JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

تتطلب أعاده برمجه الخلايا إدخال الجينات الرئيسية ، التي تنظم وتحافظ علي حاله الخلايا المستحثة. البروتوكول الموصوف يمكن تشكيل الخلايا الجذعية مستحث المستحثة (iPSCs) مستعمرات من الليفية الجلدية البشرية دون أساليب الفيروسية/دمج ولكن باستخدام RNAs غير المعدلة (نانومتر-RNAs) جنبا إلى جنب مع عوامل التهرب المناعي الحد من أليات الدفاع الخلوي.

Abstract

ويمكن اعتبار الخلايا الجذعية مستحث المستحثة (iPSCs) ، حتى الآن ، مصدرا واعدا للخلايا المستحثة لأداره الامراض غير القابلة للعلاج حاليا ، ولأعاده تشكيل الانسجه المصابة وتجديدها ، ولتطوير ادويه جديده. علي الرغم من جميع المزايا المتعلقة باستخدام iPSCs ، مثل انخفاض خطر الرفض ، والقضايا الاخلاقيه التي قللت ، وامكانيه الحصول عليها من كل من المرضي الصغار والكبار دون اي فرق في امكانيه أعاده برمجتها ، ومشاكل للتغلب علي لا تزال عديده. في الواقع ، يمكن أعاده برمجه الخلايا التي أجريت مع فيروسات الفيروسية ودمج تسبب العدوى وإدخال الجينات المطلوبة يمكن ان تحفز عدم الاستقرار الجينوم من الخلية المتلقية ، مما يعوق استخدامها في العيادة. علي وجه الخصوص ، هناك العديد من المخاوف بشان استخدام الجينات c-Myc ، والمعروفة من عده دراسات لنشاطها حفز الطفرة. وقد برزت الخلايا الليفية كالسكان الخلية مناسبه لأعاده برمجه الخلوية لأنها سهله لعزل والثقافة ويتم حصادها بواسطة خزعة الجلد الطفيفة الغازية لكمه. البروتوكول الموصوف هنا يوفر وصف مفصل خطوه بخطوه للاجراء بأكمله ، من معالجه العينة للحصول علي ثقافات الخلايا ، واختيار الكواشف واللوازم ، والتنظيف والاعداد ، إلى أعاده برمجه الخلية بواسطة وسائل تجاريه مجموعه أعاده البرمجة المستندة إلى RNAs (NM-RNAs) غير المعدلة. مجموعه أعاده برمجه المختار يسمح لأعاده برمجه فعاله من الخلايا الليفية الجلدية البشرية إلى iPSCs والمستعمرات الصغيرة يمكن ان ينظر اليها في وقت مبكر 24 ح بعد الانتقال الأول ، حتى مع التعديلات مع الاحترام لورقه البيانات القياسية. الاجراء أعاده برمجه المستخدمة في هذا البروتوكول يوفر ميزه أعاده برمجه أمنه, دون مخاطر العدوى الناجمة عن الأساليب الفيروسية القائمة علي ناقلات, يقلل من أليات الدفاع الخلوية, ويسمح للجيل من iPSCs خاليه من xeno, جميع الميزات الهامه التي إلزاميه لمزيد من التطبيقات السريرية.

Introduction

وتمثل أعاده برمجه الخلايا تكنولوجيا جديده لتحويل كل خليه جسديه من الجسم إلى خليه جذعيه مستحثه ، تعرف باسم iPSC1. وقد تغلبت امكانيه أعاده برمجه خليه جسديه بالغه إلى دوله مستحثه وغير متمايزة علي الحدود التي يفرضها الفقراء علي التوافر والمسائل الاخلاقيه المتصلة باستخدام الخلايا المستحثة ، والتي كانت في السابقحيد عنه فقطمن الاجنه البشرية (الخلايا الجذعية الجنينية أوESC). في 2006 ، اجري كازوتوشي تاكاهاشي وشينيا ياماناكا دراسة رائده لتحقيق أول تحويل للخلايا الجسدية البالغة من الجلد إلى خلايا مستحثه باضافه أربعه جينات محدده بشكل مصطنع (Oct4 ، Sox2 ، Klf4 ، c-Myc)5. وبعد عام ، ادي العمل الذي اجري في مختبر طومسون إلى أعاده برمجه ناجحه للخلايا الجسدية في iPSCs عن طريق توصيل مزيج مختلف من أربعه جينات (Oct4, Sox2, Nanog, Lin28)6.

تقدم iPSCs عددا من الفرص للعلماء والباحثين من مختلف المجالات ، مثل الطب التجديدي وعلم الصيدلة ، كونها منصة ممتازة لدراسة وعلاج الامراض المختلفة جنبا إلى جانب انعكاس التنميط الجيني لخصائص المريض التي تستمد منها. استخدام iPSCs يوفر العديد من المزايا بما في ذلك: انخفاض خطر الاستجابة المناعية بسبب أصل ذاتي تماما من الخلايا. امكانيه إنشاء مكتبه خليه ، أداه هامه للتنبؤ بالاستجابة للعقاقير الجديدة وأثارها الجانبية ، لأنها قادره علي التجديد الذاتي باستمرار وتوليد أنواع مختلفه من الخلايا ؛ والفرصة لوضع نهج مخصص لأداره المخدرات7،8،9.

تقنيات متنوعة معروفه في الوقت الحاضر ، للحث علي التعبير عن عوامل أعاده برمجه وانها مدرجه في فئتين رئيسيتين: الطرق غير الفيروسية والفيروسية القائمة علي ناقلات الامراض10،11،12،13. وتشمل الطرق غير الفيروسية نقل mrna ، ميرنا العدوى/ترانسكشن ، الحاملة ، النواقل الصغيرة والبلازميدات الفرجين و exosomes10،11،12،13. وتشمل الأساليب القائمة علي الفيروسية الفيروسات غير المدمجة ، مثل فيروس الغدة الدرقية ، وحمي سينداي والبروتينات ، ودمج الفيروسات مثل الفيروسات الرجعية و لينتيفيروس10،11،12،13.

وفقا لعده دراسات ، لم يلاحظ اي اختلافات كبيره بين هذه الطرق من حيث فعاليه أعاده برمجه الخلية ، التالي ، فان اختيار الطريقة المناسبة يعتمد بدقه علي نوع الخلية المستخدمة وعلي التطبيقات اللاحقة من ipscs التي تم الحصول عليها14،15. جميع الطرق المذكورة تظهر مساوئ, علي سبيل المثال, فيروس سينداي فعاله علي جميع أنواع الخلايا, ولكن يتطلب الكثير من الممرات للحصول علي iPSCs; أعاده برمجه من قبل الابيسمات ممتازة لخلايا الدم ولكن يحتاج إلى تعديل ظروف الثقافة القياسية للخلايا الليفية. يمكن ان تمثل طريقه الدخول بديلا جذابا ولكن الدراسات في الخلايا البشرية لا تزال محدوده وضعيفه10،11،12،13. التماثيل هي الحويصلات النانويه يفرز فسيولوجيا في جميع سوائل الجسم عن طريق الخلايا. ووفقا للدراسات الاخيره ، فهي مسؤوله عن الاتصالات بين الخلايا ويمكن ان يكون لها دور في العمليات البيولوجية الهامه ، مثل تكاثر الخلايا والهجرة والتمايز. Exosomes يمكن نقل ونقل mRNA وميرنا إلى الخلايا المتلقية مع اليه طبيعيه تماما ، كما انها تشترك في تكوين نفس الغشاء الخلوي16. ولذلك ، exosomes هي تقنيه جيل جديد واعده لأعاده برمجه ، ولكن قدرتها علي أعاده برمجه الخلايا الجسدية من محتواها لا يزال قيد التحقيق. تستخدم الأساليب القائمة علي النواقل الفيروسية الفيروسات المعدلة من أجل نقل الجينات أعاده برمجه إلى الخلايا المتلقية. هذا الأسلوب, علي الرغم من كفاءه عاليه من أعاده برمجه, لا تعتبر أمنه, كما ان دمج الفيروس داخل الخلية يمكن ان تكون مسؤوله عن العدوى, التراتومه وعدم الاستقرار الجينوم17.

البروتوكول التالي لتوليد مستعمرات iPSCs يجمع بين الكوكتيل في ياماناكا وأعاده برمجه طومسون ويستند علي استخدام طريقه تتطلب نانومتر-RNAs وعوامل التهرب المناعي مع امكانيه تنفيذ ذلك في ظروف خاليه من xeno. الأساس المنطقي وراء استخدام هذه الطريقة هو لنشر ، داخل المجتمع العلمي ، بروتوكول السماح لأعاده برمجه سريعة وبسيطه وفعاله للغاية من الخلايا الليفية البشرية الكبار من جلد البطن إلى iPSCs18.

نقاط القوه في الطريقة المقترحة هي ، في الواقع ، سهوله الأداء والوقت القصير اللازم للحصول علي iPSCs. وعلاوة علي ذلك ، فان الطريقة تتجنب أليات الدفاع الخلوي واستخدام النواقل الفيروسية ، المسؤولة عن القضايا ذات الصلة.

وفيما يتعلق بالبروتوكول الموحد ، أجريت التعديلات التالية: (1) تمت مزامنة متموج الخلايا الليفية في مرور 4 من خلال وضع في المصل 0.1 ٪ ل 48 h قبل التريسينزيشن ؛ (2) تم تعديل الكثافة الخلوية للثقافة وحجم الكواشف للاستخدام علي لوحه متعددة الآبار 24 جيدا بدلا من لوحه 6-حسنا ؛ (3) تم تنفيذ تجربه أعاده برمجه باستخدام حاضنه 5 ٪ CO2 بدلا من حاضنه مع الغلاف الجوي (21 ٪ o2) أو نقص الأكسجين (5 ٪ س2) الشروط.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

تم جمع العينات من الانسجه البشرية وفقا لإعلان هلسنكي في حين مراقبه مستشفي جامعه فيديريكو الثاني المبادئ التوجيهية. وقدم جميع المرضي المشاركين في هذه الدراسة موافقه خطيه.

1. اعداد اللوازم والاعلام الثقافي

  1. تنظيف والاوتوكلاف واحد زوج كبير من مقص الجراحية ، ومجموعتين من الملقط غرامه ، واثنين من أزواج من مقص ميكروتشريح ، 1 لتر زجاجه معقمه ، 500 mL زجاجه معقمه ، وزجاجه معقمه 250 mL.
  2. اعداد 100 مم لوحات ، 60 مم لوحات ، 35 ملم لوحات ، القابل للتصرف المستغل ، 50 mL أنابيب معقمه ، 15 مل أنابيب معقمه ، ولوحه زجاجيه 100 مم. خزن الاداات في ظروف معقمه حتى تصبح جاهزه للاستعمال.
  3. تنظيف وتعقيم 22 مم × 22 مم غطاء النظارات قبل الاستخدام. لهذا ، وضع نظارات الغطاء في لوحه زجاجيه ، وتغطيتها مع 70 ٪ الايثانول والانتظار لبضع ثوان قبل الشفط الايثانول. دعوانا نغطي النظارات الجافة في الفرن عند 37 درجه مئوية ثم الاوتوكلافها.
  4. أعد 1 لتر من محلول الملح المتوازن من هانك (HBSS) عند 7.4 درجه الحموضة عن طريق أذابه الأملاح المسحوقة المتوفرة تجاريا في الماء المعقم المقطر المزدوج وأضافه 0.35 غرام من بيكربونات الصوديوم. تعقيم عن طريق الترشيح تحت غطاء محرك العقيمة وتخزين في + 4 ° c حتى استخدام.
  5. اعداد 500 مل من الفوسفات 1x معقمه-مخزنه-المالحة (تلفزيوني) عن طريق تذويب 0.1 غرام من فوسفات البوتاسيوم أحادي ، 0.1 غرام من كلوريد البوتاسيوم ، 4.0 غرام من كلوريد الصوديوم و 0.575 غرام من فوسفات الصوديوم ثنائي فوسفات في المياه المقطرة المزدوجة المعقمة. تحقق من قيمه الأس الهيدروجيني (7.4) وتعقيم تحت غطاء محرك العقيمة عن طريق الترشيح. يخزن عند + 4 درجه مئوية حتى يتم استخدامه.
  6. اعداد 50 مل من الحل التوقف التريبسين (خدمات المرفق التقني) عن طريق أضافه 5 مل من 10 ٪ الجنين البقري المصل (الدم) إلى 45 مل من HBSS تحت غطاء محرك العقيمة. يخزن عند + 4 درجه مئوية حتى يتم استخدامه.
  7. اعداد المتوسطة النسر دولبيكو المعدلة للعزل الليفي (I-DMEM) باستخدام 250 مل من المتوسط النسر دولبيكو المعدلة (DMEM) تستكمل مع 10 ٪ والبنسلين 0.5 ٪ و ستربتومايسين (القلم/بكتيريا) تحت غطاء محرك معقم. يخزن عند + 4 درجه مئوية حتى يتم استخدامه.
  8. اعداد DMEM للمزامنة الخلايا الليفية (S-DMEM) باستخدام 250 mL من DMEM تستكمل مع 0.1 ٪ والقلم 0.5 ٪/بكتيريا تحت غطاء محرك العقيمة. يخزن عند + 4 درجه مئوية حتى يتم استخدامه.

2. عزل الخلايا الليفية الجلدية البشرية

ملاحظه: يجب اجراء الخطوات 2.1 إلى 2.3 المذكورة أدناه تحت غطاء محرك معقم. عينه اسطوانيه قياس حوالي 0.8 سم في قطر غله 2 × 106 الخلايا الليفية في الممر 1.

  1. اغسل العينة التي تم الحصول عليها حديثا من الجلد البشري من البطن في طبق 100 مم مع محلول HBSS. يهز بلطف لأزاله الدم والسوائل البيولوجية الأخرى. كرر الخطوة ثلاث مرات ، وتغيير الحل HBSS ولوحه في كل غسل.
  2. ضع العينة في لوحه 100 مم ، وأزاله الشعر والدهون باستخدام ملقط ومقص غرامه ، وتشريحها بمشرط للحصول علي 2 مم × 1 مم شظايا (لما مجموعه 16 شظايا) تجنب الندوب ، القذرة (علي سبيل المثال ، نتيجة للرسومات مع القلم dermographic) أو حرق المناطق من الانسجه.
  3. ضع 4 أجزاء صغيره في كل طبق 35 مم ، غطه بغطاء زجاجي معقم 22 مم × 22 مم. ضبط بواسطة وسائل الملقط الناعم. أضافه 1.5 mL من I-DMEM.
  4. احتضان لوحات في 37 درجه مئوية في 5 ٪ CO2 لمده 15 يوما أو حتى تصل الخلايا 85% التقاء. تغيير متوسط الثقافة كل 3 أيام والتحقق من نمو الخلايا باستخدام المجهر النقيض من المرحلة المقلوبة يوميا.

3. التوسع في الخلايا الليفية الجلد البشري

ملاحظه: يجب ان يتم تنفيذ الخطوات المذكورة أدناه تحت غطاء محرك معقم باستثناء الخطوات التي تم تنفيذها في الحاضنة.

  1. رفع نظارات الغطاء مع ملقط غرامه ، وضعها راسا علي عقب في صحن 1 100 مم ويغسل مع 1x العقيمة تلفزيوني.
  2. أزاله شظايا من العينات وتجاهلها ، وغسل لوحات مع 1x العقيمة تلفزيوني.
  3. أزاله 1x التلفزيونية وأضافه 3 مل و 1 مل من تريبسين-أدتا (حمض ايثيلنديدياتيتاياستيك) لتغطيه النظارات وضعت في صحن 100 mm و 35 mm الاطباق ، علي التوالي. احتضان لمده 5 دقائق في 37 درجه مئوية مع 5 ٪ CO2.
  4. منع التريسينزيشن عن طريق أضافه 5 مل من خدمات المرفق التقني إلى طبق 100 مم و 2 مل من خدمات المرفقات لكل طبق 35 ملم. جمع تعليق في أنابيب معقمه 15 مل ، الطرد المركزي في 400 x g في 4 درجه مئوية لمده 5 دقائق.
  5. يستنشق ماده طافي وأعاده تعليق بيليه في 12 مل من I-dmem. تقسيم تعليق الخلية إلى 3 مل قسامات لكل لوحه 60 mm.
  6. احتضان في 37 درجه مئوية مع 5 ٪ CO2. تغيير المتوسطة يوميا. الحفاظ علي الخلايا في الثقافة حتى تصل إلى التقاء 75 ٪.
  7. يستنشق المتوسطة من لوحات ويغسل بسرعة في 1x تلفزيوني.
  8. تكرار التريسينزيشن (الخطوات 3.3 و 3.4) ثلاث مرات للحصول علي الخلايا في مرور 4. استخدام 1.5 مل من تريبسين-أدتا و 3 مل من خدمات المرفقات في كل طبق 60 مم. تقسيم الخلايا 1:3.
  9. مزامنة الخلايا عن طريق استبدال I-DMEM مع S-DMEM واحتضان ل 48 h في 37 درجه مئوية مع 5 ٪ CO2.
  10. اعداد ما يلي (اثناء مزامنة الخلية).
    1. اعداد الخلايا الليفية التوسع المتوسطة عن طريق أضافه 5.0 mL من 0.5 ml من L-الجلوتامين إلى 44.5 mL من DMEM المتقدمة (ا-DMEM) ، مخزن في + 4 ° c.
    2. اعداد مجموع NM-RNA-أعاده برمجه كوكتيل لأعاده برمجه الخلايا الليفية من خلال الجمع بين ما يلي في كل من 9 أنابيب معقمه RNase خاليه: 32 μL من OSKMNL NM-RNA ، 24 μL من EKB NM-RNA ، 5.6 μL من NM-ميكرورناس (61.6 μL الحجم النهائي ل 9 aliquots).
    3. تقسيم كل أنبوب من 61.6 μl من إجمالي NM-RNA-أعاده برمجه كوكتيل ل الخلايا الليفية أعاده برمجه إلى أربعه 15.4 μl واحد--استخدام قسامات في العقيمة ، أنابيب خاليه rnase وتخزين في-80 درجه مئوية (15.4 μl الحجم النهائي ل 36 قسامات).

4. أعاده برمجه الخلايا الليفية الجلدية إلى iPSCs

  1. اليوم العاشر: بذر الخلايا
    ملاحظه: يجب تنفيذ الخطوات 4-1-1 إلى 4-1-3 و 4.1.8 ل4.1.9 تحت غطاء معقم. مصفوفة غشاء القبو (BMM) الهلام بسرعة في درجه حرارة الغرفة. ولذلك ، فانه ينصح بشده لذوبان BMM بين عشيه وضحيها علي الجليد في الثلاجة ، وتمييع مع الجليد الباردة خاليه من المصل واستخدام الpipetsات المبردة مسبقا ، ونصائح ، وأنابيب.
    1. اعداد لوحه 24 بئر عن طريق طلاء كل بئر مع 100 μL من BMM واحتضان لمده 1 ساعة علي الأقل في 37 درجه مئوية قبل بذر الخلايا.
    2. يستنشق المتوسطة من لوحات مع الخلايا في الثقافة ويغسل بسرعة في 1x تلفزيوني.
    3. تكرار التريسينزيشن (الخطوات 3.3 و 3.4) للحصول علي الخلايا في مرور 5. يستنشق ماده طافي وأعاده تعليق بيليه في حجم مناسب من الخلايا الليفية توسيع المتوسطة (انظر الخطوة 3.10).
    4. اعداد وتنظيف الكريات البيضاء مع 70 ٪ الكحول.
    5. اعداد حل عن طريق خلط بلطف 10 ميكرولتر من التريبين الأزرق و 10 ميكرولتر من تعليق الخلية في أنبوب 1.5 mL ، واحتضان لمده 1-2 دقيقه في درجه حرارة الغرفة. يجب الحرص علي عدم احتضان أطول من 5 دقائق.
    6. ماصه 10 μL من المحلول في الكيس النصفي وضعه علي المرحلة من المجهر النقيض المرحلة المقلوبة للعد. الخلايا غير القابلة للحياة ستكون زرقاء ، في حين ان الخلايا القابلة للحياة ستكون غير ملطخه.
    7. عد الخلايا في 2 الساحات علي الأقل من غرفه الكريات الدموية. تطبيق الحساب التالي للحصول علي العدد الإجمالي للخلايا:
      العدد الإجمالي للخلايا = (العدد الإجمالي للخلايا المحسوبة/العدد المربع) × 2 × 10 × الحجم الكلي لتعليق الخلية
    8. اجراء تخفيف للحصول علي كثافة 2.5 x 104 خليه لكل 500 μl من الخلايا الليفية التوسع المتوسطة ، استنادا إلى العدد الإجمالي للخلايا عد. أعاده تعليق بيليه في حجم مناسب من الخلايا الليفية التوسع المتوسط.
    9. ماصه 500 μL من تعليق الخلية في كل بئر من لوحه 24 بئر. احتضان الخلايا بين عشيه وضحيها في 37 درجه مئوية و 5 ٪ CO2.
  2. اليوم الأول: العبور
    ملاحظه: يجب تنظيف جميع أسطح العمل واللوازم (علي سبيل المثال ، القفازات ، الزجاجات ، أسطح الغطاء المعقم ، الماصات) باستخدام كاشف التنظيف لأزاله RNase قبل بدء الاجراء. تنفيذ الخطوات 4.2.2 ، 4.2.4-4.2.8 تحت غطاء محرك معقم.
    1. الإحماء xeno خاليه ، مصل خاليه ، عامل النمو المنخفض الإنسان ESC/iPSC الثقافة المتوسطة (XF/FF الثقافة المتوسطة) في 37 درجه مئوية حمام المياه.
    2. أزاله المتوسطة القديمة من كل بئر واستبدالها مع 500 μL من المتوسطة مسبقا الحرارة XF/FF الثقافية.
    3. احتضان في 37 درجه مئوية تحت 5 ٪ CO2 لمده 6 ساعات علي الأقل.
    4. ذوبان خمسه 15.4 μl القسامات من إجمالي NM-RNA أعاده برمجه كوكتيل في درجه حرارة الغرفة ثم وضعه علي الجليد.
    5. أضف 234.6 μL من وسط المصل المخفض إلى كل من المحلول الهضمي ، ماصه برفق 3 – 5 مرات وتسميه كل واحده كانبوب A (الحمض الريبي النيبالي + المصل المنخفض المتوسط).
    6. التسمية 5 معقمه ، RNase-أنابيب 0.5 mL الحرة كما أنبوب B ومزيج 6 μl من الاصطناعية سيرنا كاشف النقل مع 244 μl من المتوسط المصل المنخفضة (الحمض الريبي النيبالي-ترانسفيكشن الكاشف + انخفاض المصل المتوسطة).
    7. أضافه محتويات كل أنبوب B إلى أنبوب A قطره (للحصول علي 500 μL الحجم النهائي للحل المعقدة التحويل الأحادي الحمض الريبي النيبالي). مزيج من خلال التنصت علي الجزء السفلي من الأنبوب. احتضان في درجه حرارة الغرفة لمده 15 دقيقه.
    8. أضافه 125 μl من NM-الحمض الريبي النيبالي الحل المعقدة من كل من القسامات الخمسة من 500 μl إلى 4 ابار (للوصول إلى ما مجموعه 20 الآبار) ، أماله لوحه والأنابيب القطرات في الوسط. اخلطه برفق بالاهتزاز. استخدم الآبار الاربعه المتبقية كمرجع.
    9. احتضان ل 15 ح في 37 درجه مئوية ، 5 ٪ CO2.
  3. اليوم الثاني – الرابع: إكمال عمليه التحويل
    1. يستنشق الوسط. كرر اجراء التحويل كما في اليوم الأول تحت غطاء المحرك المعقم.
  4. اليوم 5 – 10: التغييرات الاعلاميه
    1. يستنشق المتوسطة والتبادل مع الطازجة, قبل الحرارة XF/FF الثقافة المتوسطة تحت غطاء محرك السيارة العقيمة.
    2. احتضان بين عشيه وضحيها في 37 درجه مئوية ، 5 ٪ CO2.
    3. الحفاظ علي الثقافة حتى مراقبه تشكيل المستعمرات iPSC رصد يوميا من قبل المجهر علي النقيض من المرحلة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

وكان الهدف من هذا البروتوكول هو أعاده برمجه الخلايا الليفية الجلدية المعزولة عن جلد البطن باستخدام طريقه البرمجة غير المدمجة التي تعتمد علي NM-RNAs للحث علي التعبير عن عوامل محدده. لتحقيق هذا الهدف ، تم عزل الخلايا الليفية الجلدية البشرية من عينات الجلد من المرضي الذين يخضعون لجراحه شد البط?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

ipscs الناشئة بسرعة كمرشح الخلية الواعدة للتطبيقات الطب التجديدي وكاداه مفيده للغاية لنمذجة الامراض واختبار المخدرات3,8. يصف البروتوكول المعروض هنا توليد iPSCs البشرية من عينه لها حجم خزعة الجلد لكمه مع اجراء بسيط وفعال لا يتطلب اي معدات محدده أو خبره سابقه مع أ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.

Acknowledgements

ولم اعلامات صاحبا البلاغ.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
10 mL serological pipetFalcon357551Sterile, polystyrene
100 mm platesFalcon351029Treated, sterile cell culture dish
15 mL sterile tubesFalcon352097Centrifuge sterile tubes, polypropylene
24-well platesFalcon353935Clear, flat bottom, treated multiwell cell culture plate, with lid, sterile
25 mL serological pipetFalcon357525Sterile, polystyrene
35 mm platesFalcon353001Treated, sterile cell culture dish
5 mL serological pipetFalcon357543Sterile, polystyrene
50 mL sterile tubesFalcon352098Centrifuge sterile tubes, polypropylene
Advanced DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)Gibco12491-015Store at 2-8 °C; avoid exposure to light
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)Sigma- AldrichD6429-500mlStore at 2-8 °C; avoid exposure to light
Fetal Bovine SerumSigma- AldrichF9665-500mlStore at -20 °C. The serum should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles
Hank's Balanced Salt SolutionSigma- AldrichH1387-1LPowder
L-glutamineLonzaBE17-605EStore at -20 °C. It should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles
Lipofectamine RNAiMAX Transfection ReagentINVITROGEN13778-030Synthetic siRNA Transfection Reagent; store at 2-8 °C
MatrigelCORNING354234Basement Membrane Matrix, store at -20 °C. Avoid multiple freeze-thaws.
Neubauer ChamberVWR631-1116Hemocytometer
NutriStem XF Culture MediumBiological Industries05-100-1A-500mlXeno-free, serum-free, low growth factor human ESC/iPSC culture medium. Store at -20 °C. Upon thawing, the medium may be stored at 2-8 °C for 14 days. Media should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles.
Opti-MEMGibco31985-062-100mlReduced-Serum Medium; store at 2-8 °C; avoid exposure to light
Penicillin and StreptomycinSigma- AldrichP4333-100mlStore at -20 °C. The solution should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles
Potassium ChlorideSigma- AldrichP9333Powder
Potassium Phosphate MonobasicSigma- AldrichP5665Powder
RNase-free 0.5 mL tubesEppendorfH0030124537RNase-free sterile, microfuge tubes, polypropylene
RNase-free 1.5 mL tubesEppendorfH0030120086RNase-free sterile, microfuge tubes, polypropylene
RNaseZAPINVITROGENAM9780Cleaning agent for removing RNase
Sodium BicarbonateSigma- AldrichS5761Powder
Sodium ChlorideSigma- AldrichS7653Powder
Sodium Phosphate DibasicSigma- Aldrich94046Powder
StemRNA 3rd Gen Reprogramming KitReprocell00-0076Third Generation NM-RNAs-based Reprogramming Kit for Cellular Reprogramming of Fibroblasts, Blood, and Urine. Store at or below -70 °C.
Trypsin-EDTASigma- AldrichT4049-100mlStore at -20 °C. It should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles

References

  1. Lo, B., Parham, L. Ethical Issues in Stem Cell Research. Endocrine Reviews. 30 (3), 204-213 (2009).
  2. Wong, W. T., Sayed, N., Cooke, J. P. Induced Pluripotent Stem Cells: How They Will Change the Practice of Cardiovascular Medicine. Methodist Debakey Cardiovasc Journal. 9 (4), 206-209 (2013).
  3. Singh, V. K., Kalsan, M., Kumar, N., Saini, A., Chandra, R. Induced pluripotent stem cells: applications in regenerative medicine, disease modeling, and drug discovery. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 3, 2(2015).
  4. Zacharias, D. G., Nelson, T. J., Mueller, P. S., Hook, C. C. The science and ethics of induced pluripotency: what will become of embryonic stem cells. Mayo Clinic Proceedings. 86 (7), 634-640 (2011).
  5. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  6. Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).
  7. Yu, Y., Wang, X., Scott, L., Nyberg, S. L. Application of Induced Pluripotent Stem Cells in Liver Diseases. Journal Cell Medicine. 3 (3), 997-1017 (2014).
  8. Ebert, A. D., Liang, P., Wu, J. C. Induced pluripotent stem cells as a disease modeling and drug screening platform. Journal Cardiovascular Pharmacology. 60 (4), 408-416 (2012).
  9. Gupta, S., Sharma, V., Verma, R. S. Recent advances in induced pluripotent stem cell (ipsc) based therapeutics. Journal of Stem Cell Research and Therapy. 3 (3), 263-270 (2017).
  10. Andargie, A., Tadesse, F., Shibbiru, T. Review on Cell Reprogramming: Methods and Applications. Journal of Medicine, Physiology and Biophysics. 25, 2422(2016).
  11. Warren, L., et al. Highly efficient reprogramming to pluripotency and directed differentiation of human cells using synthetic modified mRNA. Cell Stem Cell. 7 (5), 618-630 (2010).
  12. Malik, N., Rao, M. R. A Review of the Methods for Human iPSC Derivation. Methods in Molecular Biology. 997, 23-33 (2013).
  13. Poleganov, M. A., et al. Efficient Reprogramming of Human Fibroblasts and Blood-Derived Endothelial Progenitor Cells Using Nonmodified RNA for Reprogramming and Immune Evasion. Human Gene Therapy. 26 (11), 751-766 (2015).
  14. Brouwer, M., Zhou, H., Kasri, N. N. Choices for Induction of Pluripotency: Recent Developments in Human Induced Pluripotent Stem Cell Reprogramming Strategies. Stem Cell Reviews and Reports. 12, 54-72 (2016).
  15. Revilla, A., et al. Current advances in the generation of human iPS cells: implications in cell-based regenerative medicine. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 10, 893-907 (2016).
  16. Lee, Y. S., et al. Exosome-Mediated Ultra-Effective Direct Conversion of Human Fibroblasts into Neural Progenitor-like Cells. ACS Nano. 12 (3), 2531-2538 (2018).
  17. Bayart, E., Cohen-Haguenauer, O. Technological overview of iPS induction from human adult somatic cells. Current Gene Therapy. 13 (2), 73-92 (2013).
  18. Sacco, A. M., et al. Diversity of dermal fibroblasts as major determinant of variability in cell reprogramming. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (6), 4256-4268 (2019).
  19. Shan, Z. Y., et al. Continuous passages accelerate the reprogramming of mouse induced pluripotent stem cells. Cellular Reprogramming. 16 (1), 77-83 (2014).
  20. Schlaeger, T. M., et al. A comparison of non-integrating reprogramming methods. Nature Biotechnology. 33 (1), 58-63 (2015).
  21. Drews, K., Tavernier, G., Demeester, J., et al. The cytotoxic and immunogenic hurdles associated with non-viral mRNA-mediated reprogramming of human fibroblasts. Biomaterials. 33, 4059-4068 (2012).
  22. Beissert, T., et al. Improvement of In Vivo Expression of Genes Delivered by Self-Amplifying RNA Using Vaccinia Virus Immune Evasion Proteins. Human Gene Therapy. 28 (12), 1138-1146 (2017).
  23. Mathieu, J., et al. Hypoxia induces re-entry of committed cells into pluripotency. Stem Cells. 31 (9), 1737-1748 (2013).
  24. Wang, Y., et al. Hypoxia Enhances Direct Reprogramming of Mouse Fibroblasts to Cardiomyocyte-Like Cells. Cellular Reprogramming. 18 (1), 1-7 (2016).
  25. Deng, Y., et al. Hypoxia enhances buffalo adipose-derived mesenchymal stem cells proliferation, stemness, and reprogramming into induced pluripotent stem cells. Journal of Cellular Physiology. 234 (10), 17254-17268 (2019).
  26. Karagiannis, P., et al. Induced Pluripotent Stem Cells and Their Use in Human Models of Disease and Development. Physiological Reviews. 99 (1), 79-114 (2019).
  27. Maherali, N., Hochedlinger, K. Guidelines and techniques for the generation of induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 3 (6), 595-605 (2008).
  28. Asprer, J. S., Lakshmipathy, U. Current methods and challenges in the comprehensive characterization of human pluripotent stem cells. Stem Cell Reviews and Reports. 11 (2), 357-372 (2015).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

155 iPSCs RNAs NM RNAs

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved