말초 혈액 한 방울에서 파생 된 T 세포에 바인딩된 PD-1 차단 항체 모니터링

요약

우리는 암 환자에게서 말초 혈액의 단지 한 방울을 요구하는 T 세포에 PD-1-차단 항체의 결합을 평가하기 위한 간단한 유동 세포 분석분석서를 개발했습니다.

초록

PD-1-차단 항체를 포함한 면역 체크포인트 억제제는 다양한 유형의 암에서 치료 결과를 크게 개선했습니다. 이 면역 요법의 약리학적 인 효능은 오래 지속되며 지속적인 혈중 농도로 인해 주사 중단을 넘어서도 연장됩니다. 여기서 우리는 PD-1-차단 항체 니볼루맙 및 펨브롤리주맙의 T 세포 결합 상태를 평가하기 위한 간단한 유동 세포 분석기를 개발했다. 포도당 검사같이, 이 분석실험은 말초 혈액의 단지 1 방울을 요구합니다. T 세포에 결합하는 항체를 시각화하는 것은 항체 혈중 농도를 측정하는 것보다 더 신뢰할 수 있습니다. 추가적으로, 필요한 경우에, 우리는 잠재적으로 PD-1-차단 항체에 묶인 T 세포에 많은 특유한 면역 관련 마커를 분석할 수 있습니다. 따라서, 이것은 암 환자에서 PD-1-차단 항체의 약리효과를 분석하기 위한 간단하고 최소침습적인 전략이다.

서문

PD-1-차단 항체는 비소세포 폐암(NSCLC)^1,2,3,4를포함하는 다양한 유형의 암치료를 위한 표준 선택이 되고 있다. 그(것)들은 전통적인 세포 독성 화학요법에 반응하지 않은 암 환자의 부분 집합에 있는 현저한 치료 효력을 보여줍니다. 그러나, PD-1-차단 항체를 포함하는 면역 체크포인트 억제제(ICIs)는, 면역 관련 부작용(irAEs)이라고 불리는 특이적 스펙트럼의 독특하고 뚜렷한 스펙트럼을 유발할 수^{있다 5.} irAEs는 거의 모든 조직에 영향을 미칠 수 있지만, 그들은 가장 일반적으로 위장관에서 관찰, 내분비 땀샘, 피부, 간, 그들은 소양증을 일으킬 수 있습니다, 발진, 구역질, 설사, 및 갑상선 질환^6,7. 일반적으로 대부분의 iAEs는 ICI가 발생한 후 1~2개월 이내에 나타납니다. 그러나, 어떤 경우에는, 그(것)들은 처리의 시작 후에 1 년 이상 또는 처리^중단후에^6,7후에 생길 수 있습니다 . 그(것)들은 또한 그밖 병리에서 구별하기 어려울 지도 모르다 각종 현상을 일으키는 원인이 됩니다. 따라서 iAE를 신속하게 진단하고 적절하게 치료하는 것이 어려울 수 있습니다. irAEs는 모든 조직에 영향을 미칠 수 있고, 그들의 개시는 강하게 PD-1-차단 항체에 묶인 면역 세포, 특히 T 세포를 순환에 의해 영향을 받습니다. 따라서 항체 표적 T 세포를 모니터링하는 간단하고 최소 침습적인 방법은 임상 설정에서 중요하다.

여기에서, 우리는 니볼루맙 또는 펨브롤리주맙을 수신한 암 환자에게서 말초 전혈의 한 방울을 사용하여 T 세포에 PD-1-차단 항체의 결합을 평가하는 간단한 방법을 개발했습니다. 이러한 접근법을 사용하여, 우리는 1) T 세포에 결합하는 항체의 지속 시간, 2) 치료 항체에 의한 T 세포 PD-1 분자의 점유, 3) T 세포의 활성화 상태 및 면역학적 특징을 각각 모니터링할 수 있었다. 이 방법은 이전에 보고된 기술^8의수정입니다. 필요한 혈액의 양은 포도당 검사에 필요한 것과 거의 동일하며, 접근법은 단핵 세포 농축 또는 PD-1-차단 항체와의 공동 배양을 필요로 하지 않는다. 우리는 이 방법이 또한 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 및 흉막 삼출액, 심낭 삼출액, 기관지 정맥 세척액 및 뇌척수액에서 세포를 포함하여 동결 된 샘플을 사용하여 수행 될 수 있음을 확인, 이 전략은 다센터 연구의 맥락에서 유용 할 수 있음을 시사. 이 방법은 iAEs의 조기 진단을 용이하게 할 수 있고, 또한 그들의 증상을 통제하고 PD-1 억제제 후에 후속 치료를 개시하기 위한 최적의 시간을 식별하는 적절한 면역 억제 치료를 결정하는 데 도움이 될 수 있다.

프로토콜

샘플링은 일상적인 임상 절차 동안 수행되었다. 모든 인간 샘플은 헬싱키 선언에 따라, 일본 오사카 대학(15383 및 752)의 윤리검토위원회의 승인을 받아 피험자가 제공한 동의를 얻은 후 얻어졌습니다.

1. 전혈 샘플 준비 및 염색

1. 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA)을 포함하는 혈액 수집 튜브로 전체 혈액 샘플을 수집합니다.
   참고: 혈액 수집은 일반 바늘 이나 혈액 랜싯을 사용 하 여 수행할 수 있습니다.
2. 전혈 샘플 20 μL을 5 mL 바닥 폴리스티렌 유동 세포 분석 튜브로 옮김.
   참고 : 튜브에 대한 세포의 비 특이적 결합을 줄이기 위해 인산염 완충 식염수 (PBS)에서 2 % 태아 소 혈청 (FBS)의 1 mL을 튜브에 첨가하고 샘플에 적용하기 전에 10 s 동안 소용돌이를 제거합니다.
3. PBS에 2% FBS의 20 μL을 추가합니다.
4. 10 μL의 인간 전용 FcR 차단 시약을 추가합니다. 잘 섞어서 실온에서 15분 동안 배양합니다.
5. 적혈구 리시스 완충액 500 μL을 추가합니다. 잘 섞어서 실온에서 10분 동안 배양합니다.
6. PBS에 2% FBS 의 4 mL을 추가하고 4 °C에서 5 분 동안 400 x g (1,500 rpm)에서 세포를 스핀 다운하십시오. 포부로 상급을 제거하십시오.
7. 1.6단계에서 설명한 세척 및 흡인 과정을 반복한다.
8. PBS에서 2% FBS의 100 μL에서 세포를 다시 중단하고 각각 50 μL의 2개의 튜브로 나눕니다.
9. 표면 마커 항체를 추가합니다(표1). 잘 섞어서 어둠 속에서 실온에서 20 분 동안 배양하십시오.
   참고: T 세포 면역 상태를 프로파일링할 때, 마커의 수는 유세포 측정 기계 품질에 기초하여 증가될 수 있다.
10. 1.6단계에서 설명한 대로 샘플을 2x 세척합니다.
11. PBS에서 2% FBS의 200 μL에서 세포를 다시 중단합니다.

2. 유동 세포 측정 분석

1. 유세포계에 튜브를 삽입하고 기본적으로 권장 프로토콜^9에따라 세포를 획득합니다.
2. 10,000개의 이벤트를 림프구 게이트(그림1A)로기록하고 분석을 위해 .fcs 파일로 흐름 데이터를 내보냅니다.
3. 분석 소프트웨어에서 파일을 엽니다. 전방 산란(FSC) (A) 대 측면 산란(SSC) (A) 플롯 및 게이트 림프구(도1A)에서세포를 시각화한다.
4. FSC (H) 대 FSC (H) 및 SSC (H) 대 SSC(W) (그림 1B)를사용하여 단일 셀을 선택하고 CD3 대 CD8 또는 CD3 대 CD4 플롯에 표시한 후, CD8 T 셀 및 CD4 T 셀을 각각 게이트(그림 1C).
5. 게이트 된 세포를 선택하고 PD-1 대 인간 IgG4 플롯에 표시 한 후, PD-1-차단 항체 바인딩 CD8 및 CD4 T 세포를 이소타입 제어에 기초하여 식별합니다(그림 1D).

결과

게이팅 전략 및 유세포분석분석(도1)은NSCLC 환자 말초 혈액의 한 방울로부터 수득된 T 세포에 결합하는 PD-1-차단 항체를 검출할 수 있다. PD-1-차단 항체가 투여되기 전에, 인간 IgG4 양성 CD8 또는 CD4 T 세포가 존재하지 않으며, PD-1-검출 항체(EH12.1)에 의해 PD-1 발현이 확인될 수있다(그림 2A). 니볼루맙 또는 펨브롤리주맙 투여 후, IgG4(니볼루맙, ?...

토론

이 기사에서는, 우리는 우리가 원래 nivolumab 검출을 위해 개발한 말초 혈액의 한 방울에서 파생된 T 세포에 결합된 PD-1-차단 항체를 검출하기 위하여 유세포계를 이용한 방법을 보고합니다^10. 이 기술은 매우 간단하고 수행하기 쉽지만 정확한 결과를 얻으려면 두 가지 중요한 사항을 주목해야합니다. 하나는 PD-1 분자를 검출하기 위해 니볼루맙 및 펨브롤리주맙과 경쟁하는 적절한 ...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
10X RBC Lysis Buffer (Multi-species)	Thermo Fisher Scientific	00-4300-54	50 mL
APC/Cyanine7 anti-human CD4 Antibody	BioLegend	300518	Clone RPA-T4
BD FACS Canto II Flow Cytometer	BD
Brilliant Violet 510 anti-human CD8a Antibody	BioLegend	301048	Clone RPA-T8
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	nacalai tesque	14249-95	500 mL
Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes	STEMCELL Technologies	352058	5 mL
FcR Blocking Reagent, human	Miltenyi Biotec	130-059-901	2 mL
FLOWJO	BD
Gibco Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher Scientific	12676029	500 mL
Mouse IgG1 monoclonal - Isotype control	abcam	ab81200
Mouse monoclonal Anti-Human IgG4 Fc	abcam	ab99825	Clone HP6025
Pacific Blue Mouse Anti-Human CD3	BD	558117	Clone UCHT1
PE-Cy7 Mouse anti-Human CD279 (PD-1)	BD	561272	Clone EH12.1
PE-Cy7 Mouse IgG1 κ Isotype Control	BD	557646