3D細胞-細胞-膵組織コンストラクトを印刷するための膵組織由来細胞外マトリックスバイオインク

要約

脱細胞細胞細胞細胞外マトリックス(dECM)は、工学的構造における標的組織の固有の機能を再現するための適切なマイクロ環境手掛かりを提供することができる。本稿では、膵組織の脱細胞化、膵臓組織由来dECMバイオインクの評価、バイオプリンティング技術を用いた3D膵臓組織構築物の生成に関するプロトコルを解明する。

要約

膵島の移植は、低血糖および二次合併症を伴う1型糖尿病に罹患した患者のための有望な治療法である。しかしながら、島の移植はまだ貧しい島の生着や敵対的な環境による移植された島の生存率の低さのようないくつかの制限を持っています。さらに、ヒト多能性幹細胞から分化したインスリン産生細胞は、血糖値を調節できる十分なホルモンを分泌する能力が限られている。そのため、適切なマイクロ環境的手掛かりを持つ細胞を培養して成熟を改善することは強く求められている。本稿では、膵島のグルコース感受性を高めることができる有益な微小環境を提供するために、膵組織由来の細胞外細胞外細胞外マトリックス(pdECM)バイオインクを調製するためのプロトコルを解明し、マイクロ押出ベースのバイオプリンティング技術を用いて3D膵臓組織構築物を生成するプロセス。

概要

近年、膵島移植は1型糖尿病患者に対する有望な治療法と考えられている。手順の相対的な安全性および最低の侵襲性は、この処置¹の大きな利点である。しかし、島の孤立の成功率が低い、免疫抑制薬の副作用など、いくつかの制限があります。さらに、生着島の数は、敵対的な環境²に起因する移植後に着実に減少する。これらの困難を克服するために、アルギン酸塩、コラーゲン、ポリ(乳酸共グリコール酸)(PLGA)またはポリエチレングリコール(PEG)などの種々の生体適合性物質が膵島移植に適用されています。

3D細胞印刷技術は、その大きな可能性と高性能のために組織工学で出現しています。言うまでもなく、バイオインクは、適切な微小環境を提供し、印刷された組織構造における細胞プロセスの改善を可能にするための重要なコンポーネントとして知られています。フィブリン、アルギン酸塩、コラーゲンなどのせん断薄ヒドロゲルの相当数は、バイオインクスとして広く使用されています。しかしながら、これらの物質は、天然組織³における細胞外マトリックス(ECM)と比較して構造的、化学的、生物学的、および機械的複雑性の欠如を示す。小島とECMの相互作用などの微小環境上の手掛かりは、島の機能を高めるための重要なシグナルです。脱細胞化ECM(dECM)は、コラーゲン、グリコサミノグリカン(GAG)、および糖タンパク質を含む様々なECM成分の組織特異的組成物を再現することができる。例えば、末梢ECMを保持する一次島(例えば、I型、III型、IV型、Iv、VIコラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン)は、低アポトーシスおよびより良いインスリン感受性を示し、したがって、組織特異的細胞マトリックス相互作用が元の組織⁴と同様に機能する能力を高めるために重要であることを示す。

本論文では、膵組織由来の細胞外細胞外マトリックス(pdECM)バイオインクを調製し、膵島の活性と機能を高めるための有益な微小環境的手掛かりを提供するためのプロトコルを解明し、続いてマイクロエクストルションベースのバイオプリンティング技術を用いて3D膵組織構築物を生成するプロセスを解明する(図1)。

プロトコル

豚膵臓組織は地元の食肉処理場から採取された。動物実験は、韓国ソウルのアサン医療センターの制度動物ケア利用委員会(IACUC)によって承認された。

1. 組織脱細胞化

1. 脱細胞化のための溶液を準備します。
   注:すべての溶液調製物に使用される1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)は、10x PBSに蒸留水を添加して希釈する。
   1. 1% Triton-X 100溶液の場合、1x PBSの900 mLに100mLの100 mLを溶解し、磁気攪拌バーを使用して150 rpmで6時間攪拌しながら、1%Triton-X 100溶液の40mLを10%Triton-X 100溶液で40mLにし、16xの16xmL溶液を100mLで100mLにする。使用直前に準備された PBS。
      メモ:10%Triton-X 100溶液は、必要になるまで室温で保存することができます。
   2. 0.1%の過酢酸溶液の場合、8.5 mLの4.7mLの1酢酸を、使用直前の蒸留水368.7mLで70%エタノールの22.8 mLに希釈します。
2. 膵臓の末梢組織を取り除き、脱細胞化する前に組織をスライスします。
   1. 切除した豚の膵臓を水道水で洗い、殺菌されたはさみを使って周辺組織を取り除きます。
   2. 鉗子が付いているビニール袋に膵臓を移し、次のステップのために膵臓を効果的に切断するのを助けるために1時間-80°Cで凍結する。
   3. 冷凍膵臓を1mmの厚さにスライスします。
   4. スライスした組織の50gを500mLのプラスチック容器に移す。
      メモ:組織を汚染から保護し、溶液の蒸発を防ぐために、蓋付きのプラスチック容器をここにお勧めします。
3. 試薬による処理。
   注:脱細胞化プロセス全体は、150rpmのデジタル軌道シェーカーで4°Cで行う必要があります。すべての脱細胞化工程において、膵臓のスライスがくっつくのを防ぐために鉗子を用いた物理的剥離が必要である。蒸留水で容器を洗浄することは、容器内の残留試薬を完全に除去する必要がある。
   1. 試薬処理の前に、シェーカーを使用して300mLの蒸留水でスライスされた膵臓の50gを洗浄します。
   2. 曇った水が消えるまで(約12時間後)、組織を150rpmで連続的に攪拌する。蒸留水を2時間ごとに交換してください。
      注:蒸留水を1時間ごとに交換すると、より迅速に曇った水を取り除くために効率を上げるための方法をお勧めします。
   3. 水を捨て、1x PBS溶液中の400 mLの50gの組織を84時間1xPBS溶液で処理します。
      メモ:この時点で、細胞成分が除去され始めるので、組織の量が減少します。
   4. イソプロパノール(IPA)400mLで2時間処理し、膵臓から残りの脂肪を除去する。
      注:このプロセスで脂肪の除去のために組織がタフになるのは正常です。
   5. 2時間後、IPAを取り出し、400 mLの1x PBSで24時間洗浄し、12時間ごとに1x PBSをリフレッシュします。
   6. 脱細胞組織を殺菌するには、前の溶液を廃棄し、4%エタノール中の400mLの0.1%の酢酸を2時間処理します。
   7. 残留洗剤を除去するには、400 mLの1x PBSで6時間洗浄し、溶液を2時間ごとにリフレッシュします。
   8. 鉗子で50 mL円錐管内の脱細胞組織を収集します。
   9. サンプルを-80°Cで1時間凍結し、蓋の代わりにリントフリーワイプで円錐管を覆い、効率的な凍結乾燥のためにゴムバンドで固定します。
   10. 4dの-50°Cで脱細胞組織を凍結乾燥する。
       注:ステップ1.3では、非細胞化組織の1gも同じ条件で凍結乾燥する必要があります。

2. 脱細胞組織の評価

注:dsDNA、グリコサミノグリカン(GAGs)、および非細胞化組織におけるコラーゲンの残存量をネイティブ組織と比較して評価するには、非細胞化組織(天然組織)および脱細胞組織のそれぞれに少なくとも1gが必要です。評価のバッチ。dsDNA、GAG、およびコラーゲンの量は、組織の乾燥重量に基づいて計算することができる。

1. 生化学的アッセイのための解決策を準備する。
   1. サンプル消化のためのパパイン溶液を準備します。
      注: 作成するバッファの量は、サンプルの数に応じて調整できます。
      1. 0.1 M リン酸ナトリウム (モノベーシック), 18.6 mg 0.5 mM Na2-EDTA, 8.8 mg の 5 mM システイン HCl をオートクレーブ水 10 mL で溶解します。
      2. 10 M NaOH溶液を加えて、溶液のpHを6.5に調整します。
      3. 上記の溶液と渦に10mg/mLパパインの125 μLを加え、各要素を均等に混合できるようにします。
   2. ジメチルメチレンブルー(DMMB)アッセイの溶液を調製します。
      1. DMMB色素を作るためには、8mgの1,9-ジメチルメチレンブルー塩化亜鉛二重塩、1.52gのグリシン、および1.185gのNaClをオートクレーブ水の500mLに溶解します。ベンチトップpHメーターを使用してpHの変化を測定しながら、0.5 M HCl溶液を加えてpHを3に調整します。次に、500 mL ボトルトップ真空フィルターを通してこれをフィルター処理します。
      2. 10 mg/mL コンドロイチン硫酸 A 溶液の 15 μL を標準用に作成します。
   3. ヒドロキシプロリンアッセイの溶液を準備する。
      1. クロラミン作動液の場合、2.4gの酢酸ナトリウム、クエン酸1g、水酸化ナトリウム0.68gを蒸留水24mLに溶解し、氷酢酸240μL、トルエン10μL、IPA6mLを加えます。
         メモ:ボルテックスミキサーを使用して溶液にすべての粉末を溶解します。クロラミン加工液は、4°Cで最大3ヶ月間保存できます。
      2. クロラミンT溶液の場合、クロラミン加工液の20mLに0.35gのクロラミンTを溶解し、2.5 mLのIPAを加えます。すべてのコンポーネントを混合する渦。
         メモ:使用する直前に準備してください。
      3. P-DAB溶液の場合は、3.75gのP-DABを過塩素酸の6.5 mLとIPAの15 mLに入れます。アルミ箔で包みます。
         メモ:使用する直前に準備してください。
2. 1.5 mLマイクロ遠心管と渦チューブの凍結乾燥組織の10mgにパパイン溶液の1 mLを追加し、サンプルをより良く消化します。
3. 1.5 mLマイクロ遠心管をゴムラックに入れ、300 mLの水を含む500 mLビーカーでサンプルを消化し、60°Cで16時間浸潤します。
4. 9,500 x gで20分間遠心分離し、上清を収集し、新しいチューブに移します。
5. 脱細胞組織中の残留DNAおよび主要タンパク質を定量する。
   1. 消化したサンプルを分光器に1μL積み込み、メーカーの指示に従ってdsDNAの量を測定します。
      メモ:実験者は、サンプルを汚染しないように、髪を後ろに結び、マスクを着用する必要があります。
6. DMMBアッセイを実行して、脱細胞組織に残るGAGの量を定量化します。
   1. コンドロイチン硫酸A溶液1μL、1x PBSの499°Lを混ぜて標準を作ります。コンドロイチン硫酸A溶液を0、4、8、12、16、20μg/mLの濃度で蒸留水で希釈します。
   2. 標準および消化されたサンプルの各濃度の50°Lの3重ね合いを96ウェルプレートにロードします。
   3. マルチチャンネルピペットを使用して、DMMB染料の200°Lを各ウェルに加えます。
   4. すぐにマイクロプレートリーダーの525 nmで吸光度を読み取ります。
7. ヒドロキシプロリンアッセイを行い、コラーゲンの量を定量する。
   1. ヒドロキシプロリンアッセイを行うには、16時間120°Cで同じ量のHClを有する消化サンプルの250μLをインキュベートする。
   2. 室温で残渣を3時間乾燥させてサンプルを冷却し、1x PBSの1 mLでサンプルを再溶解します。
   3. 遠心分離機は2,400 x gで4°Cで10分間。
   4. 100μg/mLヒドロキシプロリン溶液を標準で調製します。
   5. 蒸留水で希釈したヒドロキシプロリン溶液は、標準溶液の濃度0、1、2、3、4、5、6、8、10、15、20、30μg/mLです。
   6. 50°Lのサンプルと標準溶液の30°Lを96ウェルプレートにロードします。
   7. 50μLのクロラミンT溶液を加え、室温で20分間インキュベートします。
   8. 50°Lのp-DAB溶液を加え、60°Cで30分間インキュベートします。
      注:暗い部屋のアリコート。追加後、プレートをアルミ箔で包みます。
   9. 室温で30分間インキュベートする。
   10. 冷却後、マイクロプレートリーダーで540nmで吸光度を測定します。

3. バイオインク調製

注:pdECM粉末は、少なくとも1年間-80°Cで安定して保存することができます。pH調整の前に、消化されたpdECM溶液は-20°Cで1ヶ月間保存することができます。使用前に、凍結pdECM溶液の試料を4°Cで一晩解凍する。pH調整pdECM溶液は4°Cで最大1週間保存できます。消化されたpdECM溶液は、少なくとも数日間4°Cで保存することができますが、1週間を超えてはなりません。

1. ペプシンで凍結乾燥pdECMを消化します。
   1. バイオインクの効果的な消化のために、モルタルと害虫を使用して液体窒素で凍結乾燥pdECMを粉砕する。
   2. 50 mL円錐形チューブに200mgのpdECM粉末を集め、0.5M酢酸のペプシン20mgと8.4 mL(最終濃度は2w/v%)を加えます。
   3. 磁気攪拌バーを50mL円錐管に入れ、300rpmで96時間撹拌します。
2. 消化pdECM溶液のpHを調整します。
   注:pH調整前にゲル化を避けるために、このプロセスは氷上で行う必要があります。
   1. 氷上の正の変位ピペットを使用して40μmのセルストレーナーを使用してpdECM溶液中の未消化粒子を除外し、部品の最適な消化を得ます。
   2. NaOH を使用する前に、10x PBS と渦の 1 mL を追加します。
   3. pH インジケータストリップで pH をチェックして、10 M NaOH で pH を 7 に調整します。
      注:ボルテックスは、バイオインクが他の試薬と完全に混合されるように、NaOHが添加されるたびに。

4. レオロジー分析

1. 実験的なセットアップ
   1. pdECMバイオインクの1.5%(w/v)を準備し、レオロジー特性を評価します。
   2. 回転計のレート制御モードで、20 mm の円錐板ジオメトリ(2°角度の円錐径 20 mm)を確立します。
   3. インストール済みソフトウェア(TRIOS)で実験シーケンスを作成し、pdECMバイオインクの粘度、ゲル化動力学、動的弾性率を測定します。
      1. 粘度:プレート上にpdECMバイオインクを置きます。pdECMバイオインクの複雑な粘度(Pa·s)を、15°Cの一定温度で1から1,000 s^-1に増加させるせん断速度で測定します。
      2. ゲル化動態:プレート上にpdECMバイオインクを置きます。4~37°CのpdECMバイオインクの貯蔵率と損失弾性率を5°C/分(タイムスイープモード)で測定して、複雑弾性率(G*)を計算します。
      3. 動的弾性率:pdECMバイオインクをプレート上に37°Cで30分間置き、測定を行います。pdECMバイオインクの周波数依存記憶弾性率(G')と損失弾性率(G'')を、2%の歪みで0.1~100ラッド/sの範囲で測定します。

5. 膵島を用いた膵臓組織構築物の3D細胞印刷

1. 孤立した小島の調製
   1. 前の作業⁵で説明したプロトコルに従って、ラットからプライマリ 島を分離します。
   2. 単離された小石から破片と死んだ細胞を分離するには、70μmの細胞ストレーナーを通して細胞懸濁液を通過させます。直径が70μm未満の島は、死んでいるか異常と見なされます。
   3. 孤立した小島をRPMI-1640培地でサスペンドし、ペトリ皿の上に置きます。バイオセーフティキャビネットの顕微鏡(4x対物レンズ)の下でP200ボリュームピペットを使用して、直径300μmを超える小島を取り外します。
2. pdECMバイオインクへのアイレットカプセル化
   1. pH調整済みpdECMバイオインクおよび単離された小腸を調製する。
      注:pH調整前にゲル化を避けるために、このプロセスは氷上で行う必要があります。
   2. pdECMバイオインクと懸濁した媒体を、正の変位ピペットを使用して、均一に混合するまで穏やかに混合します(比率3:1)。
      注:pdECMバイオインクの最終濃度は1.5%、pdECMバイオインクの細胞密度は3,000 IEQ/mLです。
3. 膵組織構造の3D細胞印刷
   1. 殺菌された注射器および22 Gのノズルを準備しなさい。
      注:このゲージは、直径100~250μmの小冊子を印刷するために選択されました。
   2. シリンジにアイレットを積んだpdECMバイオインクをロードします。
   3. 最適化された印刷条件(供給速度:150mm/min;空気圧:15kPa)でバイオインクをラティスの形で18°Cで印刷します。
   4. バイオインクを架橋するには、プリントされたコンストラクトをインキュベーターに30分間置きます。
   5. 10%ウシ血清(FBS)、100 U/mLペニシリンおよび100 U/mLストレプトマイシンを添加したRPMI-1640培地である島の培養培地に印刷された構造を浸漬する。

6. パターン構造を有する膵構造の3D細胞印刷

1. バイオインクの2種類の調製
   1. 複数のバイオインクを使用して印刷の汎用性を検証するには、2組のpdECMバイオインクを準備し、それぞれ1:20の比率で各pdECMバイオインクに0.4%のトリパンブルーとローズベンガル溶液を加えて染色します。
      注:pH調整前にゲル化を避けるために、このプロセスは氷上で行う必要があります。
   2. pdECMバイオインクと懸濁した媒体を、正の変位ピペットを使用して、均一に混合するまで穏やかに混合します(比率3:1)。
      注:pdECMバイオインクの最終濃度は1.5%、pdECMバイオインクの細胞密度は3,000 IEQ/mLです。
2. 多材料系膵組織構築物の3D細胞印刷
   1. 殺菌された注射器および25 Gのノズルを準備する。
   2. 各バイオインク(青と赤)をそれぞれ2つの異なる注射器にロードします。
   3. 最適化された印刷条件(供給速度:150 mm/min;空気圧:15 kPa)でバイオインクを18°Cで印刷し、青と赤の交互の線で格子の形をします。
   4. バイオインクを架橋するには、プリントされたコンストラクトをインキュベーターに30分間置きます。
   5. 10%ウシ血清(FBS)、100 U/mLペニシリンおよび100 U/mLストレプトマイシンを添加したRPMI-1640培地である島の培養培地に印刷されたコンストラクトを浸漬します。

結果

膵組織の脱細胞化
pdECMバイオインクを調製し、3Dバイオプリント組織構築物における膵島の機能を高めるための膵臓組織特異的微小環境を提供するプロセスを開発した(図2A)。脱細胞化プロセスの後、dsDNAの97.3%を除去し、コラーゲンおよびGAGなどの代表的なECM成分は、それぞれ天然の膵臓組織と比較して1278.1%および96.9...

ディスカッション

このプロトコルは、pdECMバイオインクの開発と3D細胞印刷技術を用いた3D膵臓組織構築物の製造について説明した。3D工学組織構築物中の標的組織の微小環境を再現するには、バイオインクの選択が重要である。以前の研究では、組織特異的dECMバイオインクが幹細胞分化および増殖¹⁰を促進するのに有益であることを検証した。合成ポリマーと比較して、dECMは、組織特異的な?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Biological Safety Cabinets	CRYSTE	PURICUBE 1200
Deep Freezer	Thermo Scientific Forma	957
Digital orbital shaker	DAIHAN Scientific	DH.WSO04010
Dry oven	DAIHAN Scientific	WON-155
Freeze dryer	LABCONCO	7670540
Fridge	SANSUNG	CRFD-1141
Grater	ABM	1415605793
Inverted Microscopes	Leica	DMi1
Microcentrifuge	CRYSTE	PURISPIN 17R
Microplate reader	Thermo Fisher Scientific	Multiskan GO
Mini centrifuge	DAIHAN Scientific	CF-5
Multi-Hotplate Stirrers	DAIHAN Scientific	SMHS-6
Nanodrop	Thermo Fisher Scientific	ND-LITE-PR
pH benchtop meter	Thermo Fisher Scientific	STARA2110
Rheometer	TA Instrument	Discovery HR-2
Vortex Mixer	DAIHAN Scientific	VM-10
Cirurgical Instruments
Operating Scissors	Hirose	HC.13-122
Forcep	Korea Ace Scientific	HC.203-30
Materials
1.7 mL microcentrifuge tube	Axygen	MCT-175-C
10 ml glass vial	Scilab	SL.VI1243
40 µm cell strainer	Falcon	352340
5 L beaker	Dong Sung Science	SDS 2400
50 mL cornical tube	Falcon	352070
500 mL beaker	Korea Ace Scientific	KA.23-08
500 mL bottle-top vacuum filter	Corning	431118
500 mL plastic container	LOCK&LOCK	INL301
96well plate	Falcon	353072
Aluminum foil	DAEKYO
Kimwipe	Kimtech
Magnetic bar	Korea Ace Scientific	BA.37110-0003
Mortar and pestle	DAIHAN Scientific	SC.MG100
Multi-channel pipettor	Eppendorf	4982000314
Petri Dish	SPL	10100
pH indicator strips	Sigma-Aldrich	1095350001
Sieve filter mesh	DAIHAN Scientific
Decellularization
10x pbs	Hyclone	SH30258.01
4.7% Peracetic acid	Omegafarm
70% ethanol	SAMCHUN CHEMICALS	E0220 SAM
Distilled water
IPA	SAMCHUN CHEMICALS	samchun I0348
Triton-X 100	Biosesang	T1020
Biochemical assay
1,9-Dimethyl-Methylene Blue zinc chloride double salt	Sigma-Aldrich	341088
10 N NaOH	Biosesang	S2018
Chloramine T	Sigma-Aldrich	857319
Chondroitin sulfate A	Sigma-Aldrich	C4384
Citric acid	Supelco	46933
Cysteine-HCl	Sigma-Aldrich	C1276
Glacial acetic acid	Merok	100063
Glycine	Sigma-Aldrich	410225
HCl	Sigma-Aldrich	H1758
Na2-EDTA	Sigma-Aldrich	E5134
NaCl	SAMCHUN CHEMICALS	S2097
Papain	Sigma-Aldrich	p4762
P-DAB	Sigma-Aldrich	D2004
Perchloric acid	Sigma-Aldrich	311421
Sodium acetate	Sigma-Aldrich	S5636
Sodium hydroxide	Supelco	SX0607N
Sodium phosphate(monobasic)	Sigma-Aldrich	RDD007
Toluene	Sigma-Aldrich	244511
Bioink
Charicterized FBS	Hyclone	SH30084.03
Penicillin-Streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140122
Pepsin	Sigma-Aldrich	P7215
Rose bengal	Sigma-Aldrich	198250
RPMI-1640 medium	Thermo Fisher Scientific	11875093
Trypan Blue solution	Sigma-Aldrich	T8154