Bioink extracellulaire de matrice de tissu pancréatique-dérivé pour l'impression 3D Cell-Laden Pancréatique Tissue Constructs

Résumé

La matrice extracellulaire décellularisée (DECM) peut fournir des indices microenvironnementaux appropriés pour récapituler les fonctions inhérentes des tissus cibles dans une construction machinée. Cet article élucide les protocoles pour la décellularisation du tissu pancréatique, l'évaluation du bioink dECM pancréatique de tissu-dérivé, et la génération des constructions pancréatiques 3D de tissu utilisant une technique de bioimpression.

Résumé

La transplantation d'îlots pancréatiques est un traitement prometteur pour les patients qui souffrent de diabète de type 1 accompagnés d'hypoglycémie et de complications secondaires. Cependant, la transplantation d'îlots a encore plusieurs limitations telles que la faible viabilité des îlots transplantés en raison de l'engraftment pauvre d'îlot et des environnements hostiles. En outre, les cellules productrices d'insuline différenciées des cellules souches pluripotentes humaines ont une capacité limitée de sécrétiser suffisamment d'hormones qui peuvent réguler le niveau de glucose sanguin; par conséquent, l'amélioration de la maturation en cculturant des cellules avec des indices microenvironnementaux appropriés est fortement nécessaire. Dans cet article, nous élucidons des protocoles pour préparer un bioink de matrice extracellulaire décellularized de tissu pancréatique (pdECM) pour fournir un microenvironnement salutaire qui peut augmenter la sensibilité de glucose des îlots pancréatiques, suivi en décrivant les processus pour produire le tissu pancréatique 3D construit utilisant une technique de bioimpression basée sur la microextrusion.

Introduction

Récemment, la transplantation pancréatique d'îlot a été considérée un traitement prometteur pour des patients présentant le diabète de type 1. La sécurité relative et l'invasivité minimale de la procédure sont de grands avantages de ce traitement¹. Cependant, il a plusieurs limitations telles que le faible taux de réussite des îlots isolants et les effets secondaires des médicaments immunosuppresseurs. En outre, le nombre d'îlots greffés diminue régulièrement après la transplantation en raison de l'environnement hostile². Divers matériaux biocompatibles tels que l'alginate, le collagène, le poly (acide co-glycolique lactique) (PLGA) ou le polyéthylène glycol (PEG) ont été appliqués à la transplantation pancréatique d'îlot pour surmonter ces difficultés.

La technologie d'impression de cellules 3D est en train d'émerger dans l'ingénierie tissulaire en raison de son grand potentiel et de ses performances élevées. Inutile de dire que les bioinks sont connus comme des composants importants pour fournir un microenvironnement approprié et permettre l'amélioration des processus cellulaires dans les constructions de tissus imprimés. Un nombre substantiel d'hydrogels de cisaillement tels que la fibrine, l'alginate, et le collagène sont employés couramment comme bioinks. Cependant, ces matériaux montrent un manque de complexité structurale, chimique, biologique et mécanique par rapport à la matrice extracellulaire (ECM) dans le tissu indigène³. Les indices microenvironnementaux tels que les interactions entre les îlots et l'ECM sont des signaux importants pour améliorer la fonction des îlots. L'ECM décellularisé (DECM) peut recréer la composition tissulaire spécifique de divers composants d'ECM comprenant le collagène, les glycosaminoglycans (GAGs), et les glycoprotéines. Par exemple, les îlots primaires qui conservent leurs ECM périphériques (p. ex., type I, III, collagène IV, V et VI, lamininin et fibronectin) présentent une faible apoptose et une meilleure sensibilité à l'insuline, ce qui indique que les interactions cellulaires-matricespécifiques spécifiques aux tissus sont importantes pour améliorer leur capacité à fonctionner de la même façon que le tissu original⁴.

Dans cet article, nous élucidons des protocoles pour la préparation du bioink de matrice extracellulaire décellularisé dérivé du tissu pancréatique (pdECM) pour fournir des indices microenvironnementaux bénéfiques pour stimuler l'activité et les fonctions des îlots pancréatiques, suivis par les processus pour générer des constructions de tissu pancréatique 3D utilisant une technique de bioimpression à base de microextrusion (Figure 1).

Protocole

Des tissus pancréatiques porcins ont été recueillis dans un abattoir local. Les expériences sur les animaux ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux (IACUC) du Centre médical Asan, Séoul, Corée.

1. Décellularisation des tissus

1. Préparer les solutions pour la décellularisation.
   REMARQUE : La saline 1x tamponnée de phosphate (PBS) utilisée dans toutes les préparations de solution est diluée en ajoutant de l'eau distillée à 10 x PBS.
   1. Pour la solution 1% Triton-X 100, dissoudre 100 mL de solution 100% Triton-X 100 en 900 mL de 1x PBS à l'aide d'une barre magnétique avec l'agitation à 150 tr/min pour 6 h. Faire 400 mL de 1% Triton-X 100 solution avec 40 mL de 10% Triton-X 100 solution et 360 mL de 1x 1x PBS préparé juste avant l'utilisation.
      REMARQUE : La solution Triton-X 100 à 10 % peut être conservée à température ambiante jusqu'à ce que nécessaire.
   2. Pour la solution d'acide peracétique de 0,1 %, diluer 8,5 ml d'acide peracétique de 4,7 % en 22,8 ml d'éthanol à 70 % avec 368,7 ml d'eau distillée juste avant utilisation.
2. Enlever les tissus périphériques du pancréas et trancher le tissu avant la décellularisation.
   1. Laver le pancréas porcin réséqué avec de l'eau courante du robinet et enlever les tissus périphériques à l'aide de ciseaux stérilisés.
   2. Transférer le pancréas dans un sac en plastique avec des forceps et congeler à -80 oC pendant 1 h pour aider à couper le pancréas efficacement pour l'étape suivante.
   3. Trancher le pancréas congelé en morceaux de 1 mm d'épaisseur à l'aide d'une râpe.
   4. Transférer 50 g de tissu tranché dans un contenant en plastique de 500 ml.
      REMARQUE : Un récipient en plastique avec un couvercle est recommandé ici pour protéger des tissus de la contamination et empêcher l'évaporation de solution.
3. Traitement avec réactifs.
   REMARQUE : L'ensemble du processus de décellularisation doit être effectué à 4 oC sur un shaker orbital numérique à 150 tr/min. Dans toutes les étapes de décellularisation, le détachement physique utilisant des forceps est nécessaire pour empêcher les tranches du pancréas de coller ensemble. Le lavage du récipient avec de l'eau distillée est nécessaire pour enlever complètement les réactifs résiduels dans le récipient.
   1. Avant tout traitement de réactif, laver 50 g de pancréas tranché avec 300 ml d'eau distillée à l'aide d'un shaker.
   2. Remuer le tissu en continu à 150 tr/min jusqu'à ce que l'eau trouble disparaisse (après environ 12 h). Remplacer l'eau distillée toutes les 2 h.
      REMARQUE : Il est recommandé de changer l'eau distillée toutes les heures pour qu'il soit efficace d'éliminer l'eau trouble plus rapidement.
   3. Jeter l'eau et traiter les 50 g de tissus avec 400 ml de 1% Triton-X 100 en 1x PBS solution pour 84 h. Rafraîchir la solution tous les 12 h.
      REMARQUE : À ce stade, la quantité de tissu diminuera parce que les composants cellulaires commencent à être enlevés.
   4. Traiter avec 400 ml d'isopropanol (IPA) pendant 2 h pour enlever le reste de la graisse du pancréas.
      REMARQUE: Il est normal que le tissu devienne difficile en raison de l'élimination de la graisse dans ce processus.
   5. Après 2 h, retirer l'IPA et laver le tissu avec 400 ml de 1x PBS pendant 24 h. Rafraîchir le 1x PBS tous les 12 h.
   6. Pour stériliser le tissu décellularisé, jetez la solution précédente et traitez avec 400 ml d'acide peracétique de 0,1 % dans 4 % d'éthanol pendant 2 h.
   7. Pour enlever le détergent résiduel, laver le tissu avec 400 ml de 1x PBS pendant 6 h. Rafraîchir la solution tous les 2 h.
   8. Recueillir les tissus décellularisés dans un tube conique de 50 ml avec des forceps.
   9. Congeler l'échantillon à -80 oC pendant 1 h. Couvrir le tube conique d'une lingette sans peluches au lieu du couvercle et fixer avec un élastique pour une lyophilisation efficace.
   10. Lyophiliser le tissu décellularisé à -50 oC pour 4 d.
       REMARQUE : Pour l'étape 1,3, 1 g de tissu non décellularisé doit également être lyophilisé dans les mêmes conditions.

2. Évaluation des tissus décellulaires

REMARQUE : Pour évaluer la quantité résiduelle de dsDNA, de glycosaminoglycane (GAGs), et de collagène dans le tissu décellularisé comparé au tissu indigène, au moins 1 g de chacun de chacun du tissu non-décellularisé (tissu indigène) et du tissu décellularisé sont exigés pour un série d'évaluations. La quantité de dsDNA, de GAGs, et de collagène peut être calculée basée sur le poids sec du tissu.

1. Préparer des solutions pour les essais biochimiques.
   1. Préparer la solution de papain pour la digestion d'échantillon.
      REMARQUE : La quantité de mémoire tampon à faire peut être ajustée en fonction du nombre d'échantillons.
      1. Dissoudre 119 mg de 0,1 M de phosphate de sodium (monobasic), 18,6 mg de 0,5 mM Na2-EDTA, et 8,8 mg de cystéine-HCl de 5 mM dans 10 ml d'eau autoclaved.
      2. Ajuster le pH de la solution à 6,5 en ajoutant 10 M NaOH solution.
      3. Ajouter 125 'L de 10 mg/mL de solution de stock de papain à la solution ci-dessus et le vortex, permettant à chaque élément de se mélanger uniformément.
   2. Préparer des solutions pour l'état d'œil bleu diméthylène (DMMB).
      1. Pour faire le colorant DMMB, dissoudre 8 mg de 1,9-diméthyl-méthylène bleu chlorure de zinc double sel, 1,52 g de glycine, et 1,185 g de NaCl dans 500 ml d'eau autoclaved. Ajustez le pH à 3 en ajoutant une solution HCl de 0,5 M tout en mesurant le changement de pH à l'aide d'un pH mètre de banc. Ensuite, filtrez-le à l'eau à l'eau à l'eau de 500 ml.
      2. Faire 15 'L de 10 mg/mL de sulfate de chondroïtine Une solution pour la norme.
   3. Préparer des solutions pour l'hydroxyproline.
      1. Pour la solution de travail de chloramine, dissoudre 2,4 g d'acétate de sodium, 1 g d'acide citrique et 0,68 g d'hydroxyde de sodium dans 24 ml d'eau distillée et ajouter 240 l d'acide acétique glaciaire, 10 l de toluène et 6 ml d'IPA.
         REMARQUE : Dissoudre toutes les poudres en solution à l'aide d'un mélangeur à vortex. La solution de travail à la chloramine peut être stockée à 4 oC pendant une période pouvant aller jusqu'à trois mois.
      2. Pour la solution de chloramine T, dissoudre 0,35 g de chloramine T dans 20 ml de chloramine solution de travail et ajouter 2,5 mL d'IPA. Vortex pour mélanger tous les composants.
         REMARQUE : Préparer immédiatement avant l'utilisation.
      3. Pour la solution P-DAB, mettre 3,75 g de P-DAB dans 6,5 ml d'acide perchlorique et 15 ml d'IPA; enveloppez-le dans du papier d'aluminium.
         REMARQUE : Préparer immédiatement avant l'utilisation.
2. Ajouter 1 mL de solution de papaïne à 10 mg de tissu lyophilisé dans un tube microcentrifuge de 1,5 ml et vortex le tube pour mieux digérer l'échantillon.
3. Placer le tube microcentrifuge de 1,5 ml dans un support en caoutchouc et digérer les échantillons dans un bécher de 500 ml qui contient 300 ml d'eau à 60 oC pendant 16 h.
4. Centrifugeuse à 9 500 x g pendant 20 min, collecte zetle le supernatant et transférez-le dans un nouveau tube.
5. Quantifier l'ADN résiduel et les protéines majeures dans le tissu décellularisé.
   1. Chargez 1 l d'échantillon digéré dans le spectromètre et mesurez la quantité de dsDNA selon les instructions du fabricant.
      REMARQUE : L'expérimentateur doit attacher ses cheveux en arrière et porter un masque pour éviter de contaminer l'échantillon.
6. Effectuez un analyse DMMB pour quantifier la quantité de GAGs qui reste dans le tissu décellularisé.
   1. Mélanger 1 l de sulfate de chondroïtine Une solution et 499 oL de 1x PBS pour établir des normes. Diluer le sulfate de chondroïtine Une solution avec de l'eau distillée à des concentrations de 0, 4, 8, 12, 16 et 20 g/mL.
   2. Chargez les tripliques de 50 oL de chaque concentration des échantillons standard et digérés dans une plaque de 96 puits.
   3. Ajouter 200 l de colorant DMMB à chaque puits à l'aide d'une pipette multicanal.
   4. Immédiatement lire l'absorption à 525 nm sur un lecteur de microplaque.
7. Effectuez un étopto -sàxyproline pour quantifier la quantité de collagène.
   1. Pour effectuer un étosay hydroxyproline, incubez 250 l d'échantillon digéré avec des volumes égaux de HCl à 120 oC pendant 16 h.
   2. Sécher les résidus à température ambiante pendant 3 h pour refroidir les échantillons, puis les dissoudre à nouveau dans 1 ml de 1 x PBS.
   3. Centrifugeuse à 2 400 x g pendant 10 min à 4 oC.
   4. Préparer une solution hydroxyproline de 100 g/mL en standard.
   5. Solution hydroxyproline diluée avec de l'eau distillée à une concentration de 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 15, 20, 30 g/mL pour une solution standard.
   6. Chargez les tripliques de 50 l d'échantillons et la solution standard dans une assiette de 96 puits.
   7. Ajouter 50 l de chloramine T, puis couver pendant 20 min à température ambiante.
   8. Ajouter 50 oL de solution p-DAB et incuber pendant 30 min à 60 oC.
      REMARQUE: Aliquot dans une pièce sombre. Après l'ajout, envelopper la plaque de papier d'aluminium.
   9. Incuber à température ambiante pendant 30 min.
   10. Après refroidissement, mesurer l'absorption à 540 nm sur un lecteur de microplaques.

3. Préparation Bioink

REMARQUE : la poudre de pdECM peut être stockée de façon stable à -80 oC pendant au moins un an. Avant l'ajustement du pH, la solution pdECM digérée peut être stockée à -20 oC pendant un mois. Avant d'utiliser, décongeler l'échantillon de la solution pdECM congelée à 4 oC pendant la nuit. La solution pdECM ajustée en pH peut être stockée à 4 oC pendant une semaine. La solution pdECM digérée peut être stockée à 4 oC pendant au moins quelques jours, mais ne doit pas dépasser 1 semaine.

1. Digler le pdECM lyophilisé avec de la pepsine.
   1. Pour une digestion efficace du bioink, pulvériser le pdECM lyophilisé avec de l'azote liquide à l'aide d'un mortier et d'un pilon.
   2. Recueillir 200 mg de la poudre de pdECM dans le tube conique de 50 ml et ajouter 20 mg de pepsine et 8,4 ml de l'acide acétique de 0,5 M (la concentration finale est de 2 w/v%).
   3. Placer la barre magnétique dans le tube conique de 50 ml et remuer à 300 tr/min pendant 96 h.
2. Ajuster le pH de la solution pdECM digérée.
   REMARQUE : Afin d'éviter la gélation avant l'ajustement du pH, ce processus doit être effectué sur la glace.
   1. Filtrer les particules non digérées dans la solution pdECM à l'aide d'une passoire à cellules de 40 m à l'aide d'une pipette de déplacement positive sur la glace pour obtenir la digestion optimale des pièces.
   2. Ajouter 1 ml du 10x PBS et le vortex avant d'utiliser NaOH.
   3. Ajuster le pH à 7 avec 10 M NaOH vérifier le pH avec des bandes d'indicateur de pH.
      REMARQUE : Vortex chaque fois que NaOH est ajouté de sorte que le bioink soit complètement mélangé avec les autres réactifs.

4. Analyse rhéologique

1. Configuration expérimentale
   1. Préparer le 1,5 % (w/v) de bioink pdECM pour évaluer les propriétés rhéologiques.
   2. Établir une géométrie de plaque de cône de 20 mm (diamètre de cône de 20 mm avec un angle de 2 degrés) en mode de rhéomètre contrôlé par la vitesse.
   3. Créez des séquences expérimentales dans le logiciel installé (TRIOS) pour mesurer la viscosité, la généticique de la gélation et le modulus dynamique du bioink pdECM.
      1. Viscosité : Placez le bioink pdECM sur l'assiette. Mesurer la viscosité complexe (Pa-s) du bioink pdECM sous un taux de cisaillement croissant de 1 à 1 000 s^-1 à une température constante de 15 oC.
      2. Généticisation de gel : Placer le bioink pdECM sur l'assiette. Calculez le modulus complexe (G) en mesurant le modulus de stockage et de perte du bioink pdECM à 4-37 oC avec un taux d'augmentation incrémentielle de 5 oC/min (mode de balayage temporel).
      3. Modulus dynamique : Placer le bioink pdECM sur la plaque à 37 oC pendant 60 min avant la mesure. Mesurer le modulus de stockage dépendant de la fréquence (G') et le modulus de perte (G'') du bioink pdECM dans la gamme de 0.1-100 rad/s à 2% de contrainte.

5. L'impression 3D de cellules du tissu pancréatique construit utilisant l'islet

1. Préparation d'îlots isolés
   1. Isoler les îlots primaires d'un rat selon les protocoles décrits dans un travail précédent⁵.
   2. Pour séparer les débris et les cellules mortes de l'înt isolé, passez la suspension cellulaire à travers une passoire cellulaire de 70 m. Les îlots d'un diamètre inférieur à 70 m sont considérés comme morts ou anormaux.
   3. Suspendre les îlots isolés dans le milieu RPMI-1640 et les placer sur le plat de pétri. Enlever les îlots de plus de 300 m de diamètre à l'aide d'une pipette à volume P200 sous le microscope (objectif 4x objectif) dans l'armoire de biosécurité.
2. Encapsulation d'islet dans le bioink de pdECM
   1. Préparer pH ajusté pdECM bioink et islet isolé.
      REMARQUE : Pour éviter la gélation avant l'ajustement du pH, ce processus doit être effectué sur la glace.
   2. Mélanger délicatement le bioink pdECM et le support suspendu avec des îlots (ratio 3:1) à l'aide d'une pipette de déplacement positive jusqu'à consistance homogène.
      REMARQUE : La concentration finale du bioink de pdECM est 1.5% et la densité de cellules dans le bioink de pdECM est 3.000 IEQ/mL.
3. L'impression 3D de cellules des constructions pancréatiques de tissu
   1. Préparer une seringue stérilisée et une buse de 22 G.
      REMARQUE : Cette jauge a été sélectionnée pour l'impression d'îlots d'un diamètre de 100 à 250 m.
   2. Chargez le bioink pdECM chargé d'înet dans la seringue.
   3. Imprimez le bioink avec l'état d'impression optimisé (taux d'alimentation : 150 mm/min; pression pneumatique : 15 kPa) à 18 oC sous la forme d'un treillis.
   4. Pour croiser le bioink, placez la construction imprimée dans l'incubateur pendant 30 min.
   5. Immerger la construction imprimée dans le milieu de culture d'îtal qui est RPMI-1640 milieu complété avec 10% de sérum bovin foetal (FBS), 100 U/mL pénicilline et 100 U/mL streptomycine.

6. Impression 3D de cellules de construction pancréatique avec la structure modelée

1. Préparation de deux types de bioink
   1. Pour valider la polyvalence d'impression à l'aide de plusieurs bioinks, préparez deux ensembles de bioinks pdECM et les tacle zetent en ajoutant 0,4% trypan Blue et Rose Bengal solution dans chaque bioink pdECM à un rapport de 1:20, respectivement.
      REMARQUE : Pour éviter la gélation avant l'ajustement du pH, ce processus doit être effectué sur la glace.
   2. Mélanger délicatement le bioink pdECM et le support suspendu avec des îlots (ratio 3:1) à l'aide d'une pipette de déplacement positive jusqu'à consistance homogène.
      REMARQUE : La concentration finale du bioink de pdECM est 1.5% et la densité de cellules dans le bioink de pdECM est 3.000 IEQ/mL.
2. L'impression 3D de cellules des constructions de tissu pancréatique multimatériau-basées
   1. Préparer des seringues stérilisées et une buse de 25 G.
   2. Chargez chaque bioink (bleu et rouge) en deux seringues différentes, respectivement.
   3. Imprimez le bioink avec une condition d'impression optimisée (taux d'alimentation : 150 mm/min; pression pneumatique : 15 kPa) à 18 oC sous forme de treillis avec des lignes alternées de bleu et de rouge.
   4. Pour croiser le bioink, placez la construction imprimée dans l'incubateur pendant 30 min.
   5. Immerger la construction imprimée dans le milieu de culture d'îtal qui est RPMI-1640 moyen complété avec 10% de sérum bovin foetal (FBS), 100 U/mL pénicilline et 100 U/mL streptomycine.

Résultats

Décellularisation des tissus pancréatiques
Nous avons mis au point le processus de préparation du bioink pdECM afin de fournir des microenvironnements pancréatiques spécifiques aux tissus pour améliorer la fonctionnalité des îlots dans une construction de tissus bioimprimés en 3D (Figure 2A). Après le processus de décellularisation, 97,3 % de l'ADNc a été enlevé et les composants représentatifs de l'ECM tels...

Discussion

Ce protocole a décrit le développement des bioinks de pdECM et la fabrication des constructions pancréatiques 3D de tissu en utilisant des techniques d'impression de cellules 3D. Pour récapituler le microenvironnement du tissu cible dans la construction de tissu machiné 3D, le choix du bioink est critique. Dans une étude précédente, nous avons validé que les bioinks dECM spécifiques aux tissus sont bénéfiques pour favoriser la différenciation et la prolifération des cellules souches¹⁰

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Biological Safety Cabinets	CRYSTE	PURICUBE 1200
Deep Freezer	Thermo Scientific Forma	957
Digital orbital shaker	DAIHAN Scientific	DH.WSO04010
Dry oven	DAIHAN Scientific	WON-155
Freeze dryer	LABCONCO	7670540
Fridge	SANSUNG	CRFD-1141
Grater	ABM	1415605793
Inverted Microscopes	Leica	DMi1
Microcentrifuge	CRYSTE	PURISPIN 17R
Microplate reader	Thermo Fisher Scientific	Multiskan GO
Mini centrifuge	DAIHAN Scientific	CF-5
Multi-Hotplate Stirrers	DAIHAN Scientific	SMHS-6
Nanodrop	Thermo Fisher Scientific	ND-LITE-PR
pH benchtop meter	Thermo Fisher Scientific	STARA2110
Rheometer	TA Instrument	Discovery HR-2
Vortex Mixer	DAIHAN Scientific	VM-10
Cirurgical Instruments
Operating Scissors	Hirose	HC.13-122
Forcep	Korea Ace Scientific	HC.203-30
Materials
1.7 mL microcentrifuge tube	Axygen	MCT-175-C
10 ml glass vial	Scilab	SL.VI1243
40 µm cell strainer	Falcon	352340
5 L beaker	Dong Sung Science	SDS 2400
50 mL cornical tube	Falcon	352070
500 mL beaker	Korea Ace Scientific	KA.23-08
500 mL bottle-top vacuum filter	Corning	431118
500 mL plastic container	LOCK&LOCK	INL301
96well plate	Falcon	353072
Aluminum foil	DAEKYO
Kimwipe	Kimtech
Magnetic bar	Korea Ace Scientific	BA.37110-0003
Mortar and pestle	DAIHAN Scientific	SC.MG100
Multi-channel pipettor	Eppendorf	4982000314
Petri Dish	SPL	10100
pH indicator strips	Sigma-Aldrich	1095350001
Sieve filter mesh	DAIHAN Scientific
Decellularization
10x pbs	Hyclone	SH30258.01
4.7% Peracetic acid	Omegafarm
70% ethanol	SAMCHUN CHEMICALS	E0220 SAM
Distilled water
IPA	SAMCHUN CHEMICALS	samchun I0348
Triton-X 100	Biosesang	T1020
Biochemical assay
1,9-Dimethyl-Methylene Blue zinc chloride double salt	Sigma-Aldrich	341088
10 N NaOH	Biosesang	S2018
Chloramine T	Sigma-Aldrich	857319
Chondroitin sulfate A	Sigma-Aldrich	C4384
Citric acid	Supelco	46933
Cysteine-HCl	Sigma-Aldrich	C1276
Glacial acetic acid	Merok	100063
Glycine	Sigma-Aldrich	410225
HCl	Sigma-Aldrich	H1758
Na2-EDTA	Sigma-Aldrich	E5134
NaCl	SAMCHUN CHEMICALS	S2097
Papain	Sigma-Aldrich	p4762
P-DAB	Sigma-Aldrich	D2004
Perchloric acid	Sigma-Aldrich	311421
Sodium acetate	Sigma-Aldrich	S5636
Sodium hydroxide	Supelco	SX0607N
Sodium phosphate(monobasic)	Sigma-Aldrich	RDD007
Toluene	Sigma-Aldrich	244511
Bioink
Charicterized FBS	Hyclone	SH30084.03
Penicillin-Streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140122
Pepsin	Sigma-Aldrich	P7215
Rose bengal	Sigma-Aldrich	198250
RPMI-1640 medium	Thermo Fisher Scientific	11875093
Trypan Blue solution	Sigma-Aldrich	T8154