ניטור PD-1-חסימת נוגדנים המאוגדים לתאי T נגזר טיפת דם היקפי

Summary

פיתחנו זרימה פשוטה cy, לנסות הערכה להערכת האיגוד של PD-1-חסימת נוגדנים לתאי T, המחייב רק טיפה של דם היקפי מחולי סרטן.

Abstract

מעכבי המחסום החיסונית, כולל PD-1 – חסימת נוגדנים, יש שיפור משמעותי בתוצאות הטיפול בסוגים שונים של סרטן. היעילות הפרמקולוגית של טיפולים אלה מתמשך לאורך זמן, הרחבת אפילו מעבר הפסקת הזריקות שלהם, בשל ריכוזי דם מתמשך. כאן פיתחנו מערכת פשוטה cy, מנסה להעריך את הסטטוס של כריכת התא T של PD-1 – חסימת נוגדנים nivolumab ו-פרומוליזואב. כמו בדיקת גלוקוז, הצורך הזה דורש רק טיפה אחת של דם היקפי. ויזואליזציה כריכת נוגדנים על תאי T הוא אמין יותר מאשר מדידת ריכוזי דם נוגדנים. בנוסף, במידת הצורך, אנו יכולים לנתח סמנים ייחודיים הקשורים החיסונית בתאי T מאוגד PD-1 – חסימת נוגדנים. Thus, זוהי אסטרטגיה פשוטה ופולשנית כדי לנתח את ההשפעה הפרמקולוגית של PD-1 – חסימת נוגדנים בחולי סרטן.

Introduction

PD-1 – חסימת נוגדנים הפכו את הבחירה הסטנדרטית לטיפול בסוגים שונים של סרטן, כולל סרטן ריאות תא קטן (nsclc)^1,2,3,4. הם מראים השפעה טיפולית יוצאת דופן בקבוצת משנה של חולי סרטן אשר לא הגיבו כימותרפיות קונבנציונאלי ציטוטוקסיים. עם זאת, מעכבי המחסום החיסונית (ICIs), הכוללים PD-1 – חסימת נוגדנים, יכול לגרום לספקטרום ייחודי וברור של אירועים לוואי, כינה החיסונית הקשורות אירועים לוואי (irAEs)⁵. למרות iraes יכול להשפיע על כמעט כל הרקמות, הם נצפו בדרך כלל במערכת העיכול, בלוטות אנדוקריניות, העור, והכבד, והם יכולים לגרום הפרודדוקטוס, פריחה, בחילות, שלשול, והפרעות בלוטת התריס^6,7. באופן כללי, רוב irAEs מופיעים בתוך 1 עד 2 חודשים לאחר החניכה של ICIs. עם זאת, במקרים מסוימים, הם יכולים להתרחש מאוחר יותר מ 1 שנה לאחר תחילת הטיפול או אפילו לאחר הפסקת הטיפול^6,7. הם גם לגרום לתסמינים שונים שעשויים להיות קשה להפלות של פתווגיות אחרות. לפיכך, זה יכול להיות מאתגר כדי לאבחן במהירות irAEs ולהתייחס אליהם כראוי. irAEs יכול להשפיע על כל הרקמות, התפרצות שלהם מושפע מאוד על ידי במחזור תאים חיסוניים, במיוחד תאי T המאוגדים PD-1 – חסימת נוגדנים. לכן, שיטה פשוטה מינימלית פולשנית כדי לפקח על נוגדנים ממוקדות תאים T חשוב בהגדרות קליניות.

כאן, פיתחנו שיטה פשוטה כדי להעריך את הכריכה של PD-1 – חסימת נוגדנים לתאי T באמצעות טיפת דם היקפי מחולי סרטן שקיבלו nivolumab או פמרופזזואב. באמצעות גישה זו, היינו מסוגלים לנטר כל אחת מהפעולות הבאות: 1) המשך של כריכת נוגדנים לתאי T, 2) התפוסת של מולקולות תא T-1 של התא על ידי נוגדנים טיפולית, ו 3) מצב ההפעלה ותכונות אימונולוגיים של תאי T. שיטה זו היא שינוי של טכניקה שדווחה בעבר⁸. כמות הדם הדרושה היא כמעט זהה לזה הדרוש לבדיקת גלוקוז, והגישה אינה דורשת העשרה תאים מוננובית או שיתוף פעולה עם PD-1 – חסימת נוגדנים. אנו מאשרים כי שיטה זו יכולה להתבצע גם באמצעות דגימות קפואות, כולל דם היקפיים תאים מונוליתים (PBMCs) ותאים מתוך היתוך, הפחתת קרום הלב, נוזל השטיפה ברונכמכתשי, ונוזל מוחי שדרתי, הרומז כי אסטרטגיה זו עשויה להיות שימושית בהקשר של מחקר להיכנס למחקר. שיטה זו עשויה להקל על האבחנה המוקדמת של irAEs, וגם לעזור לקבוע את הטיפולים החיסוני המתאים כדי לשלוט על הסימפטומים שלהם לזהות את הזמנים האופטימליים ליזום טיפולים הבאים לאחר PD-1 מעכבי.

Protocol

הדגימה בוצעה במהלך הליכים קליניים שגרתיים. כל הדגימות האנושיות הושגו לאחר הסכמה מושכלת נמסר על ידי הנושאים, בהתאם להצהרת הלסינקי ובאישור של הוועדה המוסרית הביקורת של בית הספר לרפואה בוגרת, אוניברסיטת אוסקה, יפן (15383 ו-752).

1. הכנה לדגימת דם מלאה וצביעת

1. לאסוף דגימות דם שלם לתוך צינורות איסוף דם המכיל אתילן diamine טטרה חומצה אצטית (EDTA).
   הערה: ניתן לבצע את איסוף הדם באמצעות מחט רגילה או מחלת דם.
2. העברה 20 μL של דגימות דם שלמות כדי 5 מ ל הקלקר עגול-התחתון הזרימה הצינורות cy, לנסות.
   הערה: כדי להקטין את הכריכה הלא ספציפית של תאים לצינורות, 1 מ ל של 2% סרום של שור עוברי (FBS) ב מלוחים באגירה פוספט (PBS) מתווסף לצינורות, והורטתו עבור 10 s לפני היישום כדי דגימות.
3. הוסף 20 μL של 2% FBS ב-PBS.
4. הוסף 10 μL של מגיב מיוחד לחסימת FcR של האדם. מערבבים היטב ומשלבים עבור 15 דקות בטמפרטורת החדר.
5. הוסף 500 μL של מאגר פירוק של תא דם אדום. מערבבים היטב ומשלבים בטמפרטורה של 10 דקות בטמפרטורת החדר.
6. הוסף 4 מ ל של 2% FBS ב PBS ו ספין למטה תאים ב 400 x g (1,500 rpm) עבור 5 דקות ב 4 ° c. הסר את הסופרנטנט על ידי השאיפה.
7. חזור על תהליך השטיפה והשאיפה המתואר בשלב 1.6.
8. השהה מחדש תאים ב-100 μL של 2% FBS ב-PBS וחילוק לשתי שפופרות של 50 μL כל אחד.
9. הוסף נוגדנים לסמן פני השטח (טבלה 1). מערבבים היטב ומשלבים את הטמפרטורה 20 דקות בטמפרטורת החדר בחשכה.
   הערה: בשעת יצירת פרופיל למצב החיסוני של תא T, ניתן להגדיל את מספר הסמנים בהתאם לאיכות המחשב של הזרימה cy, try.
10. לשטוף דגימות 2x כפי שמתואר בשלב 1.6.
11. השהה תאים מחדש ב-200 μL של 2% FBS ב-PBS.

2. ניתוח ציטומטלי זרימה

1. הכנס צינורות לתוך cytometer לרכוש תאים, בעצם לאחר הפרוטוקול המומלץ⁹.
2. רשום 10,000 אירועים כשער לימפוציטים (איור 1א) וייצא נתוני זרימה כקבצי fcs לצורך ניתוח.
3. פתח קבצים בתוכנת הניתוח. המחש את התאים הנמצאים על מגרש פיזור קדמי (FSC) (A) לעומת לימפוציטים של שער (a) (A) (A) (a) (a) (איור 1א).
4. לאחר בחירת תאים בודדים באמצעות FSC (H) לעומת FSC (W) ו-אס. אס. לעומת הבנק הקיסרי (W) (איור 1B) ומציג אותם על CD3 VS. CD8 או CD3 vs. CD4 העלילה, לשער את התאים הCD8 T ותאים CD4 t, בהתאמה (איור 1ג).
5. לאחר בחירת התאים מגודרת והצגתם על מחלקה PD-1 לעומת האדם IgG4 העלילה, לזהות PD-1 – חסימת נוגדן-CD8 bound ו CD4 T מבוסס על בקרת isotype (איור 1ד).

תוצאות

את האסטרטגיה והזרימה cy, לנסות הניתוח (איור 1) יכול לזהות PD-1 – חסימת כריכת נוגדנים לתאי T שהתקבלו טיפה של החולה NSCLC דם היקפי. לפני PD-1-חסימת נוגדן מנוהל, אין אדם IgG4-חיוביות CD8 או CD4 T התאים נמצאים, ו-PD-1ביטוייכול להיות מאושר על ידי pd-1-זיהוי נוגדן (eh 12.1) (איור 2

Discussion

במאמר זה, אנו מדווחים על שיטה באמצעות cytometer זרם כדי לזהות PD-1-חסימת נוגדנים מאוגד תאים T נגזר טיפת דם היקפי, אשר פיתחנו במקור עבור nivolumab זיהוי¹⁰. למרות שטכניקה זו פשוטה מאוד וקלה לביצוע, יש לציין שתי נקודות חשובות כדי לקבל תוצאות מדויקות. אחד הוא כי כדי לזהות PD-1 מולקולות, הנוגדן המת...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10X RBC Lysis Buffer (Multi-species)	Thermo Fisher Scientific	00-4300-54	50 mL
APC/Cyanine7 anti-human CD4 Antibody	BioLegend	300518	Clone RPA-T4
BD FACS Canto II Flow Cytometer	BD
Brilliant Violet 510 anti-human CD8a Antibody	BioLegend	301048	Clone RPA-T8
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	nacalai tesque	14249-95	500 mL
Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes	STEMCELL Technologies	352058	5 mL
FcR Blocking Reagent, human	Miltenyi Biotec	130-059-901	2 mL
FLOWJO	BD
Gibco Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher Scientific	12676029	500 mL
Mouse IgG1 monoclonal - Isotype control	abcam	ab81200
Mouse monoclonal Anti-Human IgG4 Fc	abcam	ab99825	Clone HP6025
Pacific Blue Mouse Anti-Human CD3	BD	558117	Clone UCHT1
PE-Cy7 Mouse anti-Human CD279 (PD-1)	BD	561272	Clone EH12.1
PE-Cy7 Mouse IgG1 κ Isotype Control	BD	557646