رصد PD-1-حظر الأجسام المضادة ملزمة الخلايا التائية المستمدة من قطرة من الدم المحيطي

Summary

لقد طورنا فحصًا بسيطًا للتدفق الخلوي لتقييم ربط الأجسام المضادة لحجب PD-1 بالخلايا التائية ، مما يتطلب فقط قطرة من الدم المحيطي من مرضى السرطان.

Abstract

مثبطات نقطة التفتيش المناعية، بما في ذلك PD-1-حجب الأجسام المضادة، قد تحسنت بشكل كبير نتائج العلاج في أنواع مختلفة من السرطان. الفعالية الدوائية لهذه العلاجات المناعية طويلة الأمد ، وتمتد حتى إلى ما بعد توقف حقنها ، بسبب تركيزات الدم المستمرة. هنا قمنا بتطوير اختبار التدفق الخلوي البسيط لتقييم حالة ربط الخلية T للأجسام المضادة PD-1-حظر nivolumab وpembrolizumab. مثل اختبار الجلوكوز، يتطلب هذا الفحص قطرة واحدة فقط من الدم المحيطي. تصور الأجسام المضادة ملزمة على الخلايا التائية هو أكثر موثوقية من قياس تركيزات الدم الأجسام المضادة. بالإضافة إلى ذلك ، إذا لزم الأمر ، يمكننا تحليل العديد من العلامات المميزة المتعلقة بالمناعة على الخلايا التائية المرتبطة بالأجسام المضادة لحجب PD-1. وبالتالي ، هذه هي استراتيجية بسيطة وطفيفة التوغل لتحليل التأثير الدوائي للأجسام المضادة لمنع PD-1 في مرضى السرطان.

Introduction

PD-1-حظر الأجسام المضادة أصبحت الخيار القياسي لعلاج أنواع مختلفة من السرطان، بما في ذلك سرطان الرئة الخلايا غير الصغيرة (NSCLC)^1،2،3،4. أنها تظهر تأثير علاجي ملحوظ في مجموعة فرعية من مرضى السرطان الذين لم يستجيبوا للعلاج الكيميائي السامة للخلايا التقليدية. ومع ذلك ، يمكن أن تسبب مثبطات نقاط التفتيش المناعية (ICIs) ، والتي تشمل PD-1 - الأجسام المضادة المانعة ، طيفًا فريدًا ومتميزًا من الأحداث الضائرة ، التي يطلق عليها الأحداث الضائرة المرتبطة بالمناعة (irAEs)⁵. على الرغم من أن irAEs يمكن أن تؤثر على جميع الأنسجة تقريبًا ، إلا أنها لوحظت بشكل شائع في الجهاز الهضمي والغدد الصماء والجلد والكبد ، ويمكن أن تسبب الطفح الجلدي والغثيان والإسهال واضطرابات الغدة الدرقية^6،7. بشكل عام ، تظهر معظم irAEs في غضون شهر إلى شهرين بعد بدء ICIs. ومع ذلك ، في بعض الحالات ، يمكن أن تحدث بعد عام واحد من بداية العلاج أو حتى بعد توقف العلاج^6،7. كما أنها تسبب أعراضًا مختلفة قد يكون من الصعب التمييز بينها والأمراض الأخرى. وبالتالي، يمكن أن يكون من الصعب تشخيص irAEs على وجه السرعة ومعالجتها بشكل مناسب. يمكن أن تؤثر الـ irAEs على جميع الأنسجة ، ويتأثر ظهورها بشدة بالخلايا المناعية المتداولة ، وخاصة الخلايا التائية المرتبطة بالأجسام المضادة المانعة PD-1. لذلك ، من المهم في البيئات السريرية وجود طريقة مباشرة وطفيفة التوغل لمراقبة الخلايا التائية المستهدفة بالأجسام المضادة.

هنا ، قمنا بتطوير طريقة بسيطة لتقييم ربط PD-1 -حظر الأجسام المضادة للخلايا التائية باستخدام قطرة من الدم كله المحيطي من مرضى السرطان الذين تلقوا nivolumab أو pembrolizumab. باستخدام هذا النهج، تمكنا من رصد كل من التالي: 1) مدة الأجسام المضادة ملزمة للخلايا التائية، 2) شغل جزيئات الخلايا التائية PD-1 بواسطة الأجسام المضادة العلاجية، و 3) حالة التنشيط والميزات المناعية للخلايا التائية. هذا الأسلوب هو تعديل تقنية تم الإبلاغ عنها مسبقاً⁸. كمية الدم المطلوبة هي تقريبا نفس اللازمة لاختبار الجلوكوز، والنهج لا يتطلب إثراء الخلايا أحادية النواة أو المشاركة في الاستزراع مع PD-1-حجب الأجسام المضادة. أكدنا أن هذه الطريقة يمكن أيضا أن يتم باستخدام عينات مجمدة، بما في ذلك خلايا الدم الطرفية أحادية النواة (PBMCs) وخلايا من الانصباب الجنبي، والانصباب التاموي، وسائل اللاعال القصبي، والسائل النخاعي، مما يشير إلى أن هذه الاستراتيجية قد تكون مفيدة في سياق دراسة متعددة المراكز. قد تسهل هذه الطريقة التشخيص المبكر للـ irAEs ، وتساعد أيضًا على تحديد العلاجات المثبطة للمناعة المناسبة للسيطرة على أعراضها وتحديد الأوقات المثلى لبدء العلاجات اللاحقة بعد مثبطات PD-1.

Protocol

تم إجراء أخذ العينات أثناء الإجراءات السريرية الروتينية. وتم الحصول على جميع العينات البشرية بعد أن قدم الأشخاص الموافقة المستنيرة، وفقا لإعلان هلسنكي وبموافقة مجلس المراجعة الأخلاقية لكلية الطب العليا، جامعة أوساكا، اليابان (15383 و 752).

1. إعداد عينة الدم كله وتلطيخ

1. جمع عينات الدم الكامل في أنابيب جمع الدم التي تحتوي على حمض رباعي الخليك الإيثيلين ديامين (EDTA).
   ملاحظة: يمكن إجراء جمع الدم إما باستخدام إبرة عادية أو رمح الدم.
2. نقل 20 ميكرولتر من عينات الدم الكامل إلى 5 مل من أنابيب تدفق البوليسترين الدائرية القاع.
   ملاحظة: للحد من الربط غير محددة من الخلايا إلى أنابيب، 1 مل من 2٪ مصل الأبقار الجنين (FBS) في الفوسفات المالحة العازلة (PBS) يضاف إلى الأنابيب ودوامة لمدة 10 ثانية قبل تطبيق على العينات.
3. إضافة 20 ميكرولتر من 2٪ FBS في برنامج تلفزيوني.
4. أضف 10 ميكرولتر من كاشف حظر FcR الخاص بالإنسان. مزيج جيد واحتضان لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
5. إضافة 500 ميكرولتر من العازلة تحليل خلايا الدم الحمراء. مزيج جيد واحتضان لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
6. أضف 4 مل من 2٪ FBS في PBS وتدور أسفل الخلايا في 400 × ز (1500 دورة في الدقيقة) لمدة 5 دقيقة عند 4 درجة مئوية. إزالة supernatant من قبل الطموح.
7. كرر عملية الغسيل والتطلع الموصوفة في الخطوة 1.6.
8. إعادة تعليق الخلايا في 100 ميكرولتر من 2٪ FBS في PBS وتقسيمها إلى أنبوبين من 50 ميكرولتر لكل منهما.
9. إضافة الأجسام المضادة علامة السطح(الجدول 1). مزيج جيد واحتضان لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
   ملاحظة: عند تنميط الحالة المناعية للخلية التّية، يمكن زيادة عدد العلامات بناءً على جودة آلة قياس التدفق الخلوي.
10. غسل العينات 2x كما هو موضح في الخطوة 1.6.
11. إعادة تعليق الخلايا في 200 ميكرولتر من 2٪ FBS في برنامج تلفزيوني.

2. تدفق التحليل الخلوي

1. إدراج أنابيب في تدفق الخلايا والحصول على الخلايا، وأساسا بعد البروتوكول الموصى به^9.
2. سجل 10،000 الأحداث باعتبارها بوابة الخلايا الليمفاوية(الشكل 1A)وبيانات تدفق التصدير وملفات .fcs للتحليل.
3. فتح الملفات في برنامج التحليل. تصور الخلايا على مبعثر إلى الأمام (FSC) (A) مقابل مبعثر الجانب (SSC) (A) مؤامرة والخلايا الليمفاوية بوابة(الشكل 1A).
4. بعد اختيار خلايا واحدة باستخدام FSC (H) مقابل FSC (W) و SSC (H) مقابل SSC (W)(الشكل 1B)وعرضها على CD3 مقابل CD8 أو CD3 مقابل مؤامرة CD4 ، بوابة خلايا CD8 T وخلايا CD4 T ، على التوالي(الشكل 1C).
5. بعد اختيار الخلايا المسورة وعرضها على PD-1 مقابل مؤامرة IgG4 الإنسان، حدد PD-1-حظر الأجسام المضادة ملزمة CD8 وCD4 T الخلايا على أساس التحكم isotype(الشكل 1D).

النتائج

يمكن لاستراتيجية الجاتينغ وتحليل قياس الخلايا المتدفق(الشكل 1)الكشف عن الأجسام المضادة المانعة PD-1 الملزمة للخلايا التائية التي تم الحصول عليها من قطرة من الدم المحيطي المريض NSCLC. قبل أن يتم إعطاء PD-1-حظر الأجسام المضادة، لا توجد خلايا CD8 أو CD4 T بشرية IGG4 إيجابية، ويمكن تأكيد ?...

Discussion

في هذه المقالة ، نبلغ عن طريقة تستخدم مقياس التدفق الخلوي للكشف عن الأجسام المضادة PD-1 - حظر مرتبطة بالخلايا التائية المشتقة من قطرة من الدم المحيطي ، والتي طورناها في الأصل للكشف عن nivolumab¹⁰. على الرغم من أن هذه التقنية بسيطة جدا وسهلة الأداء، ينبغي ملاحظة نقطتين مهمتين من أجل ال...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10X RBC Lysis Buffer (Multi-species)	Thermo Fisher Scientific	00-4300-54	50 mL
APC/Cyanine7 anti-human CD4 Antibody	BioLegend	300518	Clone RPA-T4
BD FACS Canto II Flow Cytometer	BD
Brilliant Violet 510 anti-human CD8a Antibody	BioLegend	301048	Clone RPA-T8
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	nacalai tesque	14249-95	500 mL
Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes	STEMCELL Technologies	352058	5 mL
FcR Blocking Reagent, human	Miltenyi Biotec	130-059-901	2 mL
FLOWJO	BD
Gibco Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher Scientific	12676029	500 mL
Mouse IgG1 monoclonal - Isotype control	abcam	ab81200
Mouse monoclonal Anti-Human IgG4 Fc	abcam	ab99825	Clone HP6025
Pacific Blue Mouse Anti-Human CD3	BD	558117	Clone UCHT1
PE-Cy7 Mouse anti-Human CD279 (PD-1)	BD	561272	Clone EH12.1
PE-Cy7 Mouse IgG1 κ Isotype Control	BD	557646