JoVE Logo
Autoren
Kontakt

Anmelden

Zum Anzeigen dieser Inhalte ist ein JoVE-Abonnement erforderlich. Melden Sie sich an oder starten Sie Ihre kostenlose Testversion.

In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Die Zellumprogrammierung erfordert die Einführung von Schlüsselgenen, die den pluripotenten Zellzustand regulieren und aufrechterhalten. Das beschriebene Protokoll ermöglicht die Bildung induzierter pluripotenter Stammzellen (iPSCs) aus menschlichen dermalen Fibroblasten ohne virale/integrierende Methoden, aber unter Verwendung nicht modifizierter RNAs (NM-RNAs) in Kombination mit Immunumgehungsfaktoren, die die zellulären Abwehrmechanismen reduzieren.

Zusammenfassung

Induzierte pluripotente Stammzellen (iPSCs) konnten bisher als vielversprechende Quelle pluripotenter Zellen für die Behandlung von derzeit unheilbaren Krankheiten, für die Rekonstitution und Regeneration von verletztem Gewebe und für die Entwicklung neuer Medikamente betrachtet werden. Trotz aller Vorteile im Zusammenhang mit der Verwendung von iPSCs, wie das geringe Risiko einer Ablehnung, die verringerten ethischen Fragen und die Möglichkeit, sie von jungen und alten Patienten ohne Unterschied in ihrem Reprogrammierungspotenzial zu erhalten, Probleme zu überwinden sind immer noch zahlreich. Tatsächlich kann eine Zellumprogrammierung, die mit viralen und integrierenden Viren durchgeführt wird, Infektionen verursachen, und die Einführung der erforderlichen Gene kann eine genomische Instabilität der Empfängerzelle induzieren und deren Einsatz in der Klinik beeinträchtigen. Insbesondere gibt es viele Bedenken über die Verwendung des c-Myc-Gens, das aus mehreren Studien für seine mutationsinduzierende Aktivität bekannt ist. Fibroblasten haben sich als die geeignete Zellpopulation für die zelluläre Reprogrammierung herausgebildet, da sie leicht zu isolieren und zu kulturieren sind und durch eine minimalinvasive Hautpunschbiopsie geerntet werden. Das hier beschriebene Protokoll enthält eine detaillierte Schritt-für-Schritt-Beschreibung des gesamten Verfahrens, von der Probenverarbeitung zur Gewinnung von Zellkulturen, der Wahl der Reagenzien und Vorräte, der Reinigung und Zubereitung bis hin zur Zellumprogrammierung mittels einer kommerziellen nicht modifizierte RNAs (NM-RNAs)-basiertes Reprogramming Kit. Das gewählte Reprogramming Kit ermöglicht eine effektive Umprogrammierung von humanem Dermalem Fibroblasten auf iPSCs und kleine Kolonien können bereits 24 h nach der ersten Transfektion gesehen werden, auch bei Modifikationen in Bezug auf das Standarddatenblatt. Das in diesem Protokoll verwendete Reprogrammierungsverfahren bietet den Vorteil einer sicheren Neuprogrammierung, ohne das Risiko von Infektionen, die durch virale vektorbasierte Methoden verursacht werden, reduziert die zellulären Abwehrmechanismen und ermöglicht die Generierung von xenofreien iPSCs, alle kritische Merkmale, die für weitere klinische Anwendungen obligatorisch sind.

Einleitung

Die Zellumprogrammierung stellt eine neuartige Technologie dar, um jede somatische Zelle des Körpers in eine pluripotente Stammzelle, bekannt als iPSC1,zu verwandeln. Die Möglichkeit, eine adulte somatische Zelle wieder in einen pluripotenten und undifferenzierten Zustand umzuprogrammieren, hat die Grenzen überwunden, die durch die schlechte Verfügbarkeit und ethische Fragen im Zusammenhang mit der Verwendung pluripotenter Zellen auferlegt wurden, die bisher nur von menschlichen Embryonen (embryonalen Stammzellen oder ESC)abstammten2,3,4. Im Jahr 2006 führten Kazutoshi Takahashi und Shinya Yamanaka eine bahnbrechende Studie durch, die die erste Umwandlung von adulten somatischen Zellen aus der Haut in pluripotente Zellen durch künstliche Zugabe von vier spezifischen Genen (Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc)5. Ein Jahr später führten arbeiten in Thomsons Labor zur erfolgreichen Umprogrammierung somatischer Zellen in iPSCs durch Transduktion einer anderen Kombination von vier Genen (Oct4, Sox2, Nanog, Lin28)6.

iPSCs bieten Wissenschaftlern und Forschern aus verschiedenen Bereichen, wie regenerative Medizin und Pharmakologie, eine Reihe von Möglichkeiten, um verschiedene Krankheiten zu untersuchen und zu behandeln, zusammen mit einer gechromischen Reflexion der Eigenschaften des Patienten, aus dem sie abgeleitet sind. Die Verwendung von iPSCs bietet mehrere Vorteile, darunter: das reduzierte Risiko für die Immunantwort aufgrund einer völlig autologen Herkunft der Zellen; die Möglichkeit, eine Zellbibliothek zu schaffen, ein wichtiges Werkzeug, um die Reaktion auf neue Medikamente und ihre Nebenwirkungen vorherzusagen, da sie in der Lage sind, sich kontinuierlich selbst zu erneuern und verschiedene Zelltypen zu erzeugen; und die Möglichkeit, einen maßgeschneiderten Ansatz für die Verabreichung von Arzneimitteln zu entwickeln7,8,9.

Verschiedene Techniken sind derzeit bekannt, um die Expression der Reprogrammierungsfaktoren zu induzieren, und sie sind in zwei Hauptkategorien enthalten: nichtvirale und virale vektorbasierte Methoden10,11,12,13. Nicht-virale Methoden umfassen mRNA-Transfektion, miRNA-Infektion/Transfektion, PiggyBac, Minicircle-Vektoren und episomale Plasmide und Exosomen10,11,12,13. Virale Methoden umfassen nicht integrierende Viren wie Adenovirus, Sendai-Virus und Proteine sowie die Integration von Viren wie Retrovirus und Lentivirus10,11,12,13.

Mehreren Studien zufolge wurden keine signifikanten Unterschiede zwischen diesen Methoden in Bezug auf die Wirksamkeit der Zellreprogrammierung festgestellt, daher hängt die Wahl des geeigneten Verfahrens streng vom verwendeten Zelltyp und von den nachfolgenden Anwendungen der erhaltenen iPSCsab 14,15. Alle genannten Methoden zeigen Nachteile, zum Beispiel, das Sendai-Virus ist für alle Zelltypen wirksam, erfordert aber viele Passagen, um iPSCs zu erhalten; Die Umprogrammierung durch Episomen eignet sich hervorragend für Blutzellen, benötigt jedoch eine Änderung der Standardkulturbedingungen für Fibroblasten; die PiggyBac-Methode könnte eine attraktive Alternative darstellen, aber Studien in menschlichen Zellen sind immer noch begrenzt und schwach10,11,12,13. Exosomen sind Nanovesikeln, die von Zellen physiologisch in alle Körperflüssigkeiten abgesondert werden. Jüngsten Studien zufolge sind sie für die interzelluläre Kommunikation verantwortlich und können in wichtigen biologischen Prozessen wie Zellproliferation, Migration und Differenzierung eine Rolle spielen. Exosomen können mRNA und miRNA mit einem völlig natürlichen Mechanismus transportieren und in Empfängerzellen übertragen, da sie die gleiche Zusammensetzung der Zellmembran16teilen. Daher sind Exosomen eine vielversprechende Neue-Generation-Technik für die Neuprogrammierung, aber ihr Potenzial, somatische Zellen nach ihrem Inhalt neu zu programmieren, wird noch untersucht. Virale vektorbasierte Methoden verwenden modifizierte Viren, um Reprogrammierungsgene an Empfängerzellen zu vermitteln. Diese Technik, trotz der hohen Effizienz der Umprogrammierung, gilt nicht als sicher, da die Integration des Virus in die Zelle für Infektionen, Teratome und genomische Instabilität verantwortlich sein kann17.

Das folgende Protokoll zur Erzeugung von iPSCs-Kolonien kombiniert den Neuprogrammierungscocktail von Yamanaka und Thompson und basiert auf der Anwendung einer Methode, die NM-RNAs und Immunevasion-Faktoren mit der Möglichkeit, sie unter xenofreien Bedingungen durchzuführen, erfordert. Der Grund für die Anwendung dieser Methode ist, innerhalb der wissenschaftlichen Gemeinschaft ein Protokoll zu verbreiten, das eine schnelle, einfache und hochwirksame Reprogrammierung von erwachsenen menschlichen Fibroblasten von der Bauchhaut in iPSCs18ermöglicht.

Die Stärken der vorgeschlagenen Methode sind in der Tat die einfache Leistung und die kurze Zeit, die für den Erhalt von iPSCs erforderlich ist. Darüber hinaus vermeidet die Methode zelluläre Abwehrmechanismen und die Verwendung von viralen Vektoren, die für relevante Probleme verantwortlich sind.

In Bezug auf das Standardprotokoll wurden folgende Änderungen vorgenommen: (1) Konfluente Fibroblasten wurden in Durchgang 4 synchronisiert, indem sie vor der Trypsinisierung 0,1% Serum für 48 h platzierten; (2) Die Zelldichte für Kultur und das Volumen der Reagenzien wurden für die Verwendung auf einer 24-Well-Multi-Well-Platte anstelle einer 6-Well-Platte angepasst; (3) Das Reprogrammierungsexperiment wurde mit einem 5%CO2-Inkubator anstelle eines Inkubators mit atmosphärischen (21%O2) oder hypoxischen (5%O2) Bedingungen durchgeführt.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokoll

Die Proben aus menschlichem Gewebe wurden gemäß der Erklärung von Helsinki unter Beachtung der Richtlinien des Universitätskrankenhauses Federico II gesammelt. Alle an dieser Studie beteiligten Patienten erteilten ihre schriftliche Zustimmung.

1. Vorbereitung von Lieferungen und Kulturmedien

  1. Reinigen und autoklavieren Sie ein großes Paar chirurgische Schere, zwei Sätze feine Zangen, zwei Paar mikrosezierende Schere, 1 L sterile Flasche, 500 ml sterile Flasche und eine 250 ml sterile Flasche.
  2. Bereiten Sie 100 mm Platten, 60 mm Platten, 35 mm Platten, Einwegskalpelle, 50 ml sterile Rohre, 15 ml sterile Rohre und eine 100 mm Glasplatte vor. Instrumente unter sterilen Bedingungen lagern, bis sie einsatzbereit sind.
  3. Reinigen und sterilisieren 22 mm x 22 mm Deckgläser vor Gebrauch. Dazu die Deckgläser in eine Glasplatte geben, mit 70% Ethanol bedecken und einige Sekunden warten, bevor sie das Ethanol ansaugen. Gläser bei 37 °C im Ofen trocknen lassen und dann autoklavieren.
  4. Bereiten Sie 1 L der ausgewogenen Salzlösung (HBSS) von Hank bei pH 7,4 vor, indem Sie handelsübliche Pulversalze in doppelt destilliertem sterilem Wasser auflösen und 0,35 g Natriumbicarbonat hinzufügen. Sterilisieren Sie durch Filtration unter einer sterilen Haube und lagern Sie bei +4 °C bis zum Gebrauch.
  5. 500 ml steriles 1x Phosphat-gepuffertes Salz (PBS) vorbereiten, indem Sie 0,1 g Kaliumphosphat monobasic, 0,1 g Kaliumchlorid, 4,0 g Natriumchlorid und 0,575 g Natriumphosphatdibasis in sterilem doppeldestilliertem Wasser auflösen. Überprüfen Sie den pH-Wert (7.4) und sterilisieren Sie sie unter einer sterilen Haube durch Filtration. Bei +4 °C lagern, bis es verwendet wird.
  6. Bereiten Sie 50 ml Trypsin-Stop-Lösung (TSS) vor, indem Sie 5 ml 10% fetales Rinderserum (FBS) zu 45 ml HBSS unter einer sterilen Haube hinzufügen. Bei +4 °C lagern, bis es verwendet wird.
  7. Bereiten Sie das modifizierte Eagle Medium des Dulbecco für die Fibroblastenisolierung (I-DMEM) mit 250 ml des modifizierten Eagle Mediums (DMEM) von Dulbecco vor, das mit 10% FBS und 0,5% Penicillin und Streptomycin (Pen/Strep) unter einer sterilen Kapuze ergänzt wird. Bei +4 °C lagern, bis es verwendet wird.
  8. Bereiten Sie das DMEM für die Fibroblastensynchronisation (S-DMEM) mit 250 ml DMEM vor, ergänzt durch 0,1% FBS und 0,5% Pen/Strep unter einer sterilen Haube. Bei +4 °C lagern, bis es verwendet wird.

2. Isolierung menschlicher dermaler Fibroblasten

HINWEIS: Die unten beschriebenen Schritte 2.1 bis 2.3 müssen unter einer sterilen Haube durchgeführt werden. Eine zylindrische Probe mit einem Durchmesser von ca. 0,8 cm ergibt 2 x 106 Fibroblasten an Durchgang 1.

  1. Waschen Sie die frisch erhaltene Probe der menschlichen Haut aus dem Bauch in einer 100 mm Schale mit HBSS-Lösung. Schütteln Sie vorsichtig, um Blut und andere biologische Flüssigkeiten zu entfernen. Wiederholen Sie den Schritt dreimal, indem Sie die HBSS-Lösung und die Platte bei jeder Wäsche ändern.
  2. Legen Sie die Probe in eine 100-mm-Platte, entfernen Sie Haare und Fett mit feinen Zangen und Scheren, und sezieren Sie sie mit einem Skalpell, um 2 mm x 1 mm Fragmente (für insgesamt 16 Fragmente) zu erhalten, um Narben zu vermeiden, verschmutzt (z. B. als Folge von Zeichnungen mit dermographischen Stift) oder verbrannten Bereichen des Gewebes.
  3. Legen Sie 4 kleine Fragmente in jede 35 mm Schale, Abdeckung mit einem sterilen 22 mm x 22 mm Deckglas. Mit feinen Zangen einstellen. 1,5 ml I-DMEM hinzufügen.
  4. Inkubieren Sie die Platten bei 37 °C in 5%CO2 für etwa 15 Tage oder bis die Zellen 85% Zusammenfluss erreichen. Ändern Sie das Kulturmedium alle 3 Tage und überprüfen Sie täglich das Auswuchs von Zellen mit einem invertierten Phasenkontrastmikroskop.

3. Erweiterung der menschlichen Haut-Fibroblasten

HINWEIS: Die unten beschriebenen Schritte müssen unter einer sterilen Haube durchgeführt werden, mit Ausnahme der Schritte, die im Inkubator ausgeführt werden.

  1. Heben Sie die Deckgläser mit feiner Zange an, legen Sie sie auf den Kopf in eine 100-mm-Schale und waschen Sie sie mit 1x sterilem PBS.
  2. Entfernen Sie Fragmente der Proben und entsorgen Sie sie, waschen Sie Teller mit 1x sterilem PBS.
  3. 1x PBS entfernen und 3 ml und 1 ml Trypsin-EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure) hinzufügen, um Gläser zu bedecken, die in der 100 mm Schale bzw. 35 mm Geschirr platziert sind. 5 min bei 37 °C mit 5%CO2inkubieren.
  4. Blockieren Sie die Trypsinisierung, indem Sie der 100-mm-Schale 5 ml TSS und jeder 35-mm-Schale 2 ml TSS hinzufügen. Die Suspension in 15 ml sterile Schläuche, Zentrifuge bei 400 x g bei 4 °C für 5 min.
  5. Aspirieren Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet in 12 ml I-DMEM wieder auf. Teilen Sie die Zellsuspension in 3 ml Aliquots für jede 60 mm Platte auf.
  6. Bei 37 °C mit 5%CO2inkubieren. Ändern Sie das Medium täglich. Halten Sie Zellen in kultur, bis sie einen Zusammenfluss von 75% erreichen.
  7. Das Medium von den Platten absaugen und schnell in 1x PBS waschen.
  8. Wiederholen Sie die Trypsinisierung (Schritte 3.3 und 3.4) dreimal, um Zellen in Durchgang 4 zu erhalten. Verwenden Sie 1,5 ml Trypsin-EDTA und 3 ml TSS in jeder 60 mm Schale. Teilen Sie die Zellen 1:3.
  9. Synchronisieren Sie die Zellen, indem Sie das I-DMEM durch S-DMEM ersetzen und 48 h bei 37 °C mit 5%CO2inkubieren.
  10. Bereiten Sie Folgendes vor (während der Zellsynchronisierung).
    1. Bereiten Sie Dasfibroblasten-Expansionsmedium vor, indem Sie 5,0 ml FBS und 0,5 ml L-Glutamin zu 44,5 ml fortgeschrittenem DMEM (A-DMEM) hinzufügen, bei +4 °C lagern.
    2. Bereiten Sie den gesamten NM-RNA-Reprogrammierungscocktail für die Fibroblasten-Reprogrammierung vor, indem Sie in jeder der 9 sterilen RNase-freien Rnasen-freien Röhren Folgendes kombinieren: 32 L OSKMNL NM-RNA, 24 l EKB NM-RNA, 5,6 l NM-microRNAs (61,6 l Endvolumen für 9 Aliquots).
    3. Teilen Sie jedes Röhrchen von 61,6 l des gesamten NM-RNA-Reprogrammierungscocktails für die Fibroblasten-Reprogrammierung in vier 15,4-L-Einweg-Aliquots in sterilen, RNase-freien Röhrchen auf und lagern Sie bei -80 °C (15,4 l Endvolumen für 36 Aliquots).

4. Umprogrammierung von Dermal-Fibroblasten auf iPSCs

  1. Tag 0: Zellaussaat
    HINWEIS: Die Schritte 4.1.1 bis 4.1.3 und 4.1.8 bis 4.1.9 müssen unter einer sterilen Haube durchgeführt werden. Kellermembranmatrix (BMM) geliert schnell bei Raumtemperatur. Daher wird dringend empfohlen, BMM über Nacht auf Eis im Kühlschrank aufzutauen, mit eiskaltem Serum-freiem Medium zu verdünnen und vorgekühlte Pipetten, Spitzen und Schläuche zu verwenden.
    1. Bereiten Sie eine 24-Well-Platte vor, indem Sie jeden Brunnen mit 100 l BMM beschichten und mindestens 1 h bei 37 °C brüten, bevor sie die Zellen säen.
    2. Das Medium von Platten mit Zellen in Kultur ansaugen und schnell in 1x PBS waschen.
    3. Wiederholen Sie die Trypsinisierung (Schritte 3.3 und 3.4), um Zellen in Durchgang 5 zu erhalten. Den Überstand ansaugen und das Pellet in einem geeigneten Volumen von Fibroblasten-Ausdehnungsmedium wieder aufsetzen (siehe Schritt 3.10).
    4. Vorbereiten und reinigen Sie das Hämozytometer mit 70% Alkohol.
    5. Bereiten Sie eine Lösung vor, indem Sie 10 l Trypanblau und 10 l Zellsuspension in 1,5 ml Schlauch vorsichtig mischen und 1–2 min bei Raumtemperatur inkubieren. Achten Sie darauf, nicht länger als 5 min zu inkubieren.
    6. Pipette 10 l der Lösung in das Hämozytometer legen Sie es auf die Bühne eines invertierten Phasenkontrastmikroskops zu zählen. Nicht lebensfähige Zellen werden blau sein, während lebensfähige Zellen unbefleckt sein werden.
    7. Zählen Sie die Zellen in mindestens 2 Quadraten der Hämozytometerkammer. Wenden Sie die folgende Berechnung an, um die Gesamtzahl der Zellen zu erhalten:
      Gesamtzahl der Zellen = (Gesamtanzahl der gezählten Zellen/Quadratzahl) x 2 x 10 x Gesamtvolumen der Zellsuspension
    8. Führen Sie eine Verdünnung durch, um eine Dichte von 2,5 x 104 Zellen pro 500 L Ausdehnungsmedium der Fibroblasten zu erhalten, basierend auf der Gesamtzahl der gezählten Zellen. Setzen Sie das Pellet in einem geeigneten Volumen von Fibroblasten Expansionsmedium.
    9. Pipette 500 l der Zellsuspension in jeden Brunnen der 24-Well-Platte. Inkubieren Sie Zellen über Nacht bei 37 °C und 5%CO2.
  2. Tag 1: Transfektion
    HINWEIS: Alle Arbeitsflächen und Zubehörteile (z. B. Handschuhe, Flaschen, sterile Kapuzenoberflächen, Pipetten) MÜSSEN vor Beginn des Verfahrens mit Reinigungsreagenz zum Entfernen von RNase gereinigt werden. Führen Sie die Schritte 4.2.2, 4.2.4–4.2.8 unter einer sterilen Kapuze aus.
    1. Erwärmen Sie xenofreies, serumfreies, wachstumsarmes menschliches ESC/iPSC Kulturmedium (XF/FF Kulturmedium) in einem 37 °C Wasserbad.
    2. Entfernen Sie das alte Medium aus jedem Brunnen und ersetzen Sie es durch 500 L vorgewärmtes XF/FF-Kulturmedium.
    3. Bei 37 °C unter 5%CO2 für mindestens 6 h inkubieren.
    4. Fünf 15,4 L-Aliquots des gesamten NM-RNA-Reprogrammierungscocktails bei Raumtemperatur auftauen und dann auf Eis legen.
    5. Fügen Sie jedem Aliquot 234,6 l reduziertes Serummedium hinzu, pipette 3-5-mal sanft pipette und beschriften Sie jedes als TUBE A (RNA + reduced-serum medium).
    6. Etikett 5 sterile, RNase-freie 0,5 ml-Röhrchen als TUBE B und mischen 6 l synthetisches siRNA-Transfektionsreagenz mit 244 l reduziertem Serummedium (RNA-Transfektionsreagenz + reduziertes Serummedium).
    7. Fügen Sie den Inhalt jedes TUBE B tropfenweise zu einem TUBE A hinzu (um ein Endvolumen von 500 L NM-RNA-Transfektionskomplexlösung zu erhalten). Mischen Sie, indem Sie auf den Boden des Rohres tippen. Bei Raumtemperatur für 15 min inkubieren.
    8. Fügen Sie aus jedem der fünf Aliquots von 500 l bis 4 Brunnen (um insgesamt 20 Brunnen) 125 L NM-RNA-Transfektionskomplexlösung hinzuzufügen, wobei die Platte geneigt und tropfenweise in das Medium pipetiert werden. Mischen Sie durch sanft schaukeln. Verwenden Sie die restlichen 4 Brunnen als Referenz.
    9. 15 h bei 37 °C, 5%CO2inkubieren.
  3. Tag 2–4: Vervollständigen Sie die Transfektion
    1. Aspirieren Sie das Medium. Wiederholen Sie den Transfektionsvorgang wie am ersten Tag unter der sterilen Haube.
  4. Tag 5–10: Medienwechsel
    1. Das Medium ansaugen und mit frischem, vorgewärmten XF/FF Kulturmedium unter einer sterilen Haube austauschen.
    2. Über Nacht bei 37 °C, 5%CO2inkubieren.
    3. Bewahren Sie kulturschonen, bis Sie die Bildung von iPSC-Kolonien beobachten, die täglich mit einem Phasenkontrastmikroskop überwacht werden.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Ergebnisse

Das Ziel des Protokolls war es, dermale Fibroblasten, die von der Bauchhaut isoliert wurden, mithilfe einer nicht-integrierenden Reprogrammierungsmethode auf Derm-RNAs neu zu programmieren, um die Expression spezifischer Faktoren zu induzieren. Um dieses Ziel zu erreichen, wurden menschliche dermale Fibroblasten aus Hautproben von Patienten isoliert, die sich einer Bauchoperation unterziehen, und iPSCs wurden mit Democ4, Sox2, Klf4, cMyc, Nanog, Lin28 Reprogramming Factors und E3, K3, B18 Immunevasion-Faktoren durch ein ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Diskussion

iPSCs entwickeln sich schnell zum vielversprechendsten Zellkandidaten für Anwendungen in der regenerativen Medizin und zu einem enorm nützlichen Werkzeug für die Krankheitsmodellierung und Arzneimitteltests3,8. Das hier vorgestellte Protokoll beschreibt die Generierung menschlicher iPSCs aus einer Probe mit der Größe einer Hautpunschbiopsie mit einem einfachen und effizienten Verfahren, das keine spezifische Ausrüstung oder vorkenntnisse.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

Die Autoren haben keine Anerkennung.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
10 mL serological pipetFalcon357551Sterile, polystyrene
100 mm platesFalcon351029Treated, sterile cell culture dish
15 mL sterile tubesFalcon352097Centrifuge sterile tubes, polypropylene
24-well platesFalcon353935Clear, flat bottom, treated multiwell cell culture plate, with lid, sterile
25 mL serological pipetFalcon357525Sterile, polystyrene
35 mm platesFalcon353001Treated, sterile cell culture dish
5 mL serological pipetFalcon357543Sterile, polystyrene
50 mL sterile tubesFalcon352098Centrifuge sterile tubes, polypropylene
Advanced DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)Gibco12491-015Store at 2-8 °C; avoid exposure to light
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)Sigma- AldrichD6429-500mlStore at 2-8 °C; avoid exposure to light
Fetal Bovine SerumSigma- AldrichF9665-500mlStore at -20 °C. The serum should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles
Hank's Balanced Salt SolutionSigma- AldrichH1387-1LPowder
L-glutamineLonzaBE17-605EStore at -20 °C. It should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles
Lipofectamine RNAiMAX Transfection ReagentINVITROGEN13778-030Synthetic siRNA Transfection Reagent; store at 2-8 °C
MatrigelCORNING354234Basement Membrane Matrix, store at -20 °C. Avoid multiple freeze-thaws.
Neubauer ChamberVWR631-1116Hemocytometer
NutriStem XF Culture MediumBiological Industries05-100-1A-500mlXeno-free, serum-free, low growth factor human ESC/iPSC culture medium. Store at -20 °C. Upon thawing, the medium may be stored at 2-8 °C for 14 days. Media should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles.
Opti-MEMGibco31985-062-100mlReduced-Serum Medium; store at 2-8 °C; avoid exposure to light
Penicillin and StreptomycinSigma- AldrichP4333-100mlStore at -20 °C. The solution should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles
Potassium ChlorideSigma- AldrichP9333Powder
Potassium Phosphate MonobasicSigma- AldrichP5665Powder
RNase-free 0.5 mL tubesEppendorfH0030124537RNase-free sterile, microfuge tubes, polypropylene
RNase-free 1.5 mL tubesEppendorfH0030120086RNase-free sterile, microfuge tubes, polypropylene
RNaseZAPINVITROGENAM9780Cleaning agent for removing RNase
Sodium BicarbonateSigma- AldrichS5761Powder
Sodium ChlorideSigma- AldrichS7653Powder
Sodium Phosphate DibasicSigma- Aldrich94046Powder
StemRNA 3rd Gen Reprogramming KitReprocell00-0076Third Generation NM-RNAs-based Reprogramming Kit for Cellular Reprogramming of Fibroblasts, Blood, and Urine. Store at or below -70 °C.
Trypsin-EDTASigma- AldrichT4049-100mlStore at -20 °C. It should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles

Referenzen

  1. Lo, B., Parham, L. Ethical Issues in Stem Cell Research. Endocrine Reviews. 30 (3), 204-213 (2009).
  2. Wong, W. T., Sayed, N., Cooke, J. P. Induced Pluripotent Stem Cells: How They Will Change the Practice of Cardiovascular Medicine. Methodist Debakey Cardiovasc Journal. 9 (4), 206-209 (2013).
  3. Singh, V. K., Kalsan, M., Kumar, N., Saini, A., Chandra, R. Induced pluripotent stem cells: applications in regenerative medicine, disease modeling, and drug discovery. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 3, 2(2015).
  4. Zacharias, D. G., Nelson, T. J., Mueller, P. S., Hook, C. C. The science and ethics of induced pluripotency: what will become of embryonic stem cells. Mayo Clinic Proceedings. 86 (7), 634-640 (2011).
  5. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  6. Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).
  7. Yu, Y., Wang, X., Scott, L., Nyberg, S. L. Application of Induced Pluripotent Stem Cells in Liver Diseases. Journal Cell Medicine. 3 (3), 997-1017 (2014).
  8. Ebert, A. D., Liang, P., Wu, J. C. Induced pluripotent stem cells as a disease modeling and drug screening platform. Journal Cardiovascular Pharmacology. 60 (4), 408-416 (2012).
  9. Gupta, S., Sharma, V., Verma, R. S. Recent advances in induced pluripotent stem cell (ipsc) based therapeutics. Journal of Stem Cell Research and Therapy. 3 (3), 263-270 (2017).
  10. Andargie, A., Tadesse, F., Shibbiru, T. Review on Cell Reprogramming: Methods and Applications. Journal of Medicine, Physiology and Biophysics. 25, 2422(2016).
  11. Warren, L., et al. Highly efficient reprogramming to pluripotency and directed differentiation of human cells using synthetic modified mRNA. Cell Stem Cell. 7 (5), 618-630 (2010).
  12. Malik, N., Rao, M. R. A Review of the Methods for Human iPSC Derivation. Methods in Molecular Biology. 997, 23-33 (2013).
  13. Poleganov, M. A., et al. Efficient Reprogramming of Human Fibroblasts and Blood-Derived Endothelial Progenitor Cells Using Nonmodified RNA for Reprogramming and Immune Evasion. Human Gene Therapy. 26 (11), 751-766 (2015).
  14. Brouwer, M., Zhou, H., Kasri, N. N. Choices for Induction of Pluripotency: Recent Developments in Human Induced Pluripotent Stem Cell Reprogramming Strategies. Stem Cell Reviews and Reports. 12, 54-72 (2016).
  15. Revilla, A., et al. Current advances in the generation of human iPS cells: implications in cell-based regenerative medicine. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 10, 893-907 (2016).
  16. Lee, Y. S., et al. Exosome-Mediated Ultra-Effective Direct Conversion of Human Fibroblasts into Neural Progenitor-like Cells. ACS Nano. 12 (3), 2531-2538 (2018).
  17. Bayart, E., Cohen-Haguenauer, O. Technological overview of iPS induction from human adult somatic cells. Current Gene Therapy. 13 (2), 73-92 (2013).
  18. Sacco, A. M., et al. Diversity of dermal fibroblasts as major determinant of variability in cell reprogramming. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (6), 4256-4268 (2019).
  19. Shan, Z. Y., et al. Continuous passages accelerate the reprogramming of mouse induced pluripotent stem cells. Cellular Reprogramming. 16 (1), 77-83 (2014).
  20. Schlaeger, T. M., et al. A comparison of non-integrating reprogramming methods. Nature Biotechnology. 33 (1), 58-63 (2015).
  21. Drews, K., Tavernier, G., Demeester, J., et al. The cytotoxic and immunogenic hurdles associated with non-viral mRNA-mediated reprogramming of human fibroblasts. Biomaterials. 33, 4059-4068 (2012).
  22. Beissert, T., et al. Improvement of In Vivo Expression of Genes Delivered by Self-Amplifying RNA Using Vaccinia Virus Immune Evasion Proteins. Human Gene Therapy. 28 (12), 1138-1146 (2017).
  23. Mathieu, J., et al. Hypoxia induces re-entry of committed cells into pluripotency. Stem Cells. 31 (9), 1737-1748 (2013).
  24. Wang, Y., et al. Hypoxia Enhances Direct Reprogramming of Mouse Fibroblasts to Cardiomyocyte-Like Cells. Cellular Reprogramming. 18 (1), 1-7 (2016).
  25. Deng, Y., et al. Hypoxia enhances buffalo adipose-derived mesenchymal stem cells proliferation, stemness, and reprogramming into induced pluripotent stem cells. Journal of Cellular Physiology. 234 (10), 17254-17268 (2019).
  26. Karagiannis, P., et al. Induced Pluripotent Stem Cells and Their Use in Human Models of Disease and Development. Physiological Reviews. 99 (1), 79-114 (2019).
  27. Maherali, N., Hochedlinger, K. Guidelines and techniques for the generation of induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 3 (6), 595-605 (2008).
  28. Asprer, J. S., Lakshmipathy, U. Current methods and challenges in the comprehensive characterization of human pluripotent stem cells. Stem Cell Reviews and Reports. 11 (2), 357-372 (2015).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Nachdrucke und Genehmigungen

Genehmigung beantragen, um den Text oder die Abbildungen dieses JoVE-Artikels zu verwenden

Genehmigung beantragen

Weitere Artikel entdecken

BioengineeringAusgabe 155Induzierte pluripotente Stammzellen iPSCsZellreprogrammierungdermale Fibroblastennicht modifizierte RNAsNM RNAsintegrationsfreie MethodeZellkulturHumanregenerative Medizin

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Datenschutz

Nutzungsbedingungen

Richtlinien

Kontakt

BIBLIOTHEKS-EMPFEHLUNG

JoVE-Newsletter

Forschung

Lehre

Autoren

Bibliothekare

ÜBER JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Alle Rechte vorbehalten