Мониторинг PD-1-Блокирование антител, связанных с Т-клеток, полученных от капли периферической крови

Резюме

Мы разработали простой анализ цитометрии потока для оценки связывания PD-1-блокирующих антител к Т-клеткам, требуя только капли периферической крови от онкологических больных.

Аннотация

Ингибиторы иммунных контрольных точек, в том числе PD-1-блокирующие антитела, значительно улучшили результаты лечения при различных видах рака. Фармакологическая эффективность этих иммунотерапевтических препаратов является длительной, простирающейся даже после прекращения их инъекций, из-за постоянной концентрации крови. Здесь мы разработали простой анализ цитометрии потока для оценки Т-клеточного связывающего статуса PD-1-блокирующих антител ниволумаба и пембролизумаба. Как тест глюкозы, этот анализ требует только одну каплю периферической крови. Визуализация связывания антител на Т-клетках надежнее, чем измерение концентраций в крови антител. Кроме того, при необходимости, мы можем потенциально проанализировать многие отличительные иммунных маркеров на Т-клеток, связанных с PD-1-блокирующих антител. Таким образом, это простая и минимально инвазивная стратегия для анализа фармакологического эффекта PD-1-блокирование антител у онкологических больных.

Введение

PD-1-блокирующие антитела стали стандартным выбором для лечения различных видов рака, в том числе немелкоклеточного рака легких (NSCLC)^1,2,3,4. Они показывают замечательный терапевтический эффект в подмножестве больных раком, которые не ответили на обычные цитотоксические химиотерапии. Тем не менее, ингибиторы иммунной контрольной точки (ИКИ), которые включают PD-1-блокирующие антитела, может вызвать уникальный и четкий спектр побочных явлений, называемых иммунных побочных явлений (irAEs)⁵. Хотя irAEs может повлиять почти на все ткани, они чаще всего наблюдаются в желудочно-кишечном тракте, эндокринных желез, кожи и печени, и они могут вызвать зуд, сыпь, тошнота, диарея, и расстройства щитовидной железы^6,7. В целом, большинство irAEs появляются в течение 1 до 2 месяцев после начала ИКИ. Однако в некоторых случаях они могут возникнуть позднее, чем через 1 год после начала лечения или даже после прекращения лечения^6,7. Они также вызывают различные симптомы, которые могут быть трудно дискриминировать от других патологий. Таким образом, это может быть сложной задачей для оперативной диагностики irAEs и лечить их надлежащим образом. irAEs может повлиять на все ткани, и их начало сильно зависит от циркулирующих иммунных клеток, особенно Т-клеток, связанных с PD-1-блокирующих антител. Таким образом, простой и минимально инвазивный метод для мониторинга антител целевых Т-клеток имеет важное значение в клинических условиях.

Здесь мы разработали простой метод оценки связывания PD-1-блокирующих антител к Т-клеткам с помощью капли периферической цельной крови от онкологических больных, которые получали ниволумаб или пембролизумаб. Используя этот подход, мы смогли контролировать каждый из следующих: 1) продолжительность связывания антител к Т-клеткам, 2) заполняемость т-клеток PD-1 молекул терапевтических антител, и 3) состояние активации и иммунологические особенности Т-клеток. Этот метод является модификацией ранее сообщалось техники⁸. Количество крови требуется почти так же, как и необходимо для теста глюкозы, и подход не требует моноядерного обогащения клеток или со-культивирования с PD-1-блокирующих антител. Мы подтвердили, что этот метод также может быть выполнен с использованием замороженных образцов, в том числе периферических моноядерных клеток крови (PBMCs) и клеток из плеврального выпота, перикардиального выпота, бронхоальвеолярной жидкости для лаважа и спинномозговой жидкости, предполагая, что эта стратегия может быть полезна в контексте многоцентрового исследования. Этот метод может облегчить раннюю диагностику irAEs, а также помочь определить соответствующие иммуносупрессивные методы лечения для контроля их симптомов и определить оптимальное время для начала последующей терапии после ингибиторов PD-1.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Выборка проводилась во время обычных клинических процедур. Все образцы человека были получены после получения информированного согласия субъектами в соответствии с Хельсинкской декларацией и с одобрения совета по этике Высшей школы медицины, Университета Осаки, Япония (15383 и 752).

1. Подготовка образца крови и окрашивание

1. Сбор образцов всей крови в трубки для сбора крови, содержащие этилен диамин тетра-ацетической кислоты (ЭДТА).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Сбор крови может быть выполнен с помощью обычной иглы или крови ланцет.
2. Передача 20 Зл образцов цельной крови в 5 мл круглого дна полистирола потока цитометрии труб.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для уменьшения неспецифической связывания клеток к трубам, 1 мл 2% сыворотки крупного рогатого скота плода (FBS) в фосфат буферном сольнике (PBS) добавляется в трубки и вихрей в течение 10 с до нанесения на образцы.
3. Добавьте 20 зл 2% FBS в PBS.
4. Добавьте 10 злителк реагента для блокирования fcR для конкретных людей. Хорошо перемешать и инкубировать в течение 15 минут при комнатной температуре.
5. Добавьте 500 л буфера лиза из красных кровяных телец. Хорошо перемешайте и инкубировать в течение 10 минут при комнатной температуре.
6. Добавьте 4 мл 2% FBS в PBS и вращайте вниз клетки при 400 х г (1500 об/мин) в течение 5 минут при 4 градусах Цельсия. Удалите супернатант по аспирации.
7. Повторите процесс мытья и аспирации, описанный в шаге 1.6.
8. Повторно приостановить клетки в 100 Л л 2% FBS в PBS и разделить на две трубки по 50 л каждый.
9. Добавить поверхностный маркер антител(Таблица 1). Хорошо перемешайте и инкубировать в течение 20 минут при комнатной температуре в темноте.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При профилировании иммунного статуса Т-клеток, количество маркеров может быть увеличено на основе качества цитометрии цитометрии потока.
10. Вымойте образцы 2x, как описано в шаге 1.6.
11. Повторное отемки клеток в 200 л 2% FBS в PBS.

2. Циклометрический анализ потока

1. Вставьте трубки в цитометр потока и приобретете клетки, в основном следуя рекомендуемому протоколу^9.
2. Запись 10000 событий, как лимфоцитов ворота (Рисунок 1А) и данные о потоке экспорта, как файлы .fcs для анализа.
3. Откройте файлы в программном обеспечении для анализа. Визуализация клеток на переднем рассеянии (FSC) (A) против бокового рассеяния (SSC) (A) участка и лимфоцитов ворот(рисунок 1A).
4. После выбора одиночных ячеек с использованием FSC (H) против FSC (W) и SSC (W)(рисунок 1B)и отображения их на CD3 против CD8 или CD3 против cd4 сюжета, ворота CD8 T-клеток и CD4 T-клеток, соответственно(рисунок 1C).
5. После выбора закрытых ячеек и отображения их на PD-1 против человека IgG4 участок, определить PD-1-блокирование антител связаны CD8 и CD4 Т-клетки на основе контроля изотипа(Рисунок 1D).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Стратегия gating и анализ цитометрии потока(Рисунок 1) может обнаружить PD-1-блокирующий связывание антител к Т-клеткам, полученным от капли периферической крови пациента NSCLC. Перед PD-1-блокирующий антитела вводят, нет человека IgG4-положительных CD8 или CD4 Т-клетки присутствуют, ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

В этой статье мы сообщаем метод с помощью цитометра потока для обнаружения PD-1-блокирующих антител, связанных с Т-клетками, полученными из капли периферической крови, которую мы первоначально разработали для обнаружения ниволумаба^10. Хотя этот метод очень прост и прост в вы?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
10X RBC Lysis Buffer (Multi-species)	Thermo Fisher Scientific	00-4300-54	50 mL
APC/Cyanine7 anti-human CD4 Antibody	BioLegend	300518	Clone RPA-T4
BD FACS Canto II Flow Cytometer	BD
Brilliant Violet 510 anti-human CD8a Antibody	BioLegend	301048	Clone RPA-T8
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	nacalai tesque	14249-95	500 mL
Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes	STEMCELL Technologies	352058	5 mL
FcR Blocking Reagent, human	Miltenyi Biotec	130-059-901	2 mL
FLOWJO	BD
Gibco Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher Scientific	12676029	500 mL
Mouse IgG1 monoclonal - Isotype control	abcam	ab81200
Mouse monoclonal Anti-Human IgG4 Fc	abcam	ab99825	Clone HP6025
Pacific Blue Mouse Anti-Human CD3	BD	558117	Clone UCHT1
PE-Cy7 Mouse anti-Human CD279 (PD-1)	BD	561272	Clone EH12.1
PE-Cy7 Mouse IgG1 κ Isotype Control	BD	557646