Bioinchiostro a matrice extracellulare derivato dal tessuto pancreatico per la stampa di costrutti di tessuto pancreatico 3D Cell-Laden

Riepilogo

La matrice extracellulare decellularizzata (dECM) può fornire adeguati segnali microambientali per ricapitolare le funzioni intrinseche dei tessuti bersaglio in un costrutto ingegnerizzato. Questo articolo chiarisce i protocolli per la decellularizzazione del tessuto pancreatico, la valutazione del bioink dECM derivato dal tessuto pancreatico e la generazione di costrutti di tessuto pancreatico 3D utilizzando una tecnica di biostampa.

Abstract

Il trapianto di isole pancreatiche è un trattamento promettente per i pazienti che soffrono di diabete di tipo 1 accompagnato da ipoglicemia e complicazioni secondarie. Tuttavia, il trapianto di isole presenta ancora diverse limitazioni, come la scarsa vitalità delle isole trapiantate a causa di un cattivo innesto di isole e di ambienti ostili. Inoltre, le cellule che producono insulina differenziata dalle cellule staminali pluripotenti umane hanno capacità limitate di secernere ormoni sufficienti che possono regolare il livello di glucosio nel sangue; pertanto, è fortemente necessario migliorare la maturazione colticce le cellule con adeguati segnali microambientali. In questo articolo, chiariamo i protocolli per la preparazione di un bioink a matrice extracellulare decellularizzata decellularizzata (pdECM) derivato dal tessuto pancreatico per fornire un microambiente benefico che può aumentare la sensibilità al glucosio delle isole pancreatiche, seguito da descrivere i processi per la generazione di costrutti di tessuto pancreatico 3D utilizzando una tecnica di biostampa basata sulla microestrusione.

Introduzione

Recentemente, il trapianto di islet pancreatico è stato considerato un trattamento promettente per i pazienti con diabete di tipo 1. La relativa sicurezza e la minima invasività della procedura sono grandi vantaggi di questo trattamento¹. Tuttavia, ha diverse limitazioni come il basso tasso di successo delle isole isolare e gli effetti collaterali dei farmaci immunosoppressori. Inoltre, il numero di isolotti innevati diminuisce costantemente dopo il trapianto a causa dell'ambiente ostile². Vari materiali biocompatibili come algerino, collagene, poli(acido lattico-co-glicolico) (PLGA) o glicole di polietilene (PEG) sono stati applicati al trapianto di islet pancreatico per superare queste difficoltà.

La tecnologia di stampa cellulare 3D sta emergendo nell'ingegneria tissutale a causa del suo grande potenziale e delle sue alte prestazioni. Inutile dire che i bioinchi sono noti come componenti importanti per fornire un microambiente adatto e consentire il miglioramento dei processi cellulari nei costrutti di tessuto stampato. Un numero considerevole di idrogel che dilaniano la cesoia come fibrina, alginato e collagene sono ampiamente utilizzati come bioinks. Tuttavia, questi materiali mostrano una mancanza di complessità strutturale, chimica, biologica e meccanica rispetto alla matrice extracellulare (ECM) nel tessuto nativo³. I segnali microambientali come le interazioni tra isolotti ed ECM sono segnali importanti per migliorare la funzione delle isolotti. Decellularizzato ECM (dECM) può ricreare la composizione specifica del tessuto di vari componenti ECM tra cui collagene, glicosaminoglicani (GAG) e glicoproteine. Ad esempio, le isole primarie che mantengono le loro ECU periferiche (ad esempio, le interazioni di tipo I, III, IV, V e VI collagene, laminina e fibronectina) presentano una bassa apoptosi e una migliore sensibilità all'insulina, indicando così che le interazioni cellula-matrice specifiche del tessuto sono importanti per migliorare la loro capacità di funzionare in modo simile al tessuto originale⁴.

In questo articolo, chiariamo i protocolli per la preparazione di bioinchiostro a matrice extracellulare decellularizzata decellularizzata (pdECM) di tessuto pancreatico per fornire segnali microambientali benefici per aumentare l'attività e le funzioni delle isole pancreatiche, seguiti dai processi per la generazione di costrutti di tessuto pancreatico 3D utilizzando una tecnica di biostampabasatasu microestrusingne ( Figura 1 ).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocollo

Tessuti pancreatici porcini sono stati raccolti da un macello locale. Gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) dell'Asan Medical Center di Seoul, Corea.

1. Decellularizzazione dei tessuti

1. Preparare le soluzioni per la decellularizzazione.
   NOTA: 1x salina con buffer fosfato (PBS) utilizzata in tutti i preparati della soluzione viene diluita aggiungendo acqua distillata a 10 volte PBS.
   1. Per la soluzione 1% Triton-X 100, sciogliere 100 mL di 100% soluzione Triton-X 100 in 900 mL di 1x PBS utilizzando una barra di stiring magnetico con l'agitazione a 150 rpm per 6 h. Make 400 mL di 1% Soluzione Triton-X 100 con 40 mL di 10% Soluzione Triton-X 100 e 360 mL di 1x1x PBS preparato poco prima dell'uso.
      NOTA: la soluzione 10% Triton-X 100 può essere conservata a temperatura ambiente fino a quando necessario.
   2. Per la soluzione dell'acido peracetico dello 0,1%, diluire 8,5 mL di 4,7% di acido peraceto in 22,8 mL di 70% di etanolo con 368,7 mL di acqua distillata poco prima dell'uso.
2. Rimuovere i tessuti periferici del pancreas e affettare il tessuto prima della decellularizzazione.
   1. Lavare il pancreas di porcina resezionato con acqua corrente del rubinetto e rimuovere i tessuti periferici utilizzando forbici sterilizzate.
   2. Trasferire il pancreas in un sacchetto di plastica con la forza e congelare a -80 gradi centigradi per 1 h per aiutare a tagliare il pancreas in modo efficace per il passo successivo.
   3. Affettare il pancreas congelato in pezzi spessi 1 mm con una grattugia.
   4. Trasferire 50 g di tessuto a fette in un contenitore di plastica da 500 ml.
      NOTA: Un contenitore di plastica con coperchio è consigliato qui per proteggere i tessuti dalla contaminazione e prevenire l'evaporazione della soluzione.
3. Trattamento con reagenti.
   NOTA: L'intero processo di decellularizzazione deve essere effettuato a 4 gradi centigradi su uno shaker orbitale digitale a 150 giri/min. In tutte le fasi di decellularizzazione, il distacco fisico con la pinze è necessario per evitare che le fette di pancreas si attacchino insieme. Per rimuovere completamente i reagenti residui nel contenitore è necessario lavare il contenitore con acqua distillata.
   1. Prima di qualsiasi trattamento reagente, lavare 50 g di pancreas a fette con 300 mL di acqua distillata utilizzando uno shaker.
   2. Mescolare il tessuto continuamente a 150 giri/min fino a quando l'acqua torbida scompare (dopo circa 12 h). Sostituire l'acqua distillata ogni 2 h.
      NOTA: Si consiglia di cambiare l'acqua distillata ogni ora per l'efficienza per rimuovere più rapidamente l'acqua torbida.
   3. Scartare l'acqua e trattare i 50 g di tessuti con 400 mL di 1% Triton-X 100 in 1x soluzione PBS per 84 h. Aggiornare la soluzione ogni 12 h.
      NOTA: A questo punto, la quantità di tessuto diminuirà perché i componenti cellulari iniziano a essere rimossi.
   4. Trattare con 400 mL di isopropanolo (IPA) per 2 h per rimuovere il grasso rimanente dal pancreas.
      NOTA: È normale che il tessuto diventi duro a causa della rimozione del grasso in questo processo.
   5. Dopo 2 h, rimuovere l'IPA e lavare il tessuto con 400 mL di 1x PBS per 24 h. Aggiornare il 1x PBS ogni 12 h.
   6. Per sterilizzare il tessuto decellularizzato, scartare la soluzione precedente e trattare con 400 mL di 0,1% acido peracetico nel 4% di etanolo per 2 h.
   7. Per rimuovere il detergente residuo, lavare il tessuto con 400 mL di 1x PBS per 6 h. Aggiornare la soluzione ogni 2 h.
   8. Raccogliere i tessuti decellularizzati in un tubo conico da 50 mL con pinze.
   9. Congelare il campione a -80 gradi centigradi per 1 h. Coprire il tubo conico con una salvietta senza lanucca al posto del coperchio e fissare con un elastico per un'efficiente liofilizzazione.
   10. Liofilarizzare il tessuto decellularizzato a -50 gradi centigradi per 4 d.
       NOTA: Per il passaggio 1.3, 1 g di tessuto non decellularizzato deve anche essere liofilizzato alle stesse condizioni.

2. Valutazione dei tessuti decellularizzati

NOTA: Per valutare la quantità residua di dsDNA, glicosaminoglicani (GAG) e collagene nel tessuto decellularizzato rispetto al tessuto nativo, sono necessari almeno 1 g di ciascuno dei tessuti non decellularizzati (tessuto nativo) e del tessuto decellularizzato gruppo di valutazione. La quantità di dsDNA, GAG e collagene può essere calcolata in base al peso secco del tessuto.

1. Preparare soluzioni per saggi biochimici.
   1. Preparare la soluzione papaina per la digestione del campione.
      NOTA: la quantità di buffer da effettuare può essere regolata in base al numero di campioni.
      1. Sciogliere 119 mg di fosfato di sodio 0,1 M (monobasico), 18,6 mg di 0,5 mM Na2-EDTA e 8,8 mg di 5 mM di cisteina-HCl in 10 mL di acqua autoclaved.
      2. Regolare il pH della soluzione a 6,5 aggiungendo una soluzione NaOH da 10 M.
      3. Aggiungere 125 luna di 10 mg/mL soluzione di brodo papaina alla soluzione di cui sopra e vortice, permettendo ad ogni elemento di mescolare in modo uniforme.
   2. Preparare le soluzioni per il saggio di methyl-metilene blu (DMMB).
      1. Per fare la tintura DMMB, sciogliere 8 mg di 1,9-dimetil-metilene-cloruro di zinco blu, 1,52 g di glicina, e 1.185 g di NaCl in 500 mL di acqua autoclata. Regolare il pH a 3 aggiungendo una soluzione HCl da 0,5 M mentre si misura il cambio di pH utilizzando un misuratore di pH bench-top. Quindi, filtrare questo attraverso un filtro a vuoto da 500 mL.
      2. Rendere 15 ll di 10 mg/mL di solfato di condroitina Una soluzione per lo standard.
   3. Preparare le soluzioni per il saggio di idrossiprolina.
      1. Per la soluzione di lavoro della cloramina, sciogliere 2,4 g di acetato di sodio, 1 g di acido citrico e 0,68 g di idrossido di sodio in 24 mL di acqua distillata e aggiungere 240L di acido glaciale acetico, 10 ll di toluene e 6 mL di IPA.
         NOTA: Sciogliere tutte le polveri in soluzione utilizzando un miscelatore vortice. La soluzione di lavoro Chloramine può essere immagazzinata a 4 gradi centigradi per un massimo di tre mesi.
      2. Per la soluzione chloramina T, sciogliere 0,35 g di cloramina T in 20 mL di soluzione di lavoro cloramina e aggiungere 2,5 mL di IPA. Vortice per mescolare tutti i componenti.
         NOTA: Preparare immediatamente prima dell'uso.
      3. Per la soluzione P-DAB, inserire 3,75 g di P-DAB in 6,5 mL di acido perclorico e 15 mL di IPA; avvolgerlo in un foglio di alluminio.
         NOTA: Preparare immediatamente prima dell'uso.
2. Aggiungere 1 mL di soluzione papaina a 10 mg di tessuto liofilizzato in un tubo di microcentrifuga di 1,5 mL e vortice il tubo per digerire meglio il campione.
3. Mettere il tubo di microcentrifuga da 1,5 ml in un rack di gomma e digerire i campioni in un becher da 500 mL che contiene 300 mL di acqua a 60 gradi centigradi per 16 h.
4. Centrifuga a 9.500 x g per 20 min, raccogliere il supernatante, e trasferirlo in un nuovo tubo.
5. Quantificare il DNA residuo e le principali proteine nel tessuto decellularizzato.
   1. Caricare 1 l di campione digerito nello spettrometro e misurare la quantità di dsDNA secondo le istruzioni del produttore.
      NOTA: Lo sperimentatore deve legare i capelli indietro e indossare una maschera per evitare di contaminare il campione.
6. Eseguire un saggio DMMB per quantificare la quantità di GAG che rimane nel tessuto decellularizzato.
   1. Mescolare 1 ll di solfato di condroitina Una soluzione e 499 -L di 1x PBS per fare gli standard. Diluire il solfato di condroitina Una soluzione con acqua distillata a concentrazioni di 0, 4, 8, 12, 16 e 20 g/mL.
   2. Caricare i triplicati di 50 gradi di ogni concentrazione dei campioni standard e digeriti in una piastra di 96 pozze.
   3. Aggiungere 200 l del coloranti DMMB ad ogni pozzo utilizzando una pipetta multicanale.
   4. Leggere immediatamente l'assorbimento a 525 nm su un lettore di microplacino.
7. Eseguire un saggio di idrossiprolina per quantificare la quantità di collagene.
   1. Per condurre un'acido idrossiprolina, incubare 250 l di campione digerito con volumi uguali di HCl a 120 gradi centigradi per 16 h.
   2. Asciugare i residui a temperatura ambiente per 3 h per raffreddare i campioni e quindi ri-dissolviare i campioni in 1 mL di 1x PBS.
   3. Centrifuga a 2.400 x g per 10 min a 4 gradi centigradi.
   4. Preparare la soluzione di idrossido di 100 g/mL di serie.
   5. Diluire la soluzione idrossiprolina con acqua distillata ad una concentrazione di 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 15, 20, 30 g/mL per una soluzione standard.
   6. Caricare in una piastra di 96 pozzetto triplicati di 50 litri di campioni e soluzione standard.
   7. Aggiungere 50 -L di chloramina T soluzione quindi incubare per 20 min a temperatura ambiente.
   8. Aggiungere 50 -L di soluzione p-DAB e incubare per 30 min a 60 gradi centigradi.
      NOTA: Aliquota in una stanza buia. Dopo l'aggiunta, avvolgere la piastra con un foglio di alluminio.
   9. Incubare a temperatura ambiente per 30 min.
   10. Dopo il raffreddamento, misurare l'assorbimento a 540 nm su un lettore di microplacio.

3. Preparazione Bioink

NOTA: la polvere pdECM può essere conservata stabilmente a -80 gradi centigradi per almeno un anno. Prima della regolazione del pH, la soluzione pdECM digerita può essere conservata a -20 gradi centigradi per un mese. Prima dell'uso, scongelare il campione di soluzione pdECM congelata a 4 gradi centigradi durante la notte. La soluzione pdECM regolata in pH può essere conservata a 4 gradi centigradi per un massimo di una settimana. La soluzione pdECM digerita può essere conservata a 4 gradi centigradi per almeno un paio di giorni, ma non deve superare 1 settimana.

1. Digerire il pdECM liofilizzato con pepsina.
   1. Per una digestione efficace del bioink, polverizza il pdECM lofilofilfato con azoto liquido utilizzando un mortaio e un pestello.
   2. Raccogliere 200 mg della polvere pdECM nel tubo conico 50 mL e aggiungere 20 mg di pepsina e 8,4 mL dell'acido acetico 0,5 M (la concentrazione finale è 2 w/v%).
   3. Posizionare la barra magnetica di agitazione nel tubo conico 50 mL e mescolare a 300 giri/m per 96 h.
2. Regolare il pH della soluzione pdECM digerita.
   NOTA: Al fine di evitare la gelazione prima della regolazione del pH, questo processo deve essere condotto sul ghiaccio.
   1. Filtrare le particelle non digerite nella soluzione pdECM utilizzando un colino cellulare di 40 m utilizzando una pipetta di spostamento positivo sul ghiaccio per ottenere la digestione ottimale delle parti.
   2. Aggiungere 1 mL di 10x PBS e vortice prima di utilizzare NaOH.
   3. Regolare il pH a 7 con 10 M NaOH controllando il pH con strisce indicatore pH.
      NOTA: Vortice ogni volta che NaOH viene aggiunto in modo che il bioinchiostro sia accuratamente mescolato con gli altri reagenti.

4. Analisi reologica

1. Configurazione sperimentale
   1. Preparare il bioinchiostro 1.5% (w/v) del pdECM per valutare le proprietà reologiche.
   2. Stabilire una geometria della piastra del cono da 20 mm (diametro del cono di 20 mm con un angolo di 2 gradi) in modalità di controllo della velocità di un reometro.
   3. Creare sequenze sperimentali nel software installato (TRIOS) per misurare la viscosità, la cinetica della gelazione e il modulo dinamico del bioink pdECM.
      1. Viscosità: Posizionare il bioinchiostro pdECM sulla piastra. Misurare la viscosità complessa (Paàs) del bioink pdECM con un tasso di taglio crescente da 1 a 1.000 s^-1 ad una temperatura costante di 15 gradi centigradi.
      2. Cinetica di gelazione: Posizionare il bioinchiostro pdECM sulla piastra. Calcolare il complesso modulo (G) misurando il modulo di archiviazione e perdita di pdECM bioink a 4-37 s c con un tasso di aumento incrementale di 5 C/min (modalità di spazzamento temporale).
      3. Modulo dinamico: Posizionare il bioinchiostro pdECM sulla piastra a 37 gradi centigradi per 60 minuti prima della misurazione. Misurare il modulo di archiviazione dipendente dalla frequenza (G') e il modulo di perdita (G'') del bioink pdECM nell'intervallo di 0,1-100 rad/s con una deformazione del 2%.

5. Stampa di cellule 3D di costrutti di tessuto pancreatico con isolotto

1. Preparazione di isolotti isolati
   1. Isolare le isole primarie da un ratto secondo i protocolli descritti in un lavoro precedente⁵.
   2. Per separare i detriti e le cellule morte dall'isolotto isolato isolato, passare la sospensione cellulare attraverso un colino cellulare di 70 m. Le isole con un diametro inferiore a 70 m sono considerate morte o anormali.
   3. Sospendere le isole isolate nel mezzo RPMI-1640 e posizionarle sulla piastra di Petri. Rimuovere le isole di diametro superiore a 300 m utilizzando una pipetta di volume P200 al microscopio (4x obiettivo obiettivo) nell'armadio di biosicurezza.
2. Incapsulamento delle islet nel bioink pdECM
   1. Preparare il bioinchiostro pdECM regolato in pH e l'isolotto isolato.
      NOTA: Per evitare la gelazione prima della regolazione del pH, questo processo deve essere eseguito sul ghiaccio.
   2. Mescolare delicatamente il bioinchiostro pdECM e il supporto sospesi con isolotti (rapporto 3:1) utilizzando una pipetta di spostamento positivo fino a quando non viene mescolato uniformemente.
      NOTA: la concentrazione finale del bioinchiostro pdECM è dell'1,5% e la densità cellulare nel bioinchiostro pdECM è 3.000 IEQ/mL.
3. Stampa cellulare 3D di costrutti di tessuto pancreatico
   1. Preparare una siringa sterilizzata e un ugello da 22 G.
      NOTA: Questo misuratore è stato selezionato per la stampa di isolotti con un diametro di 100-250 m.
   2. Caricare il bioinchiostro pdECM carico di iletto nella siringa.
   3. Stampare il bioinchiostro con la condizione di stampa ottimizzata (velocità di alimentazione: 150 mm/min; pressione pneumatica: 15 kPa) a 18 gradi centigradi a forma di reticolo.
   4. Per collegare in modo incrociato il bioinchiostro, posizionare il costrutto stampato nell'incubatrice per 30 min.
   5. Immergere il costrutto stampato nel supporto di coltura dell'isolotto che è RPMI-1640 medio integrato con 10% siero bovino fetale (FBS), 100 U/mL penicillina e 100 U/mL streptomicina.

6. Stampa di celle 3D del costrutto pancreatico con struttura modellata

1. Preparazione di due tipi di bioink
   1. Per convalidare la versatilità di stampa utilizzando più bioinks, preparare due serie di bioink pdECM e macchiarli aggiungendo 0,4% Trypan Blue e Rose Bengal soluzione in ogni bioink pdECM con un rapporto di 1:20, rispettivamente.
      NOTA: Per evitare la gelazione prima della regolazione del pH, questo processo deve essere condotto sul ghiaccio.
   2. Mescolare delicatamente il bioinchiostro pdECM e il supporto sospesi con isolotti (rapporto 3:1) utilizzando una pipetta di spostamento positivo fino a quando non viene mescolato uniformemente.
      NOTA: la concentrazione finale del bioinchiostro pdECM è dell'1,5% e la densità cellulare nel bioinchiostro pdECM è 3.000 IEQ/mL.
2. Stampa di cellule 3D di costrutti di tessuto pancreatico multimateriale
   1. Preparare siringhe sterilizzate e un ugello da 25 G.
   2. Caricare ogni bioinchiostro (blu e rosso) in due siringhe diverse, rispettivamente.
   3. Stampare il bioinchiostro con una condizione di stampa ottimizzata (velocità di avanzamento: 150 mm/min; pressione pneumatica: 15 kPa) a 18 gradi centigradi a forma di reticolo con linee alternate di blu e rosso.
   4. Per collegare in modo incrociato il bioinchiostro, posizionare il costrutto stampato nell'incubatrice per 30 min.
   5. Immergere il costrutto stampato in supporti di coltura dell'isolotto che è RPMI-1640 medio integrato con 10% siero bovino fetale (FBS), 100 U/mL penicillina e 100 U/mL streptomicina.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Risultati

Decellularizzazione dei tessuti pancreatici
Abbiamo sviluppato il processo di preparazione del bioink pdECM per fornire microambienti specifici del tessuto pancreatico per migliorare la funzionalità delle isolotti in un costrutto di tessuto biostampato 3D (Figura 2A). Dopo il processo di decellularizzazione, il 97,3% del dsDNA è stato rimosso e componenti ECM rappresentativi come collagene e GAG sono rimasti rispettivame...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussione

Questo protocollo ha descritto lo sviluppo di bioinks pdECM e la fabbricazione di costrutti di tessuto pancreatico 3D utilizzando tecniche di stampa cellulare 3D. Per ricapitolare il microambiente del tessuto bersaglio nel costrutto di tessuto ingegnerizzato 3D, la scelta del bioink è fondamentale. In uno studio precedente, abbiamo convalidato che i bioink dECM specifici dei tessuti sono utili per promuovere la differenziazione delle cellule staminali e la proliferazione¹⁰. Rispetto ai polimeri s...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Biological Safety Cabinets	CRYSTE	PURICUBE 1200
Deep Freezer	Thermo Scientific Forma	957
Digital orbital shaker	DAIHAN Scientific	DH.WSO04010
Dry oven	DAIHAN Scientific	WON-155
Freeze dryer	LABCONCO	7670540
Fridge	SANSUNG	CRFD-1141
Grater	ABM	1415605793
Inverted Microscopes	Leica	DMi1
Microcentrifuge	CRYSTE	PURISPIN 17R
Microplate reader	Thermo Fisher Scientific	Multiskan GO
Mini centrifuge	DAIHAN Scientific	CF-5
Multi-Hotplate Stirrers	DAIHAN Scientific	SMHS-6
Nanodrop	Thermo Fisher Scientific	ND-LITE-PR
pH benchtop meter	Thermo Fisher Scientific	STARA2110
Rheometer	TA Instrument	Discovery HR-2
Vortex Mixer	DAIHAN Scientific	VM-10
Cirurgical Instruments
Operating Scissors	Hirose	HC.13-122
Forcep	Korea Ace Scientific	HC.203-30
Materials
1.7 mL microcentrifuge tube	Axygen	MCT-175-C
10 ml glass vial	Scilab	SL.VI1243
40 µm cell strainer	Falcon	352340
5 L beaker	Dong Sung Science	SDS 2400
50 mL cornical tube	Falcon	352070
500 mL beaker	Korea Ace Scientific	KA.23-08
500 mL bottle-top vacuum filter	Corning	431118
500 mL plastic container	LOCK&LOCK	INL301
96well plate	Falcon	353072
Aluminum foil	DAEKYO
Kimwipe	Kimtech
Magnetic bar	Korea Ace Scientific	BA.37110-0003
Mortar and pestle	DAIHAN Scientific	SC.MG100
Multi-channel pipettor	Eppendorf	4982000314
Petri Dish	SPL	10100
pH indicator strips	Sigma-Aldrich	1095350001
Sieve filter mesh	DAIHAN Scientific
Decellularization
10x pbs	Hyclone	SH30258.01
4.7% Peracetic acid	Omegafarm
70% ethanol	SAMCHUN CHEMICALS	E0220 SAM
Distilled water
IPA	SAMCHUN CHEMICALS	samchun I0348
Triton-X 100	Biosesang	T1020
Biochemical assay
1,9-Dimethyl-Methylene Blue zinc chloride double salt	Sigma-Aldrich	341088
10 N NaOH	Biosesang	S2018
Chloramine T	Sigma-Aldrich	857319
Chondroitin sulfate A	Sigma-Aldrich	C4384
Citric acid	Supelco	46933
Cysteine-HCl	Sigma-Aldrich	C1276
Glacial acetic acid	Merok	100063
Glycine	Sigma-Aldrich	410225
HCl	Sigma-Aldrich	H1758
Na2-EDTA	Sigma-Aldrich	E5134
NaCl	SAMCHUN CHEMICALS	S2097
Papain	Sigma-Aldrich	p4762
P-DAB	Sigma-Aldrich	D2004
Perchloric acid	Sigma-Aldrich	311421
Sodium acetate	Sigma-Aldrich	S5636
Sodium hydroxide	Supelco	SX0607N
Sodium phosphate(monobasic)	Sigma-Aldrich	RDD007
Toluene	Sigma-Aldrich	244511
Bioink
Charicterized FBS	Hyclone	SH30084.03
Penicillin-Streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140122
Pepsin	Sigma-Aldrich	P7215
Rose bengal	Sigma-Aldrich	198250
RPMI-1640 medium	Thermo Fisher Scientific	11875093
Trypan Blue solution	Sigma-Aldrich	T8154