Monitoramento de anticorpos bloqueadores pd-1 ligados a células T derivadas de uma gota de sangue periférico

Resumo

Desenvolvemos um simples ensaio de citometria de fluxo para avaliar a ligação de anticorpos bloqueadores PD-1 às células T, exigindo apenas uma gota de sangue periférico de pacientes com câncer.

Resumo

Os inibidores de checkpoint imunológico, incluindo anticorpos de bloqueio pd-1, melhoraram significativamente os resultados do tratamento em vários tipos de câncer. A eficácia farmacológica dessas imunoterapias é duradoura, estendendo-se até mesmo além da descontinuação de suas injeções, devido às persistentes concentrações sanguíneas. Aqui desenvolvemos um simples ensaio de citometria de fluxo para avaliar o status de ligação de células T dos anticorpos pd-1 de bloqueio nivolumab e pembrolizumabe. Como um teste de glicose, este ensaio requer apenas uma única gota de sangue periférico. Visualizar anticorpos ligados em células T é mais confiável do que medir concentrações sanguíneas de anticorpos. Além disso, se necessário, podemos potencialmente analisar muitos marcadores imunológicos distintos em células T ligadas a anticorpos bloqueadores PD-1. Assim, trata-se de uma estratégia simples e minimamente invasiva para analisar o efeito farmacológico dos anticorpos bloqueadores de PD-1 em pacientes com câncer.

Introdução

Os anticorpos de bloqueio pd-1 tornaram-se a escolha padrão para o tratamento de vários tipos de câncer, incluindo câncer de pulmão não-pequeno celular (NSCLC)^1,2,3,4. Eles mostram um notável efeito terapêutico em um subconjunto de pacientes com câncer que não responderam às quimioterapias citotóxicas convencionais. No entanto, os inibidores de ponto de verificação imunológica (ICIs), que incluem anticorpos pd-1-bloqueio, podem causar um espectro único e distinto de eventos adversos, denominados eventos adversos relacionados à imunológica (irAEs)⁵. Embora os irAEs possam afetar quase todos os tecidos, eles são mais comumente observados no trato gastrointestinal, glândulas endócrinas, pele e fígado, e podem causar distúrbios pruritos, erupção cutânea, náusea, diarreia e tireoide^6,7. Em geral, a maioria dos irAEs aparecem dentro de 1 a 2 meses após o início das ICIs. No entanto, em alguns casos, eles podem ocorrer mais de 1 ano após o início do tratamento ou mesmo após a cessação do tratamento^6,7. Eles também causam vários sintomas que podem ser difíceis de discriminar outras patologias. Assim, pode ser desafiador diagnosticar prontamente os irAEs e tratá-los adequadamente. os irAEs podem afetar todos os tecidos, e seu início é fortemente influenciado pelas células imunes circulantes, especialmente as células T ligadas a anticorpos bloqueadores PD-1. Portanto, um método simples e minimamente invasivo para monitorar células T direcionadas a anticorpos é importante em ambientes clínicos.

Aqui, desenvolvemos um método simples para avaliar a vinculação de anticorpos pd-1 a células T usando uma gota de sangue inteiro periférico de pacientes com câncer que receberam nivolumab ou pembrolizumabe. Usando essa abordagem, pudemos monitorar cada um dos seguintes: 1) a duração da ligação de anticorpos às células T, 2) a ocupação de moléculas de PD-1 por anticorpos terapêuticos e 3) o status de ativação e características imunológicas das células T. Este método é uma modificação de uma técnica⁸relatada anteriormente . A quantidade de sangue necessária é quase a mesma necessária para um teste de glicose, e a abordagem não requer enriquecimento mononuclear celular ou co-culturing com anticorpos pd-1-bloqueio. Confirmamos que esse método também pode ser realizado utilizando amostras congeladas, incluindo células mononucleares sanguíneas periféricas (PBMCs) e células de derrame pleural, derrame pericárdico, fluido de lavage broncoaveolar e fluido cerebrorraquidiano, sugerindo que essa estratégia pode ser útil no contexto de um estudo multicêntrico. Esse método pode facilitar o diagnóstico precoce dos irAEs, e também ajudar a determinar os tratamentos imunossupressores adequados para controlar seus sintomas e identificar os horários ideais para iniciar terapias subsequentes após inibidores de PD-1.

Protocolo

A amostragem foi realizada durante os procedimentos clínicos de rotina. Todas as amostras humanas foram obtidas após o consentimento informado foi fornecido pelos sujeitos, de acordo com a Declaração de Helsinque e com a aprovação do conselho de revisão ética da Faculdade de Pós-Graduação em Medicina, Universidade de Osaka, Japão (15383 e 752).

1. Preparação e coloração de amostras de sangue inteiro

1. Colete amostras de sangue inteiras em tubos de coleta de sangue contendo ácido tetraástico de diamina de etileno (EDTA).
   NOTA: A coleta de sangue pode ser realizada usando uma agulha normal ou uma lança de sangue.
2. Transfira 20 μL de amostras de sangue inteiro para tubos de citomete trimeteno de poliestireno de 5 mL.
   NOTA: Para reduzir a ligação não específica das células aos tubos, 1 mL de 2% de soro bovino fetal (FBS) em soro amortecido com fosfato (PBS) é adicionado em tubos e vórtices por 10 s antes da aplicação às amostras.
3. Adicione 20 μL de 2% de FBS em PBS.
4. Adicione 10 μL de reagente de bloqueio fcr específico para humanos. Misture bem e incuba por 15 min à temperatura ambiente.
5. Adicione 500 μL de tampão de lise de glóbulos vermelhos. Misture bem e incuba por 10 min à temperatura ambiente.
6. Adicione 4 mL de 2% de FBS em PBS e gire células para baixo a 400 x g (1.500 rpm) por 5 min a 4 °C. Remova supernatant por aspiração.
7. Repita o processo de lavagem e aspiração descrito na etapa 1.6.
8. Resuspender as células em 100 μL de 2% de FBS em PBS e dividir em dois tubos de 50 μL cada.
9. Adicione anticorpos de marcador de superfície(Tabela 1). Misture bem e incuba rastou por 20 min à temperatura ambiente no escuro.
   NOTA: Ao traçar o perfil da célula T, o número de marcadores pode ser aumentado com base na qualidade da máquina de citometria de fluxo.
10. Lave amostras 2x como descrito na etapa 1.6.
11. Resuspender as células em 200 μL de 2% de FBS na PBS.

2. Análise Citométrica de fluxo

1. Insira tubos no citometro de fluxo e adquira células, basicamente seguindo o protocolo recomendado⁹.
2. Registre 10.000 eventos como o portão linfócito (Figura 1A) e dados de fluxo de exportação como arquivos .fcs para análise.
3. Abra arquivos no software de análise. Visualize as células em uma dispersão para frente (FSC) (A) vs. dispersão lateral (SSC) (A) e linfócitos de portão(Figura 1A).
4. Depois de selecionar células individuais usando fSC (H) vs. FSC (W) e SSC (H) vs. SSC(W)( Figura 1B) e exibi-las em um cd3 vs. CD8 ou cd3 ou cd4 gráfico, portão das células CD8 T e células CD4 T, respectivamente (Figura 1C).
5. Depois de selecionar as células fechadas e exibi-las em um enredo PD-1 vs. IgG4 humano, identifique as células CD8 e CD4 T ligadas ao Corpo de PD-1 com base no controle do isotipo(Figura1D).

Resultados

A estratégia de gating e a análise de citometria de fluxo(Figura 1)podem detectar a ligação de anticorpos PD-1 a células T obtidas a partir de uma queda de sangue periférico do paciente NSCLC. Antes que o anticorpo de bloqueio PD-1 seja administrado, nenhuma célula de CD8 ou CD4 Positivo humana está presente, e a expressão PD-1 pode ser confirmada por um anticorpo PD-1 -detecting (EH12.1) (Figura 2A). Após a administração nivolumab o...

Discussão

Neste artigo, relatamos um método usando um címetro de fluxo para detectar anticorpos bloqueadores PD-1 ligados a células T derivadas de uma gota de sangue periférico, que originalmente desenvolvemos para detecção de nivolumab¹⁰. Embora essa técnica seja muito simples e fácil de executar, dois pontos importantes devem ser notados para obter resultados precisos. Uma delas é que para detectar moléculas PD-1, deve-se usar um anticorpo apropriado que compete com nivolumab e pembrolizumabe. E...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
10X RBC Lysis Buffer (Multi-species)	Thermo Fisher Scientific	00-4300-54	50 mL
APC/Cyanine7 anti-human CD4 Antibody	BioLegend	300518	Clone RPA-T4
BD FACS Canto II Flow Cytometer	BD
Brilliant Violet 510 anti-human CD8a Antibody	BioLegend	301048	Clone RPA-T8
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	nacalai tesque	14249-95	500 mL
Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes	STEMCELL Technologies	352058	5 mL
FcR Blocking Reagent, human	Miltenyi Biotec	130-059-901	2 mL
FLOWJO	BD
Gibco Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher Scientific	12676029	500 mL
Mouse IgG1 monoclonal - Isotype control	abcam	ab81200
Mouse monoclonal Anti-Human IgG4 Fc	abcam	ab99825	Clone HP6025
Pacific Blue Mouse Anti-Human CD3	BD	558117	Clone UCHT1
PE-Cy7 Mouse anti-Human CD279 (PD-1)	BD	561272	Clone EH12.1
PE-Cy7 Mouse IgG1 κ Isotype Control	BD	557646