监测PD-1-阻断抗体绑定到T细胞派生从外周血滴

摘要

我们开发了一个简单的流式细胞测定法，用于评估PD-1阻滞抗体与T细胞的结合，只需要癌症患者的一滴外周血。

摘要

免疫检查点抑制剂，包括PD-1-阻断抗体，显著改善了各类癌症的治疗效果。这些免疫疗法的药理疗效是长期的，甚至延伸到停止注射，由于持续的血液浓度。在这里，我们开发了一个简单的流式细胞测定法，以评估PD-1-阻断抗体nivolumab和pembrolizumab的T细胞结合状态。与葡萄糖测试一样，这种检测只需要一滴外周血。可视化抗体结合T细胞比测量抗体血液浓度更可靠。此外，如有必要，我们可以分析与PD-1-阻断抗体结合的T细胞上的许多独特的免疫相关标记。因此，这是一种简单和微创的策略，用于分析PD-1-阻断抗体在癌症患者中的药理作用。

引言

PD-1+阻断抗体已成为治疗各种癌症的标准选择，包括非小细胞肺癌（NSCLC）1、2、3、4。在一部分没有对常规细胞毒性化疗有反应的癌症患者中，它们显示出显著的治疗效果。然而，免疫检查点抑制剂（ICI），包括PD-1-阻断抗体，可以引起独特和不同的不良事件，称为免疫相关不良事件（irAEs）5。虽然irAEs可以影响几乎所有的组织，它们最常观察到在胃肠道，内分泌腺，皮肤和肝脏，他们可能导致瘙痒，皮疹，恶心，腹泻和甲状腺疾病^6，7。一般来说，大多数 IrAEs 在 ICIs 启动后的 1 到 2 个月内出现。然而，在某些情况下，它们可能发生在开始治疗后1年，甚至在治疗停止^6，7之后。它们也会导致各种症状，可能难以区别于其他疾病。因此，要及时诊断irAEs并对其进行适当治疗可能具有挑战性。irAE 可以影响所有组织，其发病受到循环免疫细胞的强烈影响，尤其是与 PD-1 和阻断抗体结合的 T 细胞。因此，在临床环境中，一种简单和微创的方法来监测抗体靶向T细胞非常重要。

在这里，我们开发了一个简单的方法，用接受尼沃卢巴或皮布吕祖马的癌症患者的一滴外周全血来评估PD-1-阻断抗体与T细胞的结合。使用这种方法，我们能够监测以下各项:1）抗体与T细胞结合的持续时间，2）治疗抗体占用T细胞PD-1分子，3）T细胞的活化状态和免疫特征。此方法是对以前报告的技术⁸的修改。所需的血液量与葡萄糖测试所需的血液量几乎相同，该方法不需要单核细胞富集或与PD-1-阻断抗体共同培养。我们确认这种方法也可以使用冷冻样品进行，包括外周血单核细胞（PBMC）和来自胸腔输液、心包液、支气管输液和脑脊液的细胞，这表明这种策略在多中心研究的背景下可能有用。这种方法可能有助于irAE的早期诊断，也有助于确定适当的免疫抑制治疗，以控制其症状，并确定在PD-1抑制剂后启动后续治疗的最佳时间。

研究方案

采样是在常规临床过程中进行的。根据《赫尔辛基宣言》，并经日本大阪大学医学院伦理审查委员会批准（15383和752），所有人类样本都是在知情同意后取得的。

1. 全血样制备和染色

1. 将全血样本收集到含有乙烯二胺四乙酸（EDTA）的血液收集管中。
   注:血收集可以使用常规针头或血柳刀进行。
2. 将20μL全血样品转移到5mL圆底聚苯乙烯流细胞测定管。
   注:为了减少细胞与管的非特异性结合，在将磷酸盐缓冲盐水（PBS）中的1 mL 2%胎儿牛血清（FBS）加入管中，在样品应用前涡旋10小时。
3. 在 PBS 中加入 20 μL 的 2% FBS。
4. 加入10μL的人特异性FcR阻断试剂。混合良好，在室温下孵育15分钟。
5. 加入500μL红细胞分瓶缓冲液。混合良好，在室温下孵育10分钟。
6. 在PBS中加入4 mL 2%FBS，在4°C下以400 x g（1，500 rpm）旋转细胞5分钟。通过吸入去除上清液。
7. 重复步骤 1.6 中描述的洗涤和吸入过程。
8. 在PBS中重新悬浮在100μL的2%FBS中的细胞，并分成两个管，每个50μL。
9. 添加表面标记抗体 （表 1）.混合良好，在黑暗中室温下孵育20分钟。
   注:在分析T细胞免疫状态时，可以根据流式细胞测量机的质量增加标记的数量。
10. 如步骤 1.6 所述，将样品洗涤 2 倍。
11. 在PBS中重新悬浮200μL的2%FBS中的细胞。

2. 流量细胞学分析

1. 将管插入流式细胞仪并获取细胞，基本上遵循建议的协议^9。
2. 将 10，000 个事件记录为淋巴细胞门（图 1A），并将导出流数据记录为 .fcs 文件进行分析。
3. 在分析软件中打开文件。在正向散射 （FSC） （A） 与侧散射 （SSC） （A） 绘图和门淋巴细胞（图 1A） 上可视化细胞。
4. 使用 FSC （H） vs. FSC （W） 和 SSC （H） vs. SSC （W） （图 1B） 选择单个单元并将其显示在 CD3 与 CD8 或 CD3 与 CD4 图后，分别将 CD8 T 单元和 CD4 T 单元（图 1C） 显示。
5. 选择封闭细胞并将其显示在PD-1与人类IgG4图上后，根据等型对照识别PD-1+阻断抗体结合CD8和CD4 T细胞（图1D）。

结果

门控策略和流式细胞测定分析 （图 1） 可以检测从一滴 NSCLC 患者外周血获得的 PD-1 阻滞抗体结合到 T 细胞。在施用PD-1-阻断抗体之前，不存在人类IgG4阳性CD8或CD4 T细胞，PD-1表达可以通过PD-1+检测抗体（EH12.1）（图2A）确认。在尼沃卢马布或pembrolizumab分用后，IgG4（尼沃卢马布，pembrolizumab）可以通过抗IgG4抗体（HP6025）在T细胞上检测到，而PD-...

讨论

在本文中，我们报道了一种使用流动细胞计检测PD-1-阻断抗体的方法，抗体与从一滴外周血衍生的T细胞结合，我们最初开发用于nivolumab检测^10。虽然此技术非常简单且易于执行，但为了获得准确的结果，应注意两个要点。其一是检测PD-1分子，应使用与尼沃卢马布和皮布吕祖马布竞争的适当抗体。这个问题在先前的研究¹¹中进行了评估。另一种是，在表面染色之?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
10X RBC Lysis Buffer (Multi-species)	Thermo Fisher Scientific	00-4300-54	50 mL
APC/Cyanine7 anti-human CD4 Antibody	BioLegend	300518	Clone RPA-T4
BD FACS Canto II Flow Cytometer	BD
Brilliant Violet 510 anti-human CD8a Antibody	BioLegend	301048	Clone RPA-T8
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	nacalai tesque	14249-95	500 mL
Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes	STEMCELL Technologies	352058	5 mL
FcR Blocking Reagent, human	Miltenyi Biotec	130-059-901	2 mL
FLOWJO	BD
Gibco Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher Scientific	12676029	500 mL
Mouse IgG1 monoclonal - Isotype control	abcam	ab81200
Mouse monoclonal Anti-Human IgG4 Fc	abcam	ab99825	Clone HP6025
Pacific Blue Mouse Anti-Human CD3	BD	558117	Clone UCHT1
PE-Cy7 Mouse anti-Human CD279 (PD-1)	BD	561272	Clone EH12.1
PE-Cy7 Mouse IgG1 κ Isotype Control	BD	557646