Monitoreo de anticuerpos PD-1-Blocking Enlazados a Células T derivadas de una gota de sangre periférica

Resumen

Desarrollamos un ensayo de citometría de flujo simple para evaluar la unión de los anticuerpos de bloqueo de PD-1 a los células T, que requieren sólo una gota de sangre periférica de los pacientes con cáncer.

Resumen

Los inhibidores del punto de control inmune, incluidos los anticuerpos que bloquean la DP-1, han mejorado significativamente los resultados del tratamiento en varios tipos de cáncer. La eficacia farmacológica de estas inmunoterapias es de larga duración, extendiéndose incluso más allá de la interrupción de sus inyecciones, debido a las concentraciones persistentes de sangre. Aquí desarrollamos un ensayo de citometría de flujo simple para evaluar el estado de unión a las células T de los anticuerpos de bloqueo de PD-1 nivolumab y pembrolizumab. Al igual que una prueba de glucosa, este ensayo requiere una sola gota de sangre periférica. Visualizar la unión de anticuerpos en los células T es más fiable que medir las concentraciones de anticuerpos en la sangre. Además, si es necesario, podemos analizar potencialmente muchos marcadores distintivos relacionados con el sistema inmunitario en células T enlazadas a anticuerpos de bloqueo PD-1. Por lo tanto, se trata de una estrategia simple y mínimamente invasiva para analizar el efecto farmacológico de los anticuerpos de bloqueo de PD-1 en pacientes con cáncer.

Introducción

Los anticuerpos de bloqueo de PD-1 se han convertido en la opción estándar para el tratamiento de varios tipos de cáncer, incluido el cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC)^1,2,3,4. Muestran un efecto terapéutico notable en un subconjunto de pacientes con cáncer que no han respondido a las quimioterapias citotóxicas convencionales. Sin embargo, los inhibidores del punto de control inmune (IIC), que incluyen anticuerpos de bloqueo de PD-1, pueden causar un espectro único y distinto de eventos adversos, llamados eventos adversos relacionados con el sistema inmunitario (irAE)⁵. Aunque las irAEs pueden afectar casi todos los tejidos, se observan más comúnmente en el tracto gastrointestinal, glándulas endocrinas, piel, y el hígado, y pueden causar prurito, erupción cutánea, náuseas, diarrea, y trastornos de la tiroides^6,7. En general, la mayoría de las iAE aparecen entre 1 y 2 meses después del inicio de las IIC. Sin embargo, en algunos casos, pueden ocurrir más tarde de 1 año después del inicio del tratamiento o incluso después de la interrupción del tratamiento^6,7. También causan varios síntomas que pueden ser difíciles de discriminar de otras patologías. Por lo tanto, puede ser difícil diagnosticar rápidamente irAEs y tratarlos adecuadamente. irAE puede afectar a todos los tejidos, y su aparición está fuertemente influenciada por las células inmunitarias circulantes, especialmente las células T unidas a los anticuerpos de bloqueo de PD-1. Por lo tanto, un método sencillo y mínimamente invasivo para monitorear las células T dirigidas a anticuerpos es importante en entornos clínicos.

Aquí, desarrollamos un método sencillo para evaluar la unión de los anticuerpos pd-1, bloqueando los anticuerpos a las células T utilizando una gota de sangre entera periférica de pacientes con cáncer que recibieron nivolumab o pembrolizumab. Utilizando este enfoque, pudimos monitorear cada uno de los siguientes: 1) la duración de la unión de anticuerpos a las células T, 2) la ocupación de las moléculas DE PD-1 de células T por anticuerpos terapéuticos, y 3) el estado de activación y las características inmunológicas de los células T. Este método es una modificación de una técnica notificada previamente⁸. La cantidad de sangre requerida es casi la misma que la necesaria para una prueba de glucosa, y el enfoque no requiere enriquecimiento de células mononucleares o co-cultivo con anticuerpos de bloqueo de PD-1. Confirmamos que este método también se puede realizar utilizando muestras congeladas, incluyendo células mononucleares de sangre periférica (PPBM) y células de derrame pleural, derrame pericárdico, líquido de lavado broncoalveolar, y líquido cefalorraquídeo, lo que sugiere que esta estrategia puede ser útil en el contexto de un estudio multicéntrico. Este método puede facilitar el diagnóstico precoz de irAEs, y también ayudar a determinar los tratamientos inmunosupresores adecuados para controlar sus síntomas e identificar los tiempos óptimos para iniciar terapias posteriores después de los inhibidores de la PD-1.

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Protocolo

El muestreo se realizó durante los procedimientos clínicos de rutina. Todas las muestras humanas se obtuvieron después de que los sujetos proporcionaran el consentimiento informado, de conformidad con la Declaración de Helsinki y con la aprobación de la junta de revisión ética de la Escuela de Posgrado de Medicina de la Universidad de Osaka, Japón (15383 y 752).

1. Preparación y tinción de muestras de sangre enteras

1. Recoger muestras de sangre entera en tubos de recolección de sangre que contienen ácido tetraacético de etileno diamina (EDTA).
   NOTA: La recolección de sangre se puede realizar con una aguja normal o una lanceta de sangre.
2. Transfiera 20 ml de muestras de sangre entera a tubos de citometría de flujo de poliestireno de fondo redondo de 5 ml.
   NOTA: Para reducir la unión no específica de las células a los tubos, se añade 1 ml de suero bovino fetal (FBS) al 2% en solución salina tamponada con fosfato (PBS) en tubos y vórtice durante 10 s antes de la aplicación a las muestras.
3. Añadir 20 sl de 2% FBS en PBS.
4. Añadir 10 s de reactivo de bloqueo fcR específico para humanos. Mezclar bien e incubar durante 15 min a temperatura ambiente.
5. Añadir 500 l de tampón de lisis de glóbulos rojos. Mezclar bien e incubar durante 10 min a temperatura ambiente.
6. Añadir 4 ml de 2% DE FBS en PBS y espírelas a 400 x g (1.500 rpm) durante 5 min a 4 oC. Retire el sobrenadante por aspiración.
7. Repita el proceso de lavado y aspiración descrito en el paso 1.6.
8. Vuelva a suspender las células en 100 s de 2% FBS en PBS y divídalas en dos tubos de 50 ol cada uno.
9. Añadir anticuerpos de marcador de superficie (Tabla 1). Mezclar bien e incubar durante 20 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad.
   NOTA: Al perfilar el estado inmune de los células T, el número de marcadores se puede aumentar en función de la calidad de la máquina de citometría de flujo.
10. Lave las muestras 2x como se describe en el paso 1.6.
11. Resuspenda las células en 200 s de 2% DE FBS en PBS.

2. Análisis citométrico de flujo

1. Inserte tubos en el citómetro de flujo y adquiera células, básicamente siguiendo el protocolo recomendado^9.
2. Registre 10.000 eventos como la puerta de linfocitos(Figura 1A)y exporte datos de flujo como archivos .fcs para su análisis.
3. Abra archivos en el software de análisis. Visualice las células en una dispersión hacia adelante (FSC) (A) frente a la dispersión lateral (SSC) (A) gráfica y linfocitos de puerta(Figura 1A).
4. Después de seleccionar celdas individuales usando FSC (H) vs FSC (W) y SSC (H) vs SSC (W)(Figura 1B) y mostrándolas en una gráfica CD3 vs CD8 o CD3 vs CD4, engarre las células CD8 T y las células CD4 T, respectivamente (Figura 1C).
5. Después de seleccionar las celdas cerradas y mostrarlas en una gráfica de PD-1 frente a IgG4 humana, identifique las células CD8 y CD4 T enlazadas a anticuerpos PD-1 en función del control de isotipos(Figura 1D).

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Resultados

La estrategia de gating y el análisis de citometría de flujo(Figura 1) pueden detectar la unión de anticuerpos de bloqueo de PD-1 a los glóbulos T obtenidos a partir de una gota de sangre periférica del paciente NSCLC. Antes de administrar el anticuerpo de bloqueo PD-1, no hay células T IGG4 positivas humanas, y la expresión PD-1 puede ser confirmada por un anticuerpo de detección de PD-1 (EH12.1)(Figura 2A). Después de la administraci?...

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Discusión

En este artículo, informamos de un método utilizando un citómetro de flujo para detectar anticuerpos de bloqueo PD-1 unidos a células T derivados de una gota de sangre periférica, que originalmente desarrollamos para la detección de nivolumab^10. Aunque esta técnica es muy simple y fácil de realizar, se deben observar dos puntos importantes para obtener resultados precisos. Una es que para detectar moléculas de PD-1, se debe utilizar un anticuerpo adecuado que compita con nivolumab y pembr...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
10X RBC Lysis Buffer (Multi-species)	Thermo Fisher Scientific	00-4300-54	50 mL
APC/Cyanine7 anti-human CD4 Antibody	BioLegend	300518	Clone RPA-T4
BD FACS Canto II Flow Cytometer	BD
Brilliant Violet 510 anti-human CD8a Antibody	BioLegend	301048	Clone RPA-T8
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	nacalai tesque	14249-95	500 mL
Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes	STEMCELL Technologies	352058	5 mL
FcR Blocking Reagent, human	Miltenyi Biotec	130-059-901	2 mL
FLOWJO	BD
Gibco Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher Scientific	12676029	500 mL
Mouse IgG1 monoclonal - Isotype control	abcam	ab81200
Mouse monoclonal Anti-Human IgG4 Fc	abcam	ab99825	Clone HP6025
Pacific Blue Mouse Anti-Human CD3	BD	558117	Clone UCHT1
PE-Cy7 Mouse anti-Human CD279 (PD-1)	BD	561272	Clone EH12.1
PE-Cy7 Mouse IgG1 κ Isotype Control	BD	557646