Bioink de matriz extracelular derivada del tejido pancreático para imprimir construcciones de tejido pancreático laden de células 3D

Resumen

La matriz extracelular descelularizada (dECM) puede proporcionar señales microambientales adecuadas para recapitular las funciones inherentes de los tejidos diana en una construcción diseñada. Este artículo aclara los protocolos para la descelularización del tejido pancreático, la evaluación del bioink dECM derivado del tejido pancreático y la generación de construcciones de tejido pancreático 3D utilizando una técnica de bioimpresión.

Resumen

El trasplante de islotes pancreáticos es un tratamiento prometedor para los pacientes que sufren de diabetes tipo 1 acompañado de hipoglucemia y complicaciones secundarias. Sin embargo, el trasplante de islotes todavía tiene varias limitaciones, como la baja viabilidad de los islotes trasplantados debido a la falta de injerto de islotes y entornos hostiles. Además, las células productoras de insulina diferenciadas de las células madre pluripotentes humanas tienen una capacidad limitada para secretar suficientes hormonas que pueden regular el nivel de glucosa en sangre; por lo tanto, se requiere encarecidamente mejorar la maduración mediante el cultivo de células con señales microambientales adecuadas. En este artículo, esclarecemos los protocolos para preparar un biocontenido de matriz extracelular descelularizada derivada del tejido pancreático (pdECM) para proporcionar un microambiente beneficioso que puede aumentar la sensibilidad a la glucosa de los islotes pancreáticos, seguido de describir los procesos para generar construcciones de tejido pancreático 3D utilizando una técnica de bioimpresión basada en microextrusión.

Introducción

Recientemente, el trasplante de islotes pancreáticos se ha considerado un tratamiento prometedor para pacientes con diabetes tipo 1. La relativa seguridad y mínima invasividad del procedimiento son grandes ventajas de este tratamiento¹. Sin embargo, tiene varias limitaciones como la baja tasa de éxito de islotes de aislación y los efectos secundarios de los fármacos inmunosupresores. Además, el número de islotes injertados disminuye constantemente después del trasplante debido al ambiente hostil^2. Se han aplicado varios materiales biocompatibles como alginato, colágeno, ácido poli(láctico-coglicólico) (PLGA) o polietilenglicol (PEG) al trasplante de islotes pancreáticos para superar estas dificultades.

La tecnología de impresión de células 3D está surgiendo en la ingeniería de tejidos debido a su gran potencial y alto rendimiento. No hace falta decir que los bioinks son conocidos como componentes importantes para proporcionar un microambiente adecuado y permitir la mejora de los procesos celulares en construcciones de tejido impreso. Un número sustancial de hidrogeles adelgazamiento de cizallamiento como la fibrina, el alginato y el colágeno se utilizan ampliamente como biotintas. Sin embargo, estos materiales muestran una falta de complejidad estructural, química, biológica y mecánica en comparación con la matriz extracelular (ECM) en el tejido nativo³. Las señales microambientales, como las interacciones entre los islotes y la ECM, son señales importantes para mejorar la función de los islotes. ECM descelularizado (dECM) puede recrear la composición específica del tejido de varios componentes de ECM, incluyendo colágeno, glicosaminoglicanos (GAGs), y glicoproteínas. Por ejemplo, los islotes primarios que conservan sus ECM periféricos (por ejemplo, colágeno, laminina y fibronectina de tipo I, III, IV, V y VI) presentan una baja apoptosis y una mejor sensibilidad a la insulina, lo que indica que las interacciones entre las células y matrices específicas del tejido son importantes para mejorar su capacidad de funcionar de manera similar al tejido original^4.

En este artículo, aclaramos protocolos para preparar biotinta de matriz extracelular descelularizada derivada del tejido pancreático (pdECM) para proporcionar señales microambientales beneficiosas para aumentar la actividad y las funciones de los islotes pancreáticos, seguidos de los procesos para generar construcciones de tejido pancreático 3D utilizando una técnica de bioimpresión basada en microextrusión(Figura 1).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocolo

Se recogieron tejidos pancreáticos porcinos de un matadero local. Los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) del Asan Medical Center, Seúl, Corea.

1. Descelularización de tejidos

1. Preparar las soluciones para la descelularización.
   NOTA: 1 solución salina con fosfato (PBS) utilizada en todas las preparaciones de la solución se diluye añadiendo agua destilada a 10x PBS.
   1. Para la solución 1% Triton-X 100, disolver 100 ml de solución 100% Triton-X 100 en 900 ml de 1x PBS utilizando una barra de agitación magnética con la agitación a 150 rpm para 6 h. Hacer 400 mL de solución 1% Tritón-X 100 con 40 ml de 10% Triton-X 100 solución y 360 mL de solución PBS preparado justo antes de su uso.
      NOTA: La solución 10% Triton-X 100 se puede almacenar a temperatura ambiente hasta que sea necesario.
   2. Para la solución de ácido peracético al 0,1%, diluir 8,5 ml de ácido peracético al 4,7% en 22,8 ml de etanol al 70% con 368,7 ml de agua destilada justo antes de su uso.
2. Retire los tejidos periféricos del páncreas y corte el tejido antes de la descelularización.
   1. Lave el páncreas porcino resecado con agua corriente del grifo y retire los tejidos periféricos con tijeras esterilizadas.
   2. Transfiera el páncreas en una bolsa de plástico con fórceps y congele a -80 oC durante 1 h para ayudar a cortar el páncreas de manera efectiva para el siguiente paso.
   3. Corta el páncreas congelado en trozos de 1 mm de espesor usando un rallador.
   4. Transfiera 50 g de tejido cortado en un recipiente de plástico de 500 ml.
      NOTA: Aquí se recomienda un recipiente de plástico con tapa para proteger los tejidos de la contaminación y evitar la evaporación de la solución.
3. Tratamiento con reactivos.
   NOTA: Todo el proceso de descelularización debe llevarse a cabo a 4oC en un agitador orbital digital a 150 rpm. En todos los pasos de descelularización, se requiere desprendimiento físico con fórceps para evitar que las rodajas de páncreas se peguen. Lavar el recipiente con agua destilada es necesario para eliminar completamente los reactivos residuales en el recipiente.
   1. Antes de cualquier tratamiento con reactivos, lave 50 g de páncreas en rodajas con 300 ml de agua destilada con una coctelera.
   2. Revuelva el tejido continuamente a 150 rpm hasta que el agua turbia desaparezca (después de aproximadamente 12 h). Sustituya el agua destilada cada 2 h.
      NOTA: Se recomienda cambiar el agua destilada cada hora para la eficiencia de eliminar el agua turbia más rápidamente.
   3. Deseche el agua y trate los 50 g de tejidos con 400 ml de 1% de Triton-X 100 en 1solución PBS durante 84 h. Refresque la solución cada 12 h.
      NOTA: En este punto, la cantidad de tejido disminuirá porque los componentes celulares comienzan a ser eliminados.
   4. Tratar con 400 ml de isopropanol (IPA) durante 2 h para eliminar la grasa restante del páncreas.
      NOTA: Es normal que el tejido se vuelva resistente debido a la eliminación de grasa en este proceso.
   5. Después de 2 h, retire el IPA y lave el tejido con 400 ml de 1pbS durante 24 h. Actualice el 1o PBS cada 12 h.
   6. Para esterilizar el tejido descelularizado, deseche la solución previa y trate con 400 ml de ácido peracético al 0,1% en etanol al 4% durante 2 h.
   7. Para eliminar el detergente residual, lave el tejido con 400 ml de 1pbS durante 6 h. Refresque la solución cada 2 h.
   8. Recoger los tejidos descelularizados en un tubo cónico de 50 ml con fórceps.
   9. Congele la muestra a -80 oC durante 1 h. Cubra el tubo cónico con una toallita sin pelusas en lugar de la tapa y fije con una banda de goma para una liofilización eficiente.
   10. Liofilizar el tejido descelularizado a -50 oC durante 4 d.
       NOTA: Para el paso 1.3, 1 g de tejido no descelularizado también debe congelarse en las mismas condiciones.

2. Evaluación de tejidos descelularizados

NOTA: Para evaluar la cantidad residual de ADND, los glicosaminoglicanos (GAG) y el colágeno en el tejido descelularizado en comparación con el tejido nativo, se requieren al menos 1 g de cada uno de los tejidos no descelularizados (tejido nativo) y descelularizados para un lote de evaluación. La cantidad de ADND, GAGs y colágeno se puede calcular en función del peso seco del tejido.

1. Preparar soluciones para ensayos bioquímicos.
   1. Preparar la solución de papaína para la digestión de la muestra.
      NOTA: La cantidad de búfer a realizar se puede ajustar de acuerdo con el número de muestras.
      1. Disolver 119 mg de 0,1 M de fosfato sódico (monobásico), 18,6 mg de 0,5 mM de Na2-EDTA y 8,8 mg de 5 mM de cisteína-HCl en 10 ml de agua autoclaveda.
      2. Ajuste el pH de la solución a 6,5 añadiendo una solución NaOH de 10 M.
      3. Añadir 125 ml de solución de calina de 10 mg/ml a la solución y vórtice anteriores, permitiendo que cada elemento se mezcle uniformemente.
   2. Preparar soluciones para el ensayo de dimetil-metileno azul (DMMB).
      1. Para hacer el tinte DMMB, disolver 8 mg de 1,9-dimetil-metileno de cloruro de zinc azul de cloruro de zinc doble sal, 1,52 g de glicina, y 1.185 g de NaCl en 500 mL de agua autoclaved. Ajuste el pH a 3 añadiendo una solución de HCl de 0,5 M mientras mide el cambio de pH utilizando un medidor de pH de sobremesa. A continuación, filtre esto a través de un filtro de vacío de 500 ml.
      2. Hacer 15 l de 10 mg/ml de sulfato de condroitina Una solución estándar.
   3. Preparar soluciones para el ensayo de hidroxiprolina.
      1. Para la solución de trabajo con cloramina, disolver 2,4 g de acetato de sodio, 1 g de ácido cítrico y 0,68 g de hidróxido de sodio en 24 ml de agua destilada y añadir 240 ml de ácido acético glacial, 10 ml de tolueno y 6 ml de IPA.
         NOTA: Disuelva todos los polvos en solución con un mezclador de vórtice. La solución de trabajo con cloramina se puede almacenar a 4 oC durante un máximo de tres meses.
      2. Para la solución de cloramina T, disolver 0,35 g de cloramina T en 20 ml de solución de trabajo de cloramina y añadir 2,5 ml de IPA. Vórtice para mezclar todos los componentes.
         NOTA: Prepárese inmediatamente antes de usar.
      3. Para la solución P-DAB, poner 3,75 g de P-DAB en 6,5 ml de ácido perclórico y 15 ml de IPA; envuélvelo en papel de aluminio.
         NOTA: Prepárese inmediatamente antes de usar.
2. Añadir 1 ml de solución de papaína a 10 mg de tejido liofilizado en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y vórtice el tubo para digerir mejor la muestra.
3. Colocar el tubo de microcentrífuga de 1,5 ml en un bastidor de goma y digerir las muestras en un vaso de precipitados de 500 ml que contenga 300 ml de agua a 60 oC durante 16 h.
4. Centrifugar a 9.500 x g durante 20 minutos, recoger el sobrenadante y transferirlo a un tubo nuevo.
5. Cuantificar el ADN residual y las proteínas principales en el tejido descelularizado.
   1. Cargue 1 l de muestra digerida en el espectrómetro y mida la cantidad de ADN DS de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
      NOTA: El experimentador debe atar su cabello hacia atrás y usar una máscara para evitar contaminar la muestra.
6. Realice un ensayo DMMB para cuantificar la cantidad de GAG que permanece en el tejido descelularizado.
   1. Mezclar 1 l de sulfato de condroitina S solución y 499 éL de 1x PBS para hacer estándares. Diluir el sulfato de condroitina Una solución con agua destilada a concentraciones de 0, 4, 8, 12, 16 y 20 g/ml.
   2. Cargue triplicados de 50 ml de cada concentración de las muestras estándar y digeridas en una placa de 96 pocillos.
   3. Añadir 200 l de tinte DMMB a cada pocal utilizando una pipeta multicanal.
   4. Lea inmediatamente la absorbancia a 525 nm en un lector de microplacas.
7. Realizar un ensayo de hidroxiprolina para cuantificar la cantidad de colágeno.
   1. Para llevar a cabo un ensayo de hidroxiprolina, incubar 250 ml de muestra digerida con volúmenes iguales de HCl a 120 oC durante 16 h.
   2. Secar los residuos a temperatura ambiente durante 3 h para enfriar las muestras y luego volver a disolver las muestras en 1 ml de 1x PBS.
   3. Centrífuga a 2.400 x g durante 10 min a 4oC.
   4. Preparar de serie una solución de hidroxiprolina de 100 g/ml.
   5. Diluir la solución de hidroxiprolina con agua destilada a una concentración de 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 15, 20, 30 g/ml para una solución estándar.
   6. Cargue triplicados de 50 ml de muestras y solución estándar en una placa de 96 pocillos.
   7. Añadir 50 l de solución de cloramina T y luego incubar durante 20 minutos a temperatura ambiente.
   8. Añadir 50 sl de solución p-DAB e incubar durante 30 min a 60 oC.
      NOTA: Aliquot en una habitación oscura. Después de la adición, envuelva la placa con papel de aluminio.
   9. Incubar a temperatura ambiente durante 30 min.
   10. Después de enfriar, mida la absorbancia a 540 nm en un lector de microplacas.

3. Preparación de Bioink

NOTA: El polvo de pdECM se puede almacenar de forma estable a -80 oC durante al menos un año. Antes del ajuste del pH, la solución de pdECM digerido se puede almacenar a -20 oC durante un mes. Antes de su uso, descongele la muestra de la solución de pdECM congelada a 4 oC durante la noche. La solución pdECM ajustada al pH se puede almacenar a 4 oC durante un máximo de una semana. La solución de pdECM digerido se puede almacenar a 4 oC durante al menos unos días, pero no debe exceder 1 semana.

1. Digerir el pdECM liofilizado con pepsina.
   1. Para una digestión eficaz de biotinta, pulverizar el pdECM liofilizado con nitrógeno líquido utilizando un mortero y un pestillo.
   2. Recoger 200 mg del polvo pdECM en el tubo cónico de 50 ml y añadir 20 mg de la pepsina y 8,4 ml del ácido acético de 0,5 M (la concentración final es de 2 p/v%).
   3. Coloque la barra de agitación magnética en el tubo cónico de 50 ml y revuelva a 300 rpm durante 96 h.
2. Ajuste el pH de la solución pdECM digerida.
   NOTA: Con el fin de evitar la gelación antes del ajuste del pH, este proceso debe llevarse a cabo sobre hielo.
   1. Filtrar las partículas no digeridas en la solución pdECM utilizando un colador de células de 40 m utilizando una pipeta de desplazamiento positivo en hielo para obtener la digestión óptima de las piezas.
   2. Agregue 1 mL del PBS 10x y el vórtice antes de usar NaOH.
   3. Ajuste el pH a 7 con 10 M NaOH comprobando el pH con tiras indicadoras de pH.
      NOTA: Vortex cada vez que se añade NaOH para que el bioink se mezcle a fondo con los otros reactivos.

4. Análisis reológico

1. Configuración experimental
   1. Preparar el 1,5% (p/v) del bioink pdECM para evaluar las propiedades reológicas.
   2. Establezca una geometría de placa de cono de 20 mm (diámetro de cono de 20 mm con un ángulo de 2o) en modo de velocidad controlada de un reómetro.
   3. Cree secuencias experimentales en el software instalado (TRIOS) para medir la viscosidad, la cinética de la gelación y el módulo dinámico del biotinta pdECM.
      1. Viscosidad: Coloque el biotinta pdECM en la placa. Mida la viscosidad compleja (Pa-s) de la biotinta pdECM bajo una tasa de cizallamiento creciente de 1 a 1.000 s^-1 a una temperatura constante de 15 oC.
      2. Cinética de gelión: Coloque el bioink pdECM en la placa. Calcule el módulo complejo (G*) midiendo el módulo de almacenamiento y pérdida de biotinta pdECM a 4-37 oC con una tasa de aumento incremental de 5 oC/min (modo de barrido de tiempo).
      3. Módulo dinámico: Coloque el biotinta pdECM en la placa a 37 oC durante 60 minutos antes de la medición. Mida el módulo de almacenamiento dependiente de la frecuencia (G') y el módulo de pérdida (G'') del biotinta pdECM en el rango de 0,1-100 rad/s a una tensión del 2%.

5. Impresión de células 3D de construcciones de tejido pancreático usando islotes

1. Preparación de islotes aislados
   1. Aísle los islotes primarios de una rata de acuerdo con los protocolos descritos en un trabajo anterior⁵.
   2. Para separar los desechos y las células muertas del islo aislado, pase la suspensión celular a través de un colador de células de 70 m. Los islotes con un diámetro inferior a 70 m se consideran muertos o anormales.
   3. Suspenda los islotes aislados en el medio RPMI-1640 y colóquelos en la placa de petri. Retire los islotes de más de 300 m de diámetro utilizando una pipeta de volumen P200 bajo el microscopio (lente objetivo 4x) en el gabinete de bioseguridad.
2. Encapsulación de isletenen biotinta pdECM
   1. Prepare el bioink pdECM ajustado al pH y el isloaislado aislado.
      NOTA: Para evitar la gelación antes del ajuste del pH, este proceso debe realizarse sobre hielo.
   2. Mezcle suavemente el biotinta pdECM y el medio suspendido con islotes (relación 3:1) utilizando una pipeta de desplazamiento positivo hasta que se mezclen uniformemente.
      NOTA: La concentración final del biotinta pdECM es del 1,5% y la densidad celular en el biotinta pdECM es de 3.000 IEQ/ml.
3. Impresión de células 3D de construcciones de tejido pancreático
   1. Prepare una jeringa esterilizada y una boquilla de 22 G.
      NOTA: Este medidor fue seleccionado para la impresión de islotes con un diámetro de 100-250 m.
   2. Cargue el bioink pdECM cargado de islos en la jeringa.
   3. Imprima el bioink con la condición de impresión optimizada (velocidad de avance: 150 mm/min; presión neumática: 15 kPa) a 18 oC en forma de celosía.
   4. Para recruzar el bioink, coloque la construcción impresa en la incubadora durante 30 min.
   5. Sumerja la construcción impresa en el medio de cultivo de islos que es un medio RPMI-1640 complementado con suero bovino fetal al 10% (FBS), penicilina de 100 U/ml y estreptomicina de 100 U/ml.

6. Impresión celular 3D de la construcción pancreática con estructura estampada

1. Preparación de dos tipos de biotinta
   1. Para validar la versatilidad de impresión utilizando múltiples biotintas, prepare dos conjuntos de biotintas pdECM y tenín los dos agregando una solución de 1,4% Trypan Blue y Rose Bengal en cada biotinta pdECM a una proporción de 1:20, respectivamente.
      NOTA: Para evitar la gelación antes del ajuste del pH, este proceso debe llevarse a cabo sobre hielo.
   2. Mezcle suavemente el biotinta pdECM y el medio suspendido con islotes (relación 3:1) utilizando una pipeta de desplazamiento positivo hasta que se mezclen uniformemente.
      NOTA: La concentración final del biotinta pdECM es del 1,5% y la densidad celular en el biotinta pdECM es de 3.000 IEQ/ml.
2. Impresión de células 3D de construcciones de tejido pancreático multimaterial
   1. Prepare jeringas esterilizadas y una boquilla de 25 G.
   2. Cargue cada biotinta (azul y rojo) en dos jeringas diferentes, respectivamente.
   3. Imprima el bioink con una condición de impresión optimizada (velocidad de avance: 150 mm/min; presión neumática: 15 kPa) a 18oC en forma de celosía con líneas alternas de azul y rojo.
   4. Para recruzar el bioink, coloque la construcción impresa en la incubadora durante 30 min.
   5. Sumerja la construcción impresa en medios de cultivo de islet que son medios RPMI-1640 complementados con suero bovino fetal 10% (FBS), penicilina de 100 U/ml y estreptomicina de 100 U/ml.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Resultados

Descelularización de los tejidos pancreáticos
Desarrollamos el proceso de preparación de biotinta pdECM para proporcionar microambientes específicos del tejido pancreático para mejorar la funcionalidad de los islotes en una construcción de tejido bioimpreso 3D(Figura 2A). Después del proceso de descelularización, se eliminó el 97,3% del ADN DSDNA y los componentes representativos de ECM, como el colágeno y los GA...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discusión

Este protocolo describió el desarrollo de biotintas pdECM y la fabricación de construcciones de tejido pancreático 3D mediante el uso de técnicas de impresión de células 3D. Para recapitular el microambiente del tejido diana en la construcción de tejido diseñado 3D, la elección de biotinta es fundamental. En un estudio anterior, validamos que las biotintas dECM específicas del tejido son beneficiosas para promover la diferenciación de células madre y la proliferación^10. En comparació...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Biological Safety Cabinets	CRYSTE	PURICUBE 1200
Deep Freezer	Thermo Scientific Forma	957
Digital orbital shaker	DAIHAN Scientific	DH.WSO04010
Dry oven	DAIHAN Scientific	WON-155
Freeze dryer	LABCONCO	7670540
Fridge	SANSUNG	CRFD-1141
Grater	ABM	1415605793
Inverted Microscopes	Leica	DMi1
Microcentrifuge	CRYSTE	PURISPIN 17R
Microplate reader	Thermo Fisher Scientific	Multiskan GO
Mini centrifuge	DAIHAN Scientific	CF-5
Multi-Hotplate Stirrers	DAIHAN Scientific	SMHS-6
Nanodrop	Thermo Fisher Scientific	ND-LITE-PR
pH benchtop meter	Thermo Fisher Scientific	STARA2110
Rheometer	TA Instrument	Discovery HR-2
Vortex Mixer	DAIHAN Scientific	VM-10
Cirurgical Instruments
Operating Scissors	Hirose	HC.13-122
Forcep	Korea Ace Scientific	HC.203-30
Materials
1.7 mL microcentrifuge tube	Axygen	MCT-175-C
10 ml glass vial	Scilab	SL.VI1243
40 µm cell strainer	Falcon	352340
5 L beaker	Dong Sung Science	SDS 2400
50 mL cornical tube	Falcon	352070
500 mL beaker	Korea Ace Scientific	KA.23-08
500 mL bottle-top vacuum filter	Corning	431118
500 mL plastic container	LOCK&LOCK	INL301
96well plate	Falcon	353072
Aluminum foil	DAEKYO
Kimwipe	Kimtech
Magnetic bar	Korea Ace Scientific	BA.37110-0003
Mortar and pestle	DAIHAN Scientific	SC.MG100
Multi-channel pipettor	Eppendorf	4982000314
Petri Dish	SPL	10100
pH indicator strips	Sigma-Aldrich	1095350001
Sieve filter mesh	DAIHAN Scientific
Decellularization
10x pbs	Hyclone	SH30258.01
4.7% Peracetic acid	Omegafarm
70% ethanol	SAMCHUN CHEMICALS	E0220 SAM
Distilled water
IPA	SAMCHUN CHEMICALS	samchun I0348
Triton-X 100	Biosesang	T1020
Biochemical assay
1,9-Dimethyl-Methylene Blue zinc chloride double salt	Sigma-Aldrich	341088
10 N NaOH	Biosesang	S2018
Chloramine T	Sigma-Aldrich	857319
Chondroitin sulfate A	Sigma-Aldrich	C4384
Citric acid	Supelco	46933
Cysteine-HCl	Sigma-Aldrich	C1276
Glacial acetic acid	Merok	100063
Glycine	Sigma-Aldrich	410225
HCl	Sigma-Aldrich	H1758
Na2-EDTA	Sigma-Aldrich	E5134
NaCl	SAMCHUN CHEMICALS	S2097
Papain	Sigma-Aldrich	p4762
P-DAB	Sigma-Aldrich	D2004
Perchloric acid	Sigma-Aldrich	311421
Sodium acetate	Sigma-Aldrich	S5636
Sodium hydroxide	Supelco	SX0607N
Sodium phosphate(monobasic)	Sigma-Aldrich	RDD007
Toluene	Sigma-Aldrich	244511
Bioink
Charicterized FBS	Hyclone	SH30084.03
Penicillin-Streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140122
Pepsin	Sigma-Aldrich	P7215
Rose bengal	Sigma-Aldrich	198250
RPMI-1640 medium	Thermo Fisher Scientific	11875093
Trypan Blue solution	Sigma-Aldrich	T8154