Monitoraggio degli anticorpi PD-1-Blocking legati a cellule T derivate da una goccia di sangue periferico

Riepilogo

Abbiamo sviluppato un semplice saggio di citometria di flusso per valutare il legame degli anticorpi di blocco PD-1 alle cellule T, richiedendo solo una goccia di sangue periferico da pazienti oncologici.

Abstract

Gli inibitori dei checkpoint immunitari, tra cui gli anticorpi che bloccano la PD-1, hanno migliorato significativamente gli esiti del trattamento in vari tipi di cancro. L'efficacia farmacologica di queste immunoterapie è di lunga durata, estendendosi anche oltre l'interruzione delle loro iniezioni, a causa di persistenti concentrazioni ematiche. Qui abbiamo sviluppato un semplice saggio di citometria di flusso per valutare lo stato di legame delle cellule T degli anticorpi che bloccano il PD-1 nivolumab e pembrolizumab. Come un test del glucosio, questo saggio richiede solo una singola goccia di sangue periferico. La visualizzazione del legame degli anticorpi sulle cellule T è più affidabile della misurazione delle concentrazioni ematiche degli anticorpi. Inoltre, se necessario, possiamo potenzialmente analizzare molti marcatori immunitari distintivi correlati alle cellule T legati agli anticorpi che bloccano la PD-1. Quindi, questa è una strategia semplice e minimamente invasiva per analizzare l'effetto farmacologico degli anticorpi che bloccano la PD-1 nei pazienti oncologici.

Introduzione

Gli anticorpi PD-1-bloccanti sono diventati la scelta standard per il trattamento di vari tipi di cancro, tra cui il cancro polmonare non a piccole cellule (NSCLC)^1,2,3^,4. Essi mostrano un notevole effetto terapeutico in un sottoinsieme di pazienti oncologici che non hanno risposto alle chemioterapie citotossiche convenzionali. Tuttavia, gli inibitori del checkpoint immunitario (ICI), che includono anticorpi che bloccano la PD-1, possono causare uno spettro unico e distinto di eventi avversi, dorati eventi avversi legati al sistema immunitario (irAE)⁵. Anche se gli irAE possono colpire quasi tutti i tessuti, sono più comunemente osservati nel tratto gastrointestinale, ghiandole endocrine, pelle, e fegato, e possono causare prurito, eruzione cutanea, nausea, diarrea, e disturbi della tiroide^6,7. In generale, la maggior parte degli irsia appare entro 1 o 2 mesi dopo l'avvio delle ICI. Tuttavia, in alcuni casi, possono verificarsi dopo 1 anno dopo l'inizio del trattamento o anche dopo la cessazione del trattamento^6,7. Essi causano anche vari sintomi che possono essere difficili da discriminare da altre patologie. Pertanto, può essere difficile diagnosticare tempestivamente gli iraE e trattarli in modo appropriato. Gli irAE possono colpire tutti i tessuti e la loro insorgenza è fortemente influenzata dalle cellule immunitarie circolanti, in particolare le cellule T legate agli anticorpi che bloccano la PD-1. Pertanto, un metodo semplice e minimamente invasivo per monitorare le cellule T mirate agli anticorpi è importante negli ambienti clinici.

Qui, abbiamo sviluppato un semplice metodo per valutare il legame di anticorpi che bloccano PD-1 alle cellule T utilizzando una goccia di sangue intero periferico da pazienti oncologici che hanno ricevuto nivolumab o pembrolizumab. Utilizzando questo approccio, siamo stati in grado di monitorare ciascuno dei seguenti elementi: 1) la durata del legame degli anticorpi alle cellule T, 2) l'occupazione delle molecole di PD-1 delle cellule T da parte di anticorpi terapeutici e 3) lo stato di attivazione e le caratteristiche immunologiche delle cellule T. Questo metodo è una modifica di una tecnica precedentemente^{segnalata 8}. La quantità di sangue necessaria è quasi la stessa di quella necessaria per un test del glucosio, e l'approccio non richiede l'arricchimento delle cellule mononucleari o la co-cultura con anticorpi che bloccano la PD-1. Abbiamo confermato che questo metodo può essere eseguito anche utilizzando campioni congelati, tra cui cellule mononucleari del sangue periferico (PBMC) e cellule da effusione plerica, effusione pericardiale, liquido di lavanda bronchoalveolar e liquido cerebrospinale, suggerendo che questa strategia può essere utile nel contesto di uno studio multicentrico. Questo metodo può facilitare la diagnosi precoce degli iraE e anche aiutare a determinare i trattamenti immunosoppressivi appropriati per controllare i loro sintomi e per identificare i tempi ottimali per avviare terapie successive dopo inibitori PD-1.

Protocollo

Il campionamento è stato eseguito durante le procedure cliniche di routine. Tutti i campioni umani sono stati ottenuti dopo il consenso informato è stato fornito dai soggetti, in conformità con la dichiarazione di Helsinki e con l'approvazione del comitato di revisione etica della Graduate School of Medicine, Università di Osaka, Giappone (15383 e 752).

1. Preparazione e colorazione del campione di sangue intero

1. Raccogliere campioni interi di sangue in tubi di raccolta del sangue contenenti etilene diamine tetra-acetico acido (EDTA).
   NOTA: La raccolta del sangue può essere eseguita utilizzando un ago normale o una lancetta di sangue.
2. Trasferire 20 - L di campioni di sangue intero a 5 mL di tubi di citometria a flusso di polistirolo rotondo.
   NOTA: Per ridurre l'associazione non specifica delle cellule ai tubi, 1 mL di 2% siero bovino fetale (FBS) in salina tampina bufferizzata fosfato (PBS) viene aggiunto ai tubi e vortice per 10 s prima dell'applicazione ai campioni.
3. Aggiungere in PBS 20 -L del 2% Di FBS.
4. Aggiungete 10 l di reagente di blocco FcR specifico per l'uomo. Mescolare bene e incubare per 15 min a temperatura ambiente.
5. Aggiungere 500 l di l'isola del globulo rosso. Mescolare bene e incubare per 10 min a temperatura ambiente.
6. Aggiungete 4 mL di 2% FBS in PBS e abbassate le celle a 400 x g (1.500 giri/m) per 5 min a 4 gradi centigradi. Rimuovere supernatante per aspirazione.
7. Ripetere il processo di lavaggio e aspirazione descritto nel passaggio 1.6.
8. Sospendi di nuovo le cellule in 100 gradi l di 2% FBS in PBS e divise in due tubi da 50 a L ciascuno.
9. Aggiungere anticorpi dei marcatori di superficie (Tabella 1). Mescolare bene e incubare per 20 min a temperatura ambiente al buio.
   NOTA: durante la profilazione dello stato immunitario delle cellule T, il numero di marcatori può essere aumentato in base alla qualità della macchina della citometria di flusso.
10. Lavare i campioni 2x come descritto al punto 1.6.
11. Risospendere le celle in 200 - L del 2% FBS in PBS.

2. Analisi citometrica del flusso

1. Inserire tubi nel citometro di flusso e acquisire cellule, fondamentalmente seguendo il protocollo raccomandato⁹.
2. Registrare 10.000 eventi come porta del linfocito (Figura 1A) ed esportare i dati di flusso come file .fcs per l'analisi.
3. Aprire i file nel software di analisi. Visualizzare le celle in un grafico a dispersione in avanti (FSC) (A) rispetto a dispersione laterale (SSC) (A) e linfociti gate (Figura 1A).
4. Dopo aver selezionato le celle singole utilizzando FSC (H) vs FSC (W) e SSC (H) vs SSC (W) (W)(Figura 1B) e averle visualizzate su un grafico CD3 vs CD8 o CD3 rispetto a CD4, gate le cellule T CD8 e le celle T CD4, rispettivamente (Figura 1C).
5. Dopo aver selezionato le celle gated e averle visualizzate su un grafico PD-1 rispetto a quello umano IgG4, identificare le celle CD8 e T legate agli anticorpi PD-1 in base al controllo isotipo (Figura 1D).

Risultati

La strategia di gating e l'analisi della citometria di flusso (Figura 1) sono in grado di rilevare il legame degli anticorpi PD-1-bloccante alle cellule T ottenute da una goccia di sangue periferico del paziente NSCLC. Prima che l'anticorpo pd-1-blocco venga somministrato, non sono presenti cellule T CD8 o CD4 umane- positive e l'espressione PD-1 può essere confermata da un anticorpo di rilevamento PD-1 (EH12.1)(Figura 2A). Dopo la somministraz...

Discussione

In questo articolo, riportiamo un metodo utilizzando un citometro di flusso per rilevare PD-1-bloccando gli anticorpi legati alle cellule T derivate da una goccia di sangue periferico, che abbiamo originariamente sviluppato per il rilevamento nivolumab¹⁰. Anche se questa tecnica è molto semplice e facile da eseguire, due punti importanti devono essere annotati per ottenere risultati accurati. Uno è che per rilevare le molecole PD-1, dovrebbe essere utilizzato un anticorpo appropriato che compete...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
10X RBC Lysis Buffer (Multi-species)	Thermo Fisher Scientific	00-4300-54	50 mL
APC/Cyanine7 anti-human CD4 Antibody	BioLegend	300518	Clone RPA-T4
BD FACS Canto II Flow Cytometer	BD
Brilliant Violet 510 anti-human CD8a Antibody	BioLegend	301048	Clone RPA-T8
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	nacalai tesque	14249-95	500 mL
Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes	STEMCELL Technologies	352058	5 mL
FcR Blocking Reagent, human	Miltenyi Biotec	130-059-901	2 mL
FLOWJO	BD
Gibco Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher Scientific	12676029	500 mL
Mouse IgG1 monoclonal - Isotype control	abcam	ab81200
Mouse monoclonal Anti-Human IgG4 Fc	abcam	ab99825	Clone HP6025
Pacific Blue Mouse Anti-Human CD3	BD	558117	Clone UCHT1
PE-Cy7 Mouse anti-Human CD279 (PD-1)	BD	561272	Clone EH12.1
PE-Cy7 Mouse IgG1 κ Isotype Control	BD	557646