Bioink extracelular derivado da matriz de tecido sipâncreas para a impressão de construções de tecidopanpático 3D Carregadas de células

Resumo

A matriz extracelular descelularizada (dECM) pode fornecer pistas microambientais adequadas para recapitular as funções inerentes dos tecidos-alvo em uma construção projetada. Este artigo elucida os protocolos para a descelularização do tecido pancreático, avaliação do bioink dECM derivado do tecido pancreático e geração de construções de tecidopanpático 3D usando uma técnica de bioimpressão.

Resumo

O transplante de ilhotas pancreáticas é um tratamento promissor para pacientes que sofrem de diabetes tipo 1 acompanhado sofrem de hipoglicemia e complicações secundárias. No entanto, o transplante de ilhotas ainda tem várias limitações, como a baixa viabilidade das ilhotas transplantadas devido ao mau enxenxerto de ilhotas e ambientes hostis. Além disso, as células produtoras de insulina diferenciadas das células-tronco pluripotentes humanas têm capacidade limitada de secretar hormônios suficientes que podem regular o nível de glicose no sangue; Portanto, melhorar a maturação, cultivando células com pistas microambientais adequadas é fortemente necessária. Neste artigo, elucidamos protocolos para a preparação de um biotilétil de matriz extracelular descelular descelular (pdECM) derivado do tecido pancreático para fornecer um microambiente benéfico que pode aumentar a sensibilidade à glicose das ilhotas pancreáticas, seguida pela descrição os processos para a geração de tecidos pancreáticos 3D são construídos por meio de uma técnica de bioimpressão baseada em microextrusão.

Introdução

Recentemente, o transplante de ilhotas pancreáticas tem sido considerado um tratamento promissor para pacientes com diabetes tipo 1. A segurança relativa e a invasidão mínima do procedimento são grandes vantagens deste tratamento^1. No entanto, tem várias limitações, como a baixa taxa de sucesso de ilhotas isolante e os efeitos colaterais das drogas imunossupressoras. Além disso, o número de ilhotas enxertadas diminui de forma constante após o transplante devido ao ambiente hostil^2. Vários materiais biocompatíveis, como alginato, colágeno, poli (ácido láctico-coglicólico) (PLGA) ou polietilenoglicol (PEG) foram aplicados ao transplante de ilhotas pancreáticas para superar essas dificuldades.

A tecnologia de impressão de células 3D está surgindo em engenharia de tecidos devido ao seu grande potencial e alto desempenho. Escusado será dizer que os bioinks são conhecidos como componentes importantes para fornecer um microambiente adequado e permitir a melhoria dos processos celulares em construções de tecidos impressos. Um número substancial de hidrogéis de afinamento de tesoura, como fibrina, alginato e colágeno são amplamente utilizados como bioinks. No entanto, esses materiais mostram falta de complexidade estrutural, química, biológica e mecânica em comparação com a matriz extracelular (ECM) no tecido nativo^3. Pistas microambientais, como as interações entre ilhotas e ECM são sinais importantes para melhorar a função das ilhotas. ECM descelularizado (dECM) pode recriar a composição específica do tecido de vários componentes de ECM, incluindo colágeno, glicosaminoglicanos (GAGs) e glicoproteínas. Por exemplo, ilhotas primárias que retêm seus ECMs periféricos (por exemplo, tipo I, III, IV, V e VI colágeno, laminina e fibronectina) exibem baixa apoptose e melhor sensibilidade à insulina, indicando assim que as interações de matriz celular específicas do tecido são importantes para melhorar sua capacidade de funcionar de forma semelhante ao tecido original⁴.

Neste artigo, elucidamos protocolos para a preparação de biotilidade sacarcelulares descelularizadas (pdECM) derivadas de tecidos pancreáticos (pdECM) para fornecer sugestões microambientais benéficas para impulsionar a atividade e as funções das ilhotas pancreáticas, seguidas pelos processos de geração de construções de tecidos pancreáticos 3D usando uma técnica de bioimpressão baseada em microextrusion (Figura 1).

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Protocolo

Tecidos pancreáticos suínos foram coletados de um matadouro local. Experimentos com animais foram aprovados pelo Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) do Asan Medical Center, Seul, Coréia.

1. Descelularização de tecidos

1. Prepare as soluções para a descelularização.
   NOTA: 1x fosfato-buffered soro lógico (PBS) usado em todos os preparativos de solução é diluído pela adição de água destilada para 10x PBS.
   1. Para a solução Triton-X 100 de 1%, dissolva 100 mL de 100% de solução Triton-X 100 em 900 mL de 1x PBS usando uma barra de agitação magnética com a agitação a 150 rpm para 6 h. Faça 400 mL de 1% Triton-X 100 solução com 40 mL de 10% Triton-X 100 solução e 360 mL de 1x PBS preparado pouco antes do uso.
      NOTA: A solução Triton-X 100 de 10% pode ser armazenada à temperatura ambiente até que seja necessário.
   2. Para a solução de ácido peracético de 0,1%, diluir 8,5 mL de 4,7% de ácido peracético em 22,8 mL de 70% de etanol com 368,7 mL de água destilada pouco antes do uso.
2. Retire os tecidos periféricos do pâncreas e corte o tecido antes da descelularização.
   1. Lave o pâncreas porcino ressecado com água da torneira corrente e retire os tecidos periféricos usando tesoura esterilizada.
   2. Transfira o pâncreas em um saco plástico com fórceps e congele -80 °C por 1 h para ajudar a cortar o pâncreas de forma eficaz para o próximo passo.
   3. Corte o pâncreas congelado em pedaços de 1 mm de espessura usando um ralador.
   4. Transfira 50 g do tecido fatiado em um recipiente plástico de 500 mL.
      NOTA: Um recipiente plástico com uma tampa é recomendado aqui para proteger os tecidos da contaminação e evitar a evaporação da solução.
3. Tratamento com reagentes.
   NOTA: Todo o processo de descelularização deve ser realizado a 4 °C em um agitador orbital digital às 150 rpm. Em todas as etapas de descelularização, o desprendimento físico usando fórceps é necessário para evitar que as fatias de pâncreas grudem. Lavar o recipiente com água destilada é necessário para remover os reagentes residuais completamente no recipiente.
   1. Antes de qualquer tratamento de reagente, lave 50 g de pâncreas fatiado com 300 mL de água destilada usando uma coqueteleira.
   2. Mexa o tecido continuamente a 150 rpm até que a água turva desapareça (após aproximadamente 12 h). Substitua a água destilada a cada 2 h.
      NOTA: Alterar a água destilada a cada hora é recomendado para a eficiência para remover a água turva mais rapidamente.
   3. Descarte a água e trate os 50 g de tecidos com 400 mL de 1% Triton-X 100 na solução PBS 1x por 84 h. Refresque a solução a cada 12 h.
      NOTA: Neste ponto, a quantidade de tecido diminuirá porque os componentes celulares começam a ser removidos.
   4. Trate com 400 mL de isopropanol (IPA) por 2 h para remover a gordura restante do pâncreas.
      NOTA: É normal que o tecido se torne difícil devido à remoção de gordura neste processo.
   5. Após 2 h, retire o IPA e lave o tecido com 400 mL de 1x PBS para 24 h. Refresque o PBS 1x cada 12 h.
   6. Esterilizar o tecido descelularizado, descarte a solução anterior e trate com 400 mL de 0,1% de ácido peracético em 4% de etanol para 2 h.
   7. Para remover detergente residual, lave o tecido com 400 mL de 1x PBS para 6 h. Refresque a solução a cada 2 h.
   8. Colete os tecidos descelularizados em um tubo cônico de 50 mL com fórceps.
   9. Congele a amostra a -80 °C para 1 h. Cubra o tubo cônico com uma limpeza sem fiapos em vez da tampa e conserte com um elástico para lioffiização eficiente.
   10. Lyofilize o tecido descelularizado em -50 °C para 4 d.
       NOTA: Para a etapa 1.3, 1 g de tecido não decelularizado também deve ser liofilizado as mesmas condições.

2. Avaliação de tecidos descelularedos

NOTA: Para avaliar a quantidade residual de dsDNA, glicosaminoglicanos (GAGs) e colágeno no tecido descelularizado em comparação com o tecido nativo, pelo menos 1 g de cada um dos tecidos não descelularizados (tecido nativo) e tecido descelularizado são necessários para um lote de avaliação. A quantidade de dsDNA, GAGs e colágeno pode ser calculada com base no peso seco do tecido.

1. Prepare soluções para ensaios bioquímicos.
   1. Prepare a solução de papain para a digestão da amostra.
      NOTA: A quantidade de buffer a ser feita pode ser ajustada de acordo com o número de amostras.
      1. Dissolva 119 mg de 0,1 M de fosfato de sódio (monobasic), 18,6 mg de 0,5 mM Na2-EDTA, e 8,8 mg de 5 mM cisteína-HCl em 10 mL de água autocllavada.
      2. Ajuste o pH da solução para 6,5 adicionando a solução De 10 M NaOH.
      3. Adicione 125 μL de 10 mg/mL solução de ações de papaina para a solução acima e vórtice, permitindo que cada elemento se misture uniformemente.
   2. Prepare soluções para o ensaio azul de dimetileno (DMMB).
      1. Para fazer dinência de DMMB, dissolva 8 mg de 1,9-dimetileno de zinco azul cloreto de dois sal, 1,52 g de glicina e 1,185 g de NaCl em 500 mL de água autocllavada. Ajuste o pH para 3 adicionando a solução HCl de 0,5 M ao medir a mudança de pH usando um medidor de pH de bancada. Em seguida, filtre isso através de um filtro de vácuo de 500 mL.
      2. Faça 15 μL de 10 mg/mL chondroitin sulfato Uma solução para o padrão.
   3. Prepare soluções para o ensaio hidroxiproline.
      1. Para a solução de trabalho de cloramina, dissolva 2,4 g de acetato de sódio, 1 g de ácido cítrico e 0,68 g de hidróxido de sódio em 24 mL de água destilada e adicione 240 μL de ácido acético glacial, 10 μL de tolueno e 6 mL de IPA.
         NOTA: Dissolva todos os pós em solução usando um misturador de vórtice. A solução de trabalho de cloramina pode ser armazenada a 4 °C por até três meses.
      2. Para a solução de cloromina T, dissolva 0,35 g de cloramina T em 20 mL de solução de trabalho de cloramina e adicione 2,5 mL de IPA. Vortex para misturar todos os componentes.
         NOTA: Prepare-se imediatamente antes do uso.
      3. Para a solução P-DAB, coloque 3,75 g de P-DAB em 6,5 mL de ácido perdérico e 15 mL de IPA; envolvê-lo em folha de alumínio.
         NOTA: Prepare-se imediatamente antes do uso.
2. Adicione 1 mL de solução de papaina a 10 mg de tecido lyofificado em um tubo de microcentrírífuga de 1,5 mL e vórtice do tubo para digerir melhor a amostra.
3. Coloque o tubo de microcentrírífuga de 1,5 mL em um rack de borracha e digere as amostras em um copo de 500 mL que contém 300 mL de água a 60 °C por 16 h.
4. Centrífuga a 9.500 x g por 20 min, recolher o supernatant, e transferi-lo para um novo tubo.
5. Quantificar o DNA residual e as principais proteínas do tecido descelularizado.
   1. Carga 1 μL de amostra digerida no espectrômetro e medir a quantidade de dsDNA de acordo com as instruções do fabricante.
      NOTA: O experimentador deve amarrar o cabelo para trás e usar uma máscara para evitar contaminar a amostra.
6. Realize um ensaio de DMMB para quantificar a quantidade de GAGs que permanece no tecido decellularized.
   1. Misture 1 μL de sulfato de condroitina Uma solução e 499 μL de 1x PBS para fazer padrões. Diluir o sulfato de condroitina Uma solução com água destilada em concentrações de 0, 4, 8, 12, 16 e 20 μg/mL.
   2. Carregar triplicados de 50 μL de cada concentração do padrão e amostras digeridas em uma placa de 96 poços.
   3. Adicione 200 μL do tintendência DMMB a cada poço usando uma pipeta multicanal.
   4. Leia imediatamente a absorção em 525 nm em um leitor do microplate.
7. Realize um ensaio hidroxiproline para quantificar a quantidade de colágeno.
   1. Para realizar um ensaio hidroxiproline, incubar 250 μL de amostra digerida com volumes iguais de HCl em 120 °C para 16 h.
   2. Seque os resíduos à temperatura ambiente por 3 h para resfriar as amostras e, em seguida, redissolver as amostras em 1 mL de 1x PBS.
   3. Centrífuga a 2.400 x g por 10 min a 4 °C.
   4. Prepare a solução hidroxiproline de 100 μg/mL como padrão.
   5. Diluir a solução hidroxiproline com água destilada a uma concentração de 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 15, 20, 30 μg/mL para uma solução padrão.
   6. Carregar triplicados de 50 μL de amostras e solução padrão em uma placa de 96 poços.
   7. Adicione 50 μL de solução De Cloramina T, em seguida, incubar por 20 min à temperatura ambiente.
   8. Adicione 50 μL de solução p-DAB e incubar por 30 min a 60 °C.
      NOTA: Aliquot em um quarto escuro. Após a adição, envolva a placa com papel alumínio.
   9. Incubar à temperatura ambiente por 30 min.
   10. Após o resfriamento, medir a absorção em 540 nm em um leitor de microplaca.

3. Preparação bioink

NOTA: pó pdECM pode ser armazenado de forma evigorada a -80 °C por pelo menos um ano. Antes do ajuste do pH, a solução de pdECM digerido pode ser armazenada a -20 °C por um mês. Antes do uso, descongele a amostra da solução congelada do pdECM em 4 °C durante a noite. A solução pdECM ajustada ao pH pode ser armazenada a 4 °C por até uma semana. A solução de pdECM digerido pode ser armazenada a 4 °C por pelo menos alguns dias, mas não deve exceder 1 semana.

1. Dime o pdECM liofilizado com pepsina.
   1. Para uma digestão eficaz do bioink, pulverize o pdECM lyophilized com nitrogênio líquido usando um almofariz e um pilão.
   2. Colete 200 mg do pó pdECM no tubo cônico de 50 mL e adicione 20 mg de peptina e 8,4 mL do ácido acético de 0,5 M (concentração final é de 2 w/v%).
   3. Coloque a barra de agitação magnética no tubo cônico de 50 mL e mexa em 300 rpm para 96 h.
2. Ajuste o pH da solução de pdECM digerido.
   NOTA: Para evitar a gelação antes do ajuste do pH, esse processo deve ser realizado no gelo.
   1. Filtrar as partículas não digeridas na solução pdECM usando um filtro de célula de 40 μm usando uma pipeta de deslocamento positivo no gelo para obter a digestão ideal das partes.
   2. Adicione 1 mL do PBS 10x e vórtice antes de usar NaOH.
   3. Ajuste o pH para 7 com 10 M NaOH verificando o pH com tiras indicadoras de pH.
      NOTA: Vortex cada vez Que NaOH é adicionado de modo que o bioink seja misturado completamente com os outros reagents.

4. Análise reológica

1. Configuração experimental
   1. Prepare os 1,5% (w/v) de bioink pdECM para avaliar as propriedades reológicas.
   2. Estabeleça uma geometria da placa do cone de 20 milímetros (diâmetro do cone de 20 milímetros com um ângulo de 2°) na modalidade taxa-controlada de um rheometer.
   3. Criar sequências experimentais no software instalado (TRIOS) para medir a viscosidade, a cinética de gelação e o modulus dinâmico do bioink pdECM.
      1. Viscosidade: Coloque o bioink pdECM na placa. Medir viscosidade complexa (Pa·s) de bioink pdECM uma taxa crescente de cisalhamento de 1 para 1.000^s-1 a uma temperatura constante de 15 °C.
      2. Cinética gelatação: Coloque o bioink pdECM na placa. Calcule o complexo modulus (G*) medindo o modulus do armazenamento e da perda do bioink do pdECM em 4-37 °C com uma taxa incremental do aumento de 5 °C/min (modalidade da tempo-varredura).
      3. Modulo dinâmico: Coloque o bioink pdECM na placa a 37 °C por 60 minutos antes da medição. Medir o modulus de armazenamento dependente da frequência (G') e o modulus de perda (G'') do bioink pdECM na faixa de 0,1-100 rad/s em 2% de tensão.

5. impressão de células 3D de construções de tecidopanpático usando ilhota

1. Preparação de ilhotas isoladas
   1. Isolar ilhotas primárias de um rato de acordo com os protocolos descritos em um trabalho anterior⁵.
   2. Para separar detritos e células mortas da ilhota isolada, passe a suspensão celular através de um filtro de células de 70 μm. Ilhotas com um diâmetro inferior a 70 μm são consideradas mortas ou anormais.
   3. Suspenda as ilhotas isoladas no meio RPMI-1640 e coloque-as na placa de Petri. Remova ilhotas maiores que 300 μm de diâmetro usando uma pipeta de volume P200 o microscópio (lente objetiva 4x) no armário de biossegurança.
2. Encapsulamento de ilhota em bioink pdECM
   1. Prepare bioink pdECM ajustado pH e ilhota isolada.
      NOTA: Para evitar a gelação antes do ajuste do pH, este processo deve ser realizado no gelo.
   2. Misture suavemente o bioink pdECM e a mídia suspensa com ilhotas (proporção 3:1) usando uma pipeta de deslocamento positivo até uniformemente misturada.
      NOTA: A concentração final do bioink pdECM é de 1,5% e a densidade celular no bioink pdECM é de 3.000 IEQ/mL.
3. Impressão de células 3D de construções de tecidopanpático
   1. Prepare uma seringa esterilizada e um bico de 22 G.
      NOTA: Este medidor foi selecionado para ilhotas de impressão com um diâmetro de 100-250 μm.
   2. Carregar ilhota-laden pdECM bioink na seringa.
   3. Imprima o bioink com a condição de impressão otimizada (taxa de alimentação: 150 mm/min; pressão pneumática: 15 kPa) a 18 °C em forma de treliça.
   4. Para cruzar o bioink, coloque a construção impressa na incubadora por 30 min.
   5. Mergulhe a construção impressa na mídia de cultura ilhota, que é rpmi-1640 médio complementado com 10% fetal bovino soro (FBS), 100 U/ mL penicilina e 100 U/mL estreptomicina.

6. impressão de células 3D de construção pancreática com estrutura padronizada

1. Preparação de dois tipos do bioink
   1. Para validar a versatilidade de impressão usando bioinks múltiplos, prepare dois conjuntos de bioinks pdECM e manche-os adicionando 0,4% da solução Trypan Blue e Rose Bengal em cada bioink pdECM em uma proporção de 1:20, respectivamente.
      NOTA: Para evitar a gelação antes do ajuste do pH, este processo deve ser conduzido no gelo.
   2. Misture suavemente o bioink pdECM e a mídia suspensa com ilhotas (proporção 3:1) usando uma pipeta de deslocamento positivo até uniformemente misturada.
      NOTA: A concentração final do bioink pdECM é de 1,5% e a densidade celular no bioink pdECM é de 3.000 IEQ/mL.
2. Impressão de células 3D de construções de tecidopanptica baseadas em vários materiais
   1. Prepare seringas esterilizadas e um bico de 25 G.
   2. Carregue cada bioink (azul e vermelho) em duas seringas diferentes, respectivamente.
   3. Imprima o bioink com condição de impressão otimizada (taxa de alimentação: 150 mm/min; pressão pneumática: 15 kPa) a 18 °C em forma de treliça com linhas alternadas de azul e vermelho.
   4. Para cruzar o bioink, coloque a construção impressa na incubadora por 30 min.
   5. Mergulhe a construção impressa na mídia de cultura de ilhotas, que é rpmi-1640 médio complementado com 10% de soro bovino fetal (FBS), 100 U/ mL penicilina e 100 U/mL estreptomicina.

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Resultados

Descelularização dos tecidos pancreáticos
Desenvolvemos o processo de preparação de biotilidade pdECM para fornecer microambientes específicos de tecido pancreático para melhorar a funcionalidade das ilhotas em uma construção de tecido bioimpresso 3D (Figura 2A). Após o processo de descelularização, 97,3% do dsDNA foi removido e os componentes representativos da ECM, como colágeno e GAGs, permaneceram em 1278,...

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Discussão

Este protocolo descreveu o desenvolvimento de bioinks pdECM e a fabricação de construções de tecidopanpático 3D usando técnicas de impressão de células 3D. Para recapitular o microambiente do tecido alvo na construção de tecidos projetados em 3D, a escolha do bioink é fundamental. Em um estudo anterior, validamos que bioinks de dECM específicos do tecido são benéficos para promover a diferenciação de células-tronco e proliferação^10. Em comparação com polímeros sintéticos, o ...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Biological Safety Cabinets	CRYSTE	PURICUBE 1200
Deep Freezer	Thermo Scientific Forma	957
Digital orbital shaker	DAIHAN Scientific	DH.WSO04010
Dry oven	DAIHAN Scientific	WON-155
Freeze dryer	LABCONCO	7670540
Fridge	SANSUNG	CRFD-1141
Grater	ABM	1415605793
Inverted Microscopes	Leica	DMi1
Microcentrifuge	CRYSTE	PURISPIN 17R
Microplate reader	Thermo Fisher Scientific	Multiskan GO
Mini centrifuge	DAIHAN Scientific	CF-5
Multi-Hotplate Stirrers	DAIHAN Scientific	SMHS-6
Nanodrop	Thermo Fisher Scientific	ND-LITE-PR
pH benchtop meter	Thermo Fisher Scientific	STARA2110
Rheometer	TA Instrument	Discovery HR-2
Vortex Mixer	DAIHAN Scientific	VM-10
Cirurgical Instruments
Operating Scissors	Hirose	HC.13-122
Forcep	Korea Ace Scientific	HC.203-30
Materials
1.7 mL microcentrifuge tube	Axygen	MCT-175-C
10 ml glass vial	Scilab	SL.VI1243
40 µm cell strainer	Falcon	352340
5 L beaker	Dong Sung Science	SDS 2400
50 mL cornical tube	Falcon	352070
500 mL beaker	Korea Ace Scientific	KA.23-08
500 mL bottle-top vacuum filter	Corning	431118
500 mL plastic container	LOCK&LOCK	INL301
96well plate	Falcon	353072
Aluminum foil	DAEKYO
Kimwipe	Kimtech
Magnetic bar	Korea Ace Scientific	BA.37110-0003
Mortar and pestle	DAIHAN Scientific	SC.MG100
Multi-channel pipettor	Eppendorf	4982000314
Petri Dish	SPL	10100
pH indicator strips	Sigma-Aldrich	1095350001
Sieve filter mesh	DAIHAN Scientific
Decellularization
10x pbs	Hyclone	SH30258.01
4.7% Peracetic acid	Omegafarm
70% ethanol	SAMCHUN CHEMICALS	E0220 SAM
Distilled water
IPA	SAMCHUN CHEMICALS	samchun I0348
Triton-X 100	Biosesang	T1020
Biochemical assay
1,9-Dimethyl-Methylene Blue zinc chloride double salt	Sigma-Aldrich	341088
10 N NaOH	Biosesang	S2018
Chloramine T	Sigma-Aldrich	857319
Chondroitin sulfate A	Sigma-Aldrich	C4384
Citric acid	Supelco	46933
Cysteine-HCl	Sigma-Aldrich	C1276
Glacial acetic acid	Merok	100063
Glycine	Sigma-Aldrich	410225
HCl	Sigma-Aldrich	H1758
Na2-EDTA	Sigma-Aldrich	E5134
NaCl	SAMCHUN CHEMICALS	S2097
Papain	Sigma-Aldrich	p4762
P-DAB	Sigma-Aldrich	D2004
Perchloric acid	Sigma-Aldrich	311421
Sodium acetate	Sigma-Aldrich	S5636
Sodium hydroxide	Supelco	SX0607N
Sodium phosphate(monobasic)	Sigma-Aldrich	RDD007
Toluene	Sigma-Aldrich	244511
Bioink
Charicterized FBS	Hyclone	SH30084.03
Penicillin-Streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140122
Pepsin	Sigma-Aldrich	P7215
Rose bengal	Sigma-Aldrich	198250
RPMI-1640 medium	Thermo Fisher Scientific	11875093
Trypan Blue solution	Sigma-Aldrich	T8154