      注:pdECM生物墨水的最终浓度为1.5%，pdECM生物墨水中的细胞密度为3，000 IEQ/mL。
3. 胰腺组织构造的3D细胞打印
   1. 准备消毒注射器和 22 G 喷嘴。
      注:此仪表选用于打印直径为 100-250 μm 的小岛。
   2. 将装有小岛的 pdECM 生物墨水装入注射器中。
   3. 以格子形状在 18°C 下打印具有优化打印条件的生物墨水（进给率:150 mm/min;气动压力:15 kPa）。
   4. 要将生物墨迹交错，将打印的构造置于培养箱中 30 分钟。
   5. 将印刷结构浸入小岛培养基中，即 RPMI-1640 介质，辅以 10% 胎儿牛血清 （FBS）、100 U/mL 青霉素和 100 U/mL 链霉素。

6. 具有图案结构的胰腺结构的三维细胞打印

1. 两种生物油墨的制备
   1. 为了验证使用多种生物油墨的印刷多功能性，准备两组 pdECM 生物油墨，并在每个 pdECM 生物油墨中分别添加 0.4% 的 Trypan 蓝和玫瑰孟加拉溶液，比例分别为 1:20。
      注:为了避免在pH调整前凝胶化，应在冰上进行此过程。
   2. 使用正位移移液器将 pdECM 生物墨水和悬浮介质与胰岛（比 3:1）轻轻混合，直到均匀混合。
      注:pdECM生物墨水的最终浓度为1.5%，pdECM生物墨水中的细胞密度为3，000 IEQ/mL。
2. 多物质胰腺组织构造的三维细胞打印
   1. 准备消毒注射器和25G喷嘴。
   2. 将每个生物墨水（蓝色和红色）分别装入两个不同的注射器中。
   3. 在 18°C 下以蓝色和红色交替线的晶格形状打印具有优化打印条件的生物墨水（进给率:150 mm/min;气动压力:15 kPa）。
   4. 要将生物墨迹交错，将打印的构造置于培养箱中 30 分钟。
   5. 将印刷结构浸入小岛培养基中，即 RPMI-1640 介质，辅以 10% 胎儿牛血清 （FBS）、100 U/mL 青霉素和 100 U/mL 链霉素。

结果

胰腺组织的去细胞化
我们开发了制备 pdECM 生物墨水的工艺，以提供胰腺组织特定的微环境，以增强 3D 生物打印组织结构中的胰岛功能（图 2A）。脱细胞化过程后，97.3%的dsDNA被去除，胶原蛋白和GAG等代表性ECM成分与原生胰腺组织相比分别保持在1278.1%和96.9%（图2B）。

讨论

该协议描述了pdECM生物油墨的开发以及使用3D细胞打印技术构建3D胰腺组织结构。要概括3D工程组织构造中目标组织的微环境，生物油墨的选择至关重要。在以前的研究中，我们验证了组织特异性的dECM生物油墨有利于促进干细胞分化和增殖^10。与合成聚合物相比，dECM可以作为一个有利于细胞的环境，因为组织特异性的组成和结构^11。因此，在dECM中主要部件的高保?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Biological Safety Cabinets	CRYSTE	PURICUBE 1200
Deep Freezer	Thermo Scientific Forma	957
Digital orbital shaker	DAIHAN Scientific	DH.WSO04010
Dry oven	DAIHAN Scientific	WON-155
Freeze dryer	LABCONCO	7670540
Fridge	SANSUNG	CRFD-1141
Grater	ABM	1415605793
Inverted Microscopes	Leica	DMi1
Microcentrifuge	CRYSTE	PURISPIN 17R
Microplate reader	Thermo Fisher Scientific	Multiskan GO
Mini centrifuge	DAIHAN Scientific	CF-5
Multi-Hotplate Stirrers	DAIHAN Scientific	SMHS-6
Nanodrop	Thermo Fisher Scientific	ND-LITE-PR
pH benchtop meter	Thermo Fisher Scientific	STARA2110
Rheometer	TA Instrument	Discovery HR-2
Vortex Mixer	DAIHAN Scientific	VM-10
Cirurgical Instruments
Operating Scissors	Hirose	HC.13-122
Forcep	Korea Ace Scientific	HC.203-30
Materials
1.7 mL microcentrifuge tube	Axygen	MCT-175-C
10 ml glass vial	Scilab	SL.VI1243
40 µm cell strainer	Falcon	352340
5 L beaker	Dong Sung Science	SDS 2400
50 mL cornical tube	Falcon	352070
500 mL beaker	Korea Ace Scientific	KA.23-08
500 mL bottle-top vacuum filter	Corning	431118
500 mL plastic container	LOCK&LOCK	INL301
96well plate	Falcon	353072
Aluminum foil	DAEKYO
Kimwipe	Kimtech
Magnetic bar	Korea Ace Scientific	BA.37110-0003
Mortar and pestle	DAIHAN Scientific	SC.MG100
Multi-channel pipettor	Eppendorf	4982000314
Petri Dish	SPL	10100
pH indicator strips	Sigma-Aldrich	1095350001
Sieve filter mesh	DAIHAN Scientific
Decellularization
10x pbs	Hyclone	SH30258.01
4.7% Peracetic acid	Omegafarm
70% ethanol	SAMCHUN CHEMICALS	E0220 SAM
Distilled water
IPA	SAMCHUN CHEMICALS	samchun I0348
Triton-X 100	Biosesang	T1020
Biochemical assay
1,9-Dimethyl-Methylene Blue zinc chloride double salt	Sigma-Aldrich	341088
10 N NaOH	Biosesang	S2018
Chloramine T	Sigma-Aldrich	857319
Chondroitin sulfate A	Sigma-Aldrich	C4384
Citric acid	Supelco	46933
Cysteine-HCl	Sigma-Aldrich	C1276
Glacial acetic acid	Merok	100063
Glycine	Sigma-Aldrich	410225
HCl	Sigma-Aldrich	H1758
Na2-EDTA	Sigma-Aldrich	E5134
NaCl	SAMCHUN CHEMICALS	S2097
Papain	Sigma-Aldrich	p4762
P-DAB	Sigma-Aldrich	D2004
Perchloric acid	Sigma-Aldrich	311421
Sodium acetate	Sigma-Aldrich	S5636
Sodium hydroxide	Supelco	SX0607N
Sodium phosphate(monobasic)	Sigma-Aldrich	RDD007
Toluene	Sigma-Aldrich	244511
Bioink
Charicterized FBS	Hyclone	SH30084.03
Penicillin-Streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140122
Pepsin	Sigma-Aldrich	P7215
Rose bengal	Sigma-Aldrich	198250
RPMI-1640 medium	Thermo Fisher Scientific	11875093
Trypan Blue solution	Sigma-Aldrich	T8154