Aislamiento de fibroblastos dérmicos humanos adultos de la piel abdominal y generación de células madre pluripotentes inducidas utilizando un método no integrador

Resumen

La reprogramación celular requiere la introducción de genes clave, que regulan y mantienen el estado celular pluripotente. El protocolo descrito permite la formación de colonias de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) a partir de fibroblastos dérmicos humanos sin métodos virales/integradores pero utilizando ARN no modificados (NM-RNA) combinados con factores de evasión inmune que reducen los mecanismos de defensa celular.

Resumen

Hasta la fecha se podría considerar que las células madre pluripotentes inducidas (iPSC) son una fuente prometedora de células pluripotentes para el tratamiento de enfermedades no tratables, para la reconstitución y regeneración de tejidos lesionados y para el desarrollo de nuevos fármacos. A pesar de todas las ventajas relacionadas con el uso de iPSCs, como el bajo riesgo de rechazo, las menores cuestiones éticas, y la posibilidad de obtenerlas de pacientes jóvenes y viejos sin ninguna diferencia en su potencial de reprogramación, problemas para superar siguen siendo numerosos. De hecho, la reprogramación celular realizada con virus virales e integradores puede causar infecciones y la introducción de los genes requeridos puede inducir una inestabilidad genómica de la célula receptora, lo que perjudica su uso en la clínica. En particular, hay muchas preocupaciones sobre el uso del gen c-Myc, bien conocido a partir de varios estudios por su actividad inductora de mutaciones. Los fibroblastos han surgido como la población celular adecuada para la reprogramación celular, ya que son fáciles de aislar y cultivar y se cosechan mediante una biopsia de punzonado de piel mínimamente invasiva. El protocolo descrito aquí proporciona una descripción detallada paso a paso de todo el procedimiento, desde el procesamiento de muestras para obtener cultivos celulares, la elección de reactivos y suministros, la limpieza y la preparación, hasta la reprogramación celular por medio de un comercial RNA no modificado (NM-RNA) kit de reprogramación basado. El kit de reprogramación elegido permite una reprogramación efectiva del fibroblasto dérmico humano a los ISPC y se pueden ver pequeñas colonias tan pronto como 24 h después de la primera transfección, incluso con modificaciones con respecto a la hoja de datos estándar. El procedimiento de reprogramación utilizado en este protocolo ofrece la ventaja de una reprogramación segura, sin el riesgo de infecciones causadas por métodos virales basados en vectores, reduce los mecanismos de defensa celular y permite la generación de iPSC libres de xeno, todos características críticas que son obligatorias para otras aplicaciones clínicas.

Introducción

La reprogramación celular representa una tecnología novedosa para transformar cada célula somática del cuerpo en una célula madre pluripotente, conocida como iPSC¹. La posibilidad de reprogramar una célula somática adulta a un estado pluripotente e indiferenciado ha superado los límites impuestos por la escasa disponibilidad y cuestiones éticas relacionadas con el uso de células pluripotentes, antes sólo derivables de embriones humanos (células madre embrionarias o ESC)^2,3,4. En 2006, Kazutoshi Takahashi y Shinya Yamanaka llevaron a cabo un estudio pionero logrando la primera conversión de células somáticas adultas de piel en células pluripotentes mediante la adición artificial de cuatro genes específicos (Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc)⁵. Un año más tarde, el trabajo realizado en el laboratorio de Thomson condujo a la reprogramación exitosa de células somáticas en iPSC por transducción de una combinación diferente de cuatro genes (Oct4, Sox2, Nanog, Lin28)⁶.

Los iPSC ofrecen una serie de oportunidades a científicos e investigadores de diferentes campos, como la medicina regenerativa y la farmacología, siendo una excelente plataforma para estudiar y tratar diferentes enfermedades junto con un reflejo genotípico de las características del paciente del que se derivan. El uso de iPSCs proporciona varias ventajas, entre ellas: el menor riesgo de respuesta inmune debido a un origen completamente autólogo de las células; la posibilidad de crear una biblioteca de celdas, una herramienta importante para predecir la respuesta a nuevos fármacos y sus efectos secundarios, ya que son capaces de renovarse continuamente y generar diferentes tipos de células; y la oportunidad de desarrollar un enfoque personalizado para la administración de medicamentos^7,8,9.

En la actualidad se conocen diversas técnicas, para inducir la expresión de los factores de reprogramación y se incluyen en dos categorías principales: métodos no virales y virales basados en vectores^10,11,12,13. Los métodos no virales incluyen transfección de ARNm, infección/transfección de miRNA, PiggyBac, vectores de minicírculo y plásmidos episómicos y exosomas^10,11,12,13. Los métodos basados en virales incluyen virus no integradores, como Adenovirus, virus Y proteínas Sendai, e integración de virus como Retrovirus y Lentivirus^10,11,12,13.

Según varios estudios, no se han observado diferencias significativas entre estos métodos en términos de eficacia de la reprogramación celular, por lo tanto, la elección del método adecuado depende estrictamente del tipo de célula utilizado y de las aplicaciones posteriores de los iPSC^{obtenidos 14,15}. Todos los métodos mencionados muestran desventajas, por ejemplo, el virus Sendai es eficaz en todos los tipos de células, pero requiere una gran cantidad de pasajes para obtener iPSCs; la reprogramación por episomas es excelente para las células sanguíneas, pero necesita la modificación de las condiciones de cultivo estándar para los fibroblastos; el método PiggyBac podría representar una alternativa atractiva, pero los estudios en células humanas siguen siendo limitados y débiles^10,11,12,13. Los exosomas son nanovesículas fisiológicamente secretadas en todos los fluidos corporales por las células. Según estudios recientes, son responsables de la comunicación intercelular y pueden desempeñar un papel en procesos biológicos importantes, como la proliferación celular, la migración y la diferenciación. Los exosomas pueden transportar y transferir arnm y miRNA a las células receptoras con un mecanismo completamente natural, ya que comparten la misma composición de la membrana celular^16. Por lo tanto, los exosomas son una técnica prometedora de nueva generación para la reprogramación, pero su potencial para reprogramar células somáticas por su contenido todavía está bajo investigación. Los métodos basados en vectores virales utilizan virus modificados para transmitir genes de reprogramación a las células receptoras. Esta técnica, a pesar de la alta eficiencia de la reprogramación, no se considera segura, ya que la integración del virus dentro de la célula puede ser responsable de la infección, los teratomas y la inestabilidad genómica^17.

El siguiente protocolo para generar colonias de iPSC combina el cóctel de reprogramación de Yamanaka's y Thompson y se basa en el uso de un método que requiere NM-RNAs y factores de evasión inmune con la posibilidad de realizarlo en condiciones libres de xeno. La razón de ser de este método es difundir, dentro de la comunidad científica, un protocolo que permita una reprogramación rápida, sencilla y altamente eficaz de los fibroblastos humanos adultos de la piel abdominal en iPSCs^18.

Los puntos fuertes del método propuesto son, de hecho, la facilidad de rendimiento y el poco tiempo necesario para obtener iPSC. Además, el método evita los mecanismos de defensa celular y el uso de vectores virales, responsables de cuestiones relevantes.

Con respecto al protocolo estándar, se realizaron las siguientes modificaciones: (1) Los fibroblastos confluentes se sincronizaron en el pasaje 4 al colocarse en un 0,1% de suero durante 48 h antes de la trippsinización; (2) La densidad celular para el cultivo y el volumen de reactivos se ajustaron para la utilización en una placa multi-pozo de 24 pocillos en lugar de una placa de 6 pocillos; (3) El experimento de reprogramación se realizó utilizando una incubadora de CO₂ al 5% en lugar de una incubadora con condiciones atmosféricas (21% O₂₎o hipoxicas (5% O₂).

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Protocolo

Los especímenes de tejido humano fueron recogidos de acuerdo con la Declaración de Helsinki mientras observaba las directrices del Hospital Universitario Federico II. Todos los pacientes involucrados en este estudio proporcionaron consentimiento por escrito.

1. Preparación de Suministros y Medios de Cultura

1. Limpiar y autoclave un par grande de tijeras quirúrgicas, dos conjuntos de fórceps finos, dos pares de tijeras microdissezantes, botella estéril de 1 L, botella estéril de 500 ml y una botella estéril de 250 ml.
2. Prepare placas de 100 mm, placas de 60 mm, placas de 35 mm, bisturíes desechables, tubos estériles de 50 ml, tubos estériles de 15 ml y una placa de vidrio de 100 mm. Almacene los instrumentos en condiciones estériles hasta que estén listos para su uso.
3. Limpie y esterilice los anteojos de cubierta de 22 mm x 22 mm antes de su uso. Para ello, coloque los vasos de cubierta en una placa de vidrio, cúbralos con 70% de etanol y espere unos segundos antes de aspirar el etanol. Dejar secar los vasos de la cubierta en un horno a 37 oC y luego autoclave los aireaje.
4. Preparar 1 L de la solución salina equilibrada de Hank (HBSS) a pH 7.4 disolviendo sales en polvo disponibles comercialmente en agua estéril de doble destilación y añadiendo 0,35 g de bicarbonato sódico. Esterilice por filtración bajo una campana estéril y guárdela a +4oC hasta su uso.
5. Preparar 500 ml de solución salina estéril 1x fosfato-buffered-salina (PBS) disolviendo 0,1 g de fosfato potásico monobásico, 0,1 g de cloruro de potasio, 4,0 g de cloruro sódico y 0,575 g de fosfato sódico dibásico en agua estéril de doble destilación. Compruebe el valor de pH (7.4) y esterilizar bajo una campana estéril por filtración. Conservar a +4oC hasta su uso.
6. Preparar 50 ml de solución de parada de trippsina (TSS) añadiendo 5 ml de suero bovino fetal 10% (FBS) a 45 ml de HBSS bajo una capucha estéril. Conservar a +4oC hasta su uso.
7. Preparar el medio Eagle modificado del Dulbecco para el aislamiento de fibroblastos (I-DMEM) utilizando 250 ml del medio Eagle modificado (DMEM) de Dulbecco complementado con 10% DE FBS y 0,5% de penicilina y estreptomicina (lápiz/estreptococo) bajo una capucha estéril. Conservar a +4oC hasta su uso.
8. Preparar el DMEM para la sincronización de fibroblastos (S-DMEM) utilizando 250 mL de DMEM complementado con 0.1% FBS y 0.5% pluma/estreptococo bajo una campana estéril. Conservar a +4oC hasta su uso.

2. Aislamiento de fibroblastos dérmicos humanos

NOTA: Los pasos 2.1 a 2.3 que se indican a continuación deben realizarse bajo una campana estéril. Una muestra cilíndrica de aproximadamente 0,8 cm de diámetro produce 2 x 10⁶ fibroblastos en el paso 1.

1. Lavar la muestra recién obtenida de piel humana del abdomen en un plato de 100 mm con solución HBSS. Agitar suavemente para eliminar la sangre y otros fluidos biológicos. Repita el paso tres veces, cambiando la solución HBSS y la placa en cada lavado.
2. Colocar la muestra en una placa de 100 mm, eliminar el cabello y la grasa con fórceps finos y tijeras, y diseccionarla con un bisturí para obtener fragmentos de 2 mm x 1 mm (para un total de 16 fragmentos) evitando cicatrices, sucias (por ejemplo, como resultado de dibujos con pluma dermográfica) o áreas quemadas del tejido.
3. Coloque 4 fragmentos pequeños en cada plato de 35 mm, cubra con un vidrio de cubierta estéril de 22 mm x 22 mm. Ajustar por medio de fórceps finos. Agregue 1.5 mL de I-DMEM.
4. Incubar las placas a 37oC en 5% CO₂ durante unos 15 días o hasta que las células alcancen el 85% de confluencia. Cambie el medio de cultivo cada 3 días y compruebe el crecimiento de las células utilizando un microscopio de contraste de fase invertido diariamente.

3. Expansión de fibroblastos de piel humana

NOTA: Los pasos indicados a continuación deben realizarse bajo una campana estéril, excepto los pasos realizados en la incubadora.

1. Levante los vasos de la cubierta con fórceps finos, colóquelos boca abajo en un plato de 100 mm y lávelos con 1 PBS estéril.
2. Retire los fragmentos de las muestras y deséchelas, lave las placas con 1 PBS estéril.
3. Retire 1pbS y añada 3 ml y 1 ml de trippsina-EDTA (ácido etilendiaminetetraacético) para cubrir los vasos colocados en el plato de 100 mm y los platos de 35 mm, respectivamente. Incubar durante 5 min a 37oC con 5% CO₂.
4. Bloquee la tripinización añadiendo 5 ml de TSS a la placa de 100 mm y 2 ml de TSS a cada plato de 35 mm. Recoger la suspensión en tubos estériles de 15 ml, centrífuga a 400 x g a 4 oC durante 5 min.
5. Aspirar el sobrenadante y resuspender el pellet en 12 mL de I-DMEM. Divida la suspensión celular en alícuotas de 3 ml por cada placa de 60 mm.
6. Incubar a 37oC con 5% co_2. Cambia el medio a diario. Mantenga las células en cultivo hasta que alcancen una confluencia del 75%.
7. Aspirar el medio de las placas y lavar rápidamente en 1x PBS.
8. Repita la trippsinización (pasos 3.3 y 3.4) tres veces para obtener celdas en el pasaje 4. Utilice 1,5 ml de trippsina-EDTA y 3 ml de TSS en cada plato de 60 mm. Divida las celdas 1:3.
9. Sincronice las células reemplazando el I-DMEM con S-DMEM e incubar durante 48 h a 37oC con 5% CO_2.
10. Prepare lo siguiente (durante la sincronización de celdas).
    1. Preparar el medio de expansión de fibroblastos añadiendo 5,0 mL de FBS y 0,5 ml de L-glutamina a 44,5 ml de DMEM avanzado (A-DMEM), almacenar a +4 oC.
    2. Preparar el cóctel total de reprogramación NM-RNA para la reprogramación de fibroblastos combinando lo siguiente en cada uno de los 9 tubos estériles libres de RNase: 32 l de ARN NM de OSKMNL, 24 l de NM-RNA de EKB, 5,6 l de NM-microRNAs (61,6 l de volumen final para 9 alícuotas).
    3. Divida cada tubo de 61,6 l de cóctel total de reprogramación nm-RNA para reprogramación de fibroblastos en cuatro alícuotas de un solo uso de 15,4 ml en tubos estériles libres de rnase y guárdelos a -80 oC (volumen final de 15,4 l para 36 alícuotas).

4. Reprogramación de fibroblastos dérmicos a iPSCs

1. Día 0: Sembrado celular
   NOTA: Los pasos 4.1.1 a 4.1.3 y 4.1.8 a 4.1.9 deben realizarse bajo una campana estéril. La matriz de membrana del sótano (BMM) se gelifica rápidamente a temperatura ambiente. Por lo tanto, se recomienda encarecidamente descongelar BMM durante la noche en hielo en un refrigerador, diluirlo con medio sin suero helado y usar pipetas, puntas y tubos pre-enfriados.
   1. Preparar una placa de 24 pocillos cubriendo cada pocato con 100 ml de BMM e incubar durante al menos 1 h a 37 oC antes de sembrar las células.
   2. Aspirar el medio de placas con células en cultivo y lavar rápidamente en 1x PBS.
   3. Repita la trippsinización (pasos 3.3 y 3.4) para obtener celdas en el paso 5. Aspirar el sobrenadante y resuspender el pellet en un volumen adecuado de medio de expansión de fibroblastos (ver paso 3.10).
   4. Preparar y limpiar el hemocitómetro con un 70% de alcohol.
   5. Preparar una solución mezclando suavemente 10 ml de trippan azul y 10 l de suspensión celular en un tubo de 1,5 ml, e incubar durante 1-2 min a temperatura ambiente. Tenga cuidado de no incubar más de 5 min.
   6. La pipeta de 10 ml de la solución en el hemocitómetro la coloca en la etapa de un microscopio de contraste de fase invertido para contar. Las células no viables serán azules, mientras que las células viables no se conservarán.
   7. Cuente las células en al menos 2 cuadrados de la cámara hemocímetro. Aplique el siguiente cálculo para obtener el número total de celdas:
      Número total de celdas (número total de celdas contadas/número cuadrado) x 2 x 10 x volumen total de suspensión celular
   8. Realizar una dilución para obtener una densidad de 2,5 x 10⁴ células por medio de expansión de fibroblastos, en función del número total de células contadas. Resuspenda el pellet en un volumen adecuado de medios de expansión de fibroblastos.
   9. Pipetear 500 l de la suspensión celular en cada pocal de la placa de 24 pocillos. Incubar células durante la noche a 37oC y 5% CO₂.
2. Día 1: Transfección
   NOTA: Todas las superficies y suministros de trabajo (por ejemplo, guantes, botellas, superficies estériles de campana, pipeteadores) DEBEN limpiarse con un reactivo de limpieza para eliminar RNase antes de iniciar el procedimiento. Realice los pasos 4.2.2, 4.2.4–4.2.8 bajo una campana estéril.
   1. Caliente el medio de cultivo ESC/iPSC humano sin xeno, libre de suero, bajo factor de crecimiento (medio de cultivo XF/FF) en un baño de agua de 37 oC.
   2. Retire el medio viejo de cada pocal y sustitúyalo por 500 ml de medio de cultivo XF/FF precalentado.
   3. Incubar a 37oC por debajo del 5% de_CO2 durante al menos 6 h.
   4. Descongelar cinco alícuotas de 15,4 ol del cóctel total de reprogramación de NM-RNA a temperatura ambiente y luego colocarlo en hielo.
   5. Añadir 234,6 l de medio sérico reducido a cada alícuota, pipetear suavemente 3-5 veces y etiquetar cada uno como TUBO A (ARN + medio de suero reducido).
   6. Etiquetar 5 tubos estériles y libres de RNase de 0,5 ml como TUBO B y mezclar 6 l de reactivo de transfección de siRNA sintético con 244 ml de medio sérico reducido (reactivo de transfección de ARN + medio de suero reducido).
   7. Añadir el contenido de cada TUBO B a un TUBO A en sentido de gota (para obtener un volumen final de 500 ml de solución compleja de transfección NM-RNA). Mezclar tocando la parte inferior del tubo. Incubar a temperatura ambiente durante 15 min.
   8. Añadir 125 l de solución compleja de transfección NM-RNA de cada una de las cinco alícuotas de 500 ol a 4 pocillos (para alcanzar un total de 20 pozos), inclinando la placa y pipeteando gota en el medio. Mezcle balanceándose suavemente. Utilice los 4 pozos restantes como referencia.
   9. Incubar durante 15 h a 37oC, 5%_CO2.
3. Día 2–4: Completar la transfección
   1. Aspira el medio. Repita el procedimiento de transfección como el día 1 bajo la campana estéril.
4. Día 5–10: Cambios en los medios de comunicación
   1. Aspira el medio e intercambia con un medio de cultivo XF/FF fresco y precalentado bajo una capucha estéril.
   2. Incubar durante la noche a 37oC, 5% CO₂.
   3. Mantener en cultivo hasta observar la formación de colonias iPSC monitoreando diariamente por un microscopio de contraste de fase.

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Resultados

El objetivo del protocolo era reprogramar fibroblastos dérmicos aislados de la piel abdominal utilizando un método de reprogramación no integrador basado en NM-ARN para inducir la expresión de factores específicos. Para lograr este objetivo, los fibroblastos dérmicos humanos se aislaron de muestras de piel de pacientes sometidos a cirugía de abdominoplastia y se generaron isPC introduciendo oct4, Sox2, Klf4, cMyc, Nanog, factores de reprogramación Lin28 y factores de evasión inmune E3, K3, B18 mediante un kit de...

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Discusión

los iPSC están emergiendo rápidamente como el candidato celular más prometedor para aplicaciones de medicina regenerativa y como una herramienta tremendamente útil para el modelado de enfermedades y pruebas de drogas^3,8. El protocolo presentado aquí describe la generación de iPSCs humanos a partir de una muestra que tiene el tamaño de una biopsia de punzonado de la piel con un procedimiento simple y eficiente que no requiere ningún equipo específico o ex...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 mL serological pipet	Falcon	357551	Sterile, polystyrene
100 mm plates	Falcon	351029	Treated, sterile cell culture dish
15 mL sterile tubes	Falcon	352097	Centrifuge sterile tubes, polypropylene
24-well plates	Falcon	353935	Clear, flat bottom, treated multiwell cell culture plate, with lid, sterile
25 mL serological pipet	Falcon	357525	Sterile, polystyrene
35 mm plates	Falcon	353001	Treated, sterile cell culture dish
5 mL serological pipet	Falcon	357543	Sterile, polystyrene
50 mL sterile tubes	Falcon	352098	Centrifuge sterile tubes, polypropylene
Advanced DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)	Gibco	12491-015	Store at 2-8 °C; avoid exposure to light
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)	Sigma- Aldrich	D6429-500ml	Store at 2-8 °C; avoid exposure to light
Fetal Bovine Serum	Sigma- Aldrich	F9665-500ml	Store at -20 °C. The serum should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles
Hank's Balanced Salt Solution	Sigma- Aldrich	H1387-1L	Powder
L-glutamine	Lonza	BE17-605E	Store at -20 °C. It should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles
Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent	INVITROGEN	13778-030	Synthetic siRNA Transfection Reagent; store at 2-8 °C
Matrigel	CORNING	354234	Basement Membrane Matrix, store at -20 °C. Avoid multiple freeze-thaws.
Neubauer Chamber	VWR	631-1116	Hemocytometer
NutriStem XF Culture Medium	Biological Industries	05-100-1A-500ml	Xeno-free, serum-free, low growth factor human ESC/iPSC culture medium. Store at -20 °C. Upon thawing, the medium may be stored at 2-8 °C for 14 days. Media should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles.
Opti-MEM	Gibco	31985-062-100ml	Reduced-Serum Medium; store at 2-8 °C; avoid exposure to light
Penicillin and Streptomycin	Sigma- Aldrich	P4333-100ml	Store at -20 °C. The solution should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles
Potassium Chloride	Sigma- Aldrich	P9333	Powder
Potassium Phosphate Monobasic	Sigma- Aldrich	P5665	Powder
RNase-free 0.5 mL tubes	Eppendorf	H0030124537	RNase-free sterile, microfuge tubes, polypropylene
RNase-free 1.5 mL tubes	Eppendorf	H0030120086	RNase-free sterile, microfuge tubes, polypropylene
RNaseZAP	INVITROGEN	AM9780	Cleaning agent for removing RNase
Sodium Bicarbonate	Sigma- Aldrich	S5761	Powder
Sodium Chloride	Sigma- Aldrich	S7653	Powder
Sodium Phosphate Dibasic	Sigma- Aldrich	94046	Powder
StemRNA 3rd Gen Reprogramming Kit	Reprocell	00-0076	Third Generation NM-RNAs-based Reprogramming Kit for Cellular Reprogramming of Fibroblasts, Blood, and Urine. Store at or below -70 °C.
Trypsin-EDTA	Sigma- Aldrich	T4049-100ml	Store at -20 °C. It should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles