Isolamento de fibroblastos dérmicos humanos adultos da pele abdominal e geração de células-tronco pluripotentes induzidas usando um método não integrador

Resumo

A reprogramação celular requer a introdução de genes-chave, que regulam e mantêm o estado celular pluripotente. O protocolo descrito permite a formação de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) colônias de fibroblastos dérmicos humanos sem métodos virais/integradores, mas usando RNAs não modificados (NM-RNAs) combinados com fatores de evasão imunológica reduzindo os mecanismos de defesa celular.

Resumo

As células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) poderiam ser consideradas, até o momento, uma fonte promissora de células pluripotentes para o manejo de doenças atualmente intratáveis, para a reconstituição e regeneração de tecidos feridos e para o desenvolvimento de novos medicamentos. Apesar de todas as vantagens relacionadas ao uso de iPSCs, como o baixo risco de rejeição, as questões éticas diminuídas e a possibilidade de obtê-las de pacientes jovens e idosos sem qualquer diferença em seu potencial de reprogramação, problemas para superar ainda são numerosos. Na verdade, a reprogramação celular realizada com vírus virais e integradores pode causar infecções e a introdução de genes necessários pode induzir uma instabilidade genômica da célula receptora, prejudicando seu uso na clínica. Em particular, há muitas preocupações sobre o uso do gene c-Myc, bem conhecido de vários estudos para a sua atividade indutora de mutação. Fibroblastos surgiram como a população celular adequada para reprogramação celular como eles são fáceis de isolar e cultura e são colhidas por uma biópsia de perfuração da pele minimamente invasiva. O protocolo aqui descrito fornece uma descrição detalhada passo a passo de todo o procedimento, desde o processamento de amostras até a obtenção de culturas celulares, escolha de reagentes e suprimentos, limpeza e preparação, até a reprogramação celular por meio de um comercial RNAs não modificados (NM-RNAs) kit de reprogramação baseada em RNAs. O kit de reprogramação escolhido permite uma reprogramação eficaz do fibroblasto dérmico humano para iPSCs e pequenas colônias pode ser visto tão cedo quanto 24 h após a primeira transfecção, mesmo com modificações no que diz respeito à folha de dados padrão. O procedimento de reprogramação utilizado neste protocolo oferece a vantagem de uma reprogramação segura, sem o risco de infecções causadas por métodos virais baseados em vetores, reduz os mecanismos de defesa celular e permite a geração de iPSCs livres de xeno, todos características críticas que são obrigatórias para novas aplicações clínicas.

Introdução

A reprogramação celular representa uma nova tecnologia para transformar todas as células somáticas do corpo em uma célula-tronco pluripotente, conhecida como iPSC^1. A possibilidade de reprogramar uma célula somática adulta de volta a um estado pluripotente e indiferenciado superou os limites impostos pela baixa disponibilidade e questões éticas relacionadas ao uso de células pluripotentes, anteriormente derivadas apenas de embriões humanos (células-tronco embrionárias ou ESC)^2,3,4. Em 2006, Kazutoshi Takahashi e Shinya Yamanaka realizaram um estudo pioneiro alcançando a primeira conversão de células somáticas adultas da pele em células pluripotentes adicionando artificialmente quatro genes específicos (Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc)⁵. Um ano depois, o trabalho realizado no laboratório da Thomson levou à reprogramação bem-sucedida de células somáticas em iPSCs por transdução de uma combinação diferente de quatro genes (Oct4, Sox2, Nanog, Lin28)⁶.

Os iPSCs oferecem uma série de oportunidades para cientistas e pesquisadores de diferentes áreas, como medicina regenerativa e farmacologia, sendo uma excelente plataforma para estudar e tratar diferentes doenças, juntamente com um reflexo genotípico das características do paciente de que são derivados. O uso de iPSCs fornece várias vantagens, incluindo: o risco reduzido de resposta imune devido a uma origem completamente autóloga das células; a possibilidade de criar uma biblioteca celular, uma ferramenta importante para prever a resposta a novas drogas e seus efeitos colaterais, pois eles são capazes de se auto-renovar continuamente e gerar diferentes tipos de células; e a chance de desenvolver uma abordagem personalizada para a administração de medicamentos^7,8,9.

Diversas técnicas são conhecidas no momento, para induzir a expressão dos fatores de reprogramação e estão incluídas em duas categorias principais: métodos não virais e virais baseados em vetores^10,11,12,13. Métodos não virais incluem transfecção de mRNA, infecção/transfecção de miRNA, PiggyBac, vetores de minicírculos e plasmídeos episómicos e exossomos^10,11,12,13. Métodos baseados em vírus incluem vírus não integradores, como Adenovírus, vírus Sendai e proteínas, e integração de vírus como Retrovírus e Lentivirus^10,11,12,13.

De acordo com vários estudos, não foram observadas diferenças significativas entre esses métodos em termos de eficácia da reprogramação celular, portanto, a escolha do método adequado depende estritamente do tipo celular utilizado e das aplicações subsequentes dos iPSCs obtidos^14,15. Todos os métodos mencionados mostram desvantagens, por exemplo, o vírus Sendai é eficaz em todos os tipos de células, mas requer um monte de passagens para obter iPSCs; reprogramação por epísmios é excelente para as células do sangue, mas precisa de modificação das condições culturais padrão para fibroblastos; o método PiggyBac poderia representar uma alternativa atraente, mas os estudos em células humanas ainda são limitados e fracos^10,11,12,13. Exossomos são nano-vesículas fisiologicamente secretadas em todos os fluidos corporais por células. De acordo com estudos recentes, eles são responsáveis pela comunicação intercelular e podem ter um papel em importantes processos biológicos, como proliferação celular, migração e diferenciação. Exossomos podem transportar e transferir mRNA e miRNA para células receptoras com um mecanismo completamente natural, pois compartilham a mesma composição da membrana celular¹⁶. Portanto, exossomos são uma técnica promissora de nova geração para reprogramação, mas seu potencial para reprogramar células somáticas por seu conteúdo ainda está investigação. Métodos baseados em vetores virais usam vírus modificados para transmitir genes de reprogramação para as células receptoras. Esta técnica, apesar da alta eficiência da reprogramação, não é considerada segura, pois a integração do vírus dentro da célula pode ser responsável pela infecção, teratópodes e instabilidade genômica¹⁷.

O seguinte protocolo para gerar colônias de iPSCs combina o coquetel de reprogramação de Yamanaka e Thompson e é baseado no uso de um método que exige NM-RNAs e fatores de evasão imunológica com a possibilidade de realizá-lo em condições livres de xeno. A lógica por trás do uso deste método é se espalhar, dentro da comunidade científica, um protocolo que permite uma reprogramação rápida, simples e altamente eficaz de fibroblastos humanos adultos da pele abdominal para iPSCs¹⁸.

Os pontos fortes do método proposto são, de fato, a facilidade de desempenho e o curto espaço de tempo necessário para obter iPSCs. Além disso, o método evita mecanismos de defesa celular e o uso de vetores virais, responsáveis por questões relevantes.

Com relação ao protocolo padrão, foram feitas as seguintes modificações: (1) Os fibroblastos de confluentto foram sincronizados na passagem 4 ao colocar em 0,1% de soro por 48 h antes da trippsinização; (2) A densidade celular para a cultura e o volume de reagentes foram ajustados para a utilização em uma placa multi-poço de 24 poços em vez de uma placa de 6 poços; (3) O experimento de reprogramação foi realizado usando uma incubadora de 5% de CO₂ em vez de uma incubadora com condições atmosféricas (21% O₂₎ou hipóxico (5% O_2).

Protocolo

Os espécimes do tecido humano foram coletados de acordo com a Declaração de Helsínquia, observando as diretrizes do Hospital Universitário Federico II. Todos os pacientes envolvidos neste estudo forneceram o consentimento escrito.

1. Preparação de Suprimentos e Cultura Mídia

1. Limpe e autoclave um grande par de tesouras cirúrgicas, dois conjuntos de fórceps finos, dois pares de tesouras microdissecting, 1 L garrafa estéril, 500 mL garrafa estéril, e uma garrafa estéril de 250 mL.
2. Prepare placas de 100 mm, placas de 60 mm, placas de 35 mm, bisturis descartáveis, tubos estéreis de 50 mL, tubos estéreis de 15 mL e uma placa de vidro de 100 mm. Armazenar instrumentos em condições estéreis até que esteja pronto para uso.
3. Limpe e esterilizar 22 mm x 22 mm óculos de tampa antes de usar. Para isso, coloque os óculos de cobertura em uma placa de vidro, cubra-os com 70% de etanol e espere por alguns segundos antes de aspirar o etanol. Deixe os copos de cobertura secar em um forno a 37 °C e, em seguida, autoclave-los.
4. Prepare 1 L da solução de sal equilibrado de Hank (HBSS) no pH 7.4 dissolvendo sais pulverizados comercialmente disponíveis na água estéril dobro-destilada e adicionando 0.35 g do bicarbonato de sódio. Esterilizar por filtragem um capô estéril e armazenar a +4 °C até o uso.
5. Prepare 500 mL de estéril 1x fosfato-buffered-salina (PBS) dissolvendo 0,1 g de fosfato de potássio monobasic, 0,1 g de cloreto de potássio, 4,0 g de cloreto de sódio e 0,575 g de fosfato de sódio dibasic em água estéril de destilado duplo. Verifique o valor do pH (7,4) e esterilizar um capô estéril por filtragem. Guarde a +4°C até o uso.
6. Prepare 50 mL de solução de stop de trippsina (TSS), adicionando 5 mL de 10% de soro bovino fetal (FBS) a 45 mL de HBSS um capô estéril. Guarde a +4°C até o uso.
7. Prepare o meio eagle modificado do Dulbecco para isolamento de fibroblasto (I-DMEM) usando 250 mL do meio Eagle modificado (DMEM) de Dulbecco complementado com 10% FBS e 0,5% penicilina e estreptomicina (caneta/estreptococo) um capuz estéril. Guarde a +4°C até o uso.
8. Prepare o DMEM para sincronização de fibroblastos (S-DMEM) usando 250 mL de DMEM complementados com 0,1% FBS e 0,5% caneta/estreptococo um capô estéril. Guarde a +4°C até o uso.

2. Isolamento de fibroblastos dérmicos humanos

NOTA: Os passos 2.1 a 2.3 relatados abaixo devem ser realizados um capô estéril. Uma amostra cilíndrica medindo cerca de 0,8 cm de diâmetro produz 2 x 10⁶ fibroblastos na passagem 1.

1. Lave a amostra recém-obtida de pele humana do abdômen em um prato de 100 mm com solução HBSS. Agite delicadamente para remover o sangue e outros fluidos biológicos. Repita a etapa três vezes, alterando a solução HBSS e a placa em cada lavagem.
2. Coloque a amostra em uma placa de 100 mm, retire o cabelo e a gordura usando fórceps finos e tesouras, e disseque-a com um bisturi para obter fragmentos de 2 mm x 1 mm (para um total de 16 fragmentos) evitando cicatrizes, sujas (por exemplo, como resultado de desenhos com caneta dermográfica) ou áreas queimadas do tecido.
3. Coloque 4 pequenos fragmentos em cada prato de 35 mm, cubra com um vidro de cobertura estéril de 22 mm x 22 mm. Ajuste por meio de fórceps finos. Adicionar 1,5 mL de I-DMEM.
4. Incubar as placas a 37 °C em 5% DE CO₂ por cerca de 15 dias ou até que as células atinjam 85% de confluência. Mude o meio de cultura a cada 3 dias e verifique a conseqüência das células usando um microscópio de contraste de fase invertido diariamente.

3. Expansão dos fibroblastos da pele humana

NOTA: Os passos relatados abaixo devem ser realizados um capô estéril, exceto os passos realizados na incubadora.

1. Levante os óculos de capa com fórceps finos, coloque-os de cabeça para baixo em um prato de 100 mm e lave com PBS 1x estéril.
2. Retire fragmentos das amostras e descartá-los, lavar placas com 1x PBS estéril.
3. Retire 1x PBS e adicione 3 mL e 1 mL de trippsina-EDTA (ácido tetraáptico etilediamina) para cobrir copos colocados no prato de 100 mm e pratos de 35 mm, respectivamente. Incubar para 5 min em 37 °C com 5% CO₂.
4. Bloquear a trypsinização, adicionando 5 mL de TSS para o prato de 100 mm e 2 mL de TSS para cada prato de 35 mm. Colete a suspensão em tubos estéreis de 15 mL, centrífuga a 400 x g a 4 °C por 5 min.
5. Ascute o supernatant e resuspenda a pelota em 12 mL de I-DMEM. Divida a suspensão celular em 3 mL aliquots para cada placa de 60 mm.
6. Incubar a 37 °C com 5% CO₂. Mude o meio diariamente. Mantenha as células na cultura até atingirem uma confluência de 75%.
7. Aspirar o meio das placas e lavar rapidamente em 1x PBS.
8. Repita a trypsinização (passos 3,3 e 3,4) três vezes para obter células na passagem 4. Use 1,5 mL de trypsin-EDTA e 3 mL de TSS em cada prato de 60 mm. Divida as celas 1:3.
9. Sincroniza as células substituindo o I-DMEM por S-DMEM e incubar por 48 h a 37 °C com 5% de CO₂.
10. Prepare o seguinte (durante a sincronização celular).
    1. Prepare o meio de expansão do fibroblasto adicionando 5,0 mL de FBS e 0,5 mL de l-glutamina a 44,5 mL de DMEM avançado (A-DMEM), loja a +4 °C.
    2. Prepare o coquetel total de reprogramação nm-rna para reprogramação de fibroblastos, combinando o seguinte em cada um dos 9 tubos livres de RNase estéreis: 32 μL de OSKMNL NM-RNA, 24 μL de EKB NM-RNA, 5,6 μL de NM-microRNAs (61,6 μL volume final para 9 aliquots).
    3. Divida cada tubo de 61,6 μL de coquetel total de reprogramação nm-rna para reprogramação de fibroblasto em quatro alíquos de uso único de 15,4 μL em tubos estéreis, livres de RNase e guarde a -80 °C (15,4 μL volume final para 36 alíquos).

4. Reprogramação de fibroblastos dérmicos para iPSCs

1. Dia 0: Semeadura celular
   NOTA: Os passos 4.1.1 a 4.1.3 e 4.1.8 a 4.1.9 devem ser realizados um capô estéril. Gémeos de matriz de membrana do porão (BMM) rapidamente à temperatura ambiente. Portanto, é fortemente recomendado descongelar BMM durante a noite no gelo em uma geladeira, diluí-lo com meio soro-frio-frio e usar pipetas pré-resfriados, pontas e tubos.
   1. Prepare uma placa de 24 poços revestindo cada poço com 100 μL de BMM e incubar por pelo menos 1 h a 37 °C antes de semear as células.
   2. Assaa o meio de placas com células na cultura e lave rapidamente em 1x PBS.
   3. Repita a trypsinização (passos 3.3 e 3.4) para obter células na passagem 5. Aspirar o supernatant e resuspender a pelota em um volume apropriado de fibroblastos de expansão média (ver passo 3.10).
   4. Prepare e limpe o hemocytometer com 70% de álcool.
   5. Prepare uma solução misturando suavemente 10 μl de trippan azul e 10 μL de suspensão celular em tubo de 1,5 mL, e incubar por 1-2 min à temperatura ambiente. Tenha cuidado para não incubar mais de 5 min.
   6. Pipeta 10 μL da solução para o hemocytometer colocá-lo no palco de um microscópio de contraste fase invertida para contar. Células não viáveis serão azuis, enquanto células viáveis serão desmanhadas.
   7. Conte as células em pelo menos 2 quadrados da câmara do hemocytometer. Aplique o seguinte cálculo para obter o número total de células:
      número total de células = (número total de células contadas/número quadrado) x 2 x 10 x volume total de suspensão celular
   8. Realize uma diluição para obter uma densidade de 2,5 x 10⁴ células por 500 μL de fibroblastos de médium de expansão, com base no número total de células contadas. Resuspenda a pelota em um volume apropriado de fibroblastos de expansão média.
   9. Pipette 500 μL da suspensão celular em cada poço da placa de 24 poços. Incubate células durante a noite em 37 °C e 5% CO₂.
2. Dia 1: Transfecção
   NOTA: Todas as superfícies de trabalho e suprimentos (por exemplo, luvas, garrafas, superfícies de capô estéril, pipettors) devem ser limpos com reagente de limpeza para remover RNase antes de iniciar o procedimento. Executar etapas 4.2.2, 4.2.4-4.2.8 uma capa estéril.
   1. Aqueça xeno-livre, soro-livre, fator de baixo crescimento humano ESC / iPSC cultura média (XF / FF cultura média) em um banho de água 37 ° C.
   2. Retire o velho meio de cada poço e substituí-lo por 500 μL de pré-aquecido XF / FF meio de cultura.
   3. Incubar a 37 °C abaixo de 5% CO₂ para pelo menos 6 h.
   4. Descongele cinco alíquos de 15,4 μL do coquetel total de reprogramação nm-rna à temperatura ambiente e coloque-o no gelo.
   5. Adicione 234,6 μL de meio de soro reduzido a cada alíquota, delicadamente pipette 3-5 vezes e rotular cada um como TUBO A (RNA + meio de soro reduzido).
   6. Etiqueta 5 estéril, rnase-livre 0,5 mL tubos como tubo B e misturar 6 μL de sintético siRNA transfecção reagente com 244 μL de meio de soro reduzido (RNA-transfecção reagente + meio de soro reduzido).
   7. Adicione o conteúdo de cada TUBO B a um TUBO A dropwise (para obter 500 μL volume final de solução de transfecção NM-RNA complexo). Misture tocando no fundo do tubo. Incubar à temperatura ambiente por 15 min.
   8. Adicione 125 μL de solução complexa de transfecção NM-RNA de cada um dos cinco alíquos de 500 μL a 4 poços (para atingir um total de 20 poços), inclinando a placa e tubulação dropwise no meio. Misture balançando suavemente. Use os 4 poços restantes como referência.
   9. Incubar por 15 h a 37 °C, 5% CO₂.
3. Dia 2-4: Complete a transfecção
   1. Aspirar o meio. Repita o procedimento de transfecção como no dia 1 o capô estéril.
4. Dia 5-10: Mudanças na mídia
   1. Assaa o meio e troque com o meio fresco, pré-aquecido da cultura de XF/FF uma capa estéril.
   2. Incubar durante a noite em 37 °C, 5% CO₂.
   3. Mantenha-se na cultura até observar a formação de colônias do iPSC monitorando diariamente por um microscópio de contraste de fase.

Resultados

O objetivo do protocolo foi reprogramar fibroblastos dérmicos isolados da pele abdominal, utilizando método de reprogramação não integrador com base em RNAs Para induzir a expressão de fatores específicos. Para atingir esse objetivo, os fibroblastos dérmicos humanos foram isolados de amostras de pele de pacientes submetidos a cirurgia de abdominoplastia e iPSCs foram gerados introduzindo outubro4, Sox2, Klf4, cMyc, Nanog, Fatores de reprogramação Lin28 e e3, K3, B18 fatores de evasão imunológica por um kit de...

Discussão

IPSCs estão emergindo rapidamente como o candidato celular mais promissor para aplicações de medicina regenerativa e como uma ferramenta tremendamente útil para modelagem de doenças e testes de drogas^3,8. O protocolo apresentado aqui descreve a geração de iPSCs humanos de uma amostra com o tamanho de uma biópsia de perfuração de pele com um procedimento simples e eficiente que não requer nenhum equipamento específico ou experiência prévia com tecnol...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 mL serological pipet	Falcon	357551	Sterile, polystyrene
100 mm plates	Falcon	351029	Treated, sterile cell culture dish
15 mL sterile tubes	Falcon	352097	Centrifuge sterile tubes, polypropylene
24-well plates	Falcon	353935	Clear, flat bottom, treated multiwell cell culture plate, with lid, sterile
25 mL serological pipet	Falcon	357525	Sterile, polystyrene
35 mm plates	Falcon	353001	Treated, sterile cell culture dish
5 mL serological pipet	Falcon	357543	Sterile, polystyrene
50 mL sterile tubes	Falcon	352098	Centrifuge sterile tubes, polypropylene
Advanced DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)	Gibco	12491-015	Store at 2-8 °C; avoid exposure to light
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)	Sigma- Aldrich	D6429-500ml	Store at 2-8 °C; avoid exposure to light
Fetal Bovine Serum	Sigma- Aldrich	F9665-500ml	Store at -20 °C. The serum should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles
Hank's Balanced Salt Solution	Sigma- Aldrich	H1387-1L	Powder
L-glutamine	Lonza	BE17-605E	Store at -20 °C. It should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles
Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent	INVITROGEN	13778-030	Synthetic siRNA Transfection Reagent; store at 2-8 °C
Matrigel	CORNING	354234	Basement Membrane Matrix, store at -20 °C. Avoid multiple freeze-thaws.
Neubauer Chamber	VWR	631-1116	Hemocytometer
NutriStem XF Culture Medium	Biological Industries	05-100-1A-500ml	Xeno-free, serum-free, low growth factor human ESC/iPSC culture medium. Store at -20 °C. Upon thawing, the medium may be stored at 2-8 °C for 14 days. Media should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles.
Opti-MEM	Gibco	31985-062-100ml	Reduced-Serum Medium; store at 2-8 °C; avoid exposure to light
Penicillin and Streptomycin	Sigma- Aldrich	P4333-100ml	Store at -20 °C. The solution should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles
Potassium Chloride	Sigma- Aldrich	P9333	Powder
Potassium Phosphate Monobasic	Sigma- Aldrich	P5665	Powder
RNase-free 0.5 mL tubes	Eppendorf	H0030124537	RNase-free sterile, microfuge tubes, polypropylene
RNase-free 1.5 mL tubes	Eppendorf	H0030120086	RNase-free sterile, microfuge tubes, polypropylene
RNaseZAP	INVITROGEN	AM9780	Cleaning agent for removing RNase
Sodium Bicarbonate	Sigma- Aldrich	S5761	Powder
Sodium Chloride	Sigma- Aldrich	S7653	Powder
Sodium Phosphate Dibasic	Sigma- Aldrich	94046	Powder
StemRNA 3rd Gen Reprogramming Kit	Reprocell	00-0076	Third Generation NM-RNAs-based Reprogramming Kit for Cellular Reprogramming of Fibroblasts, Blood, and Urine. Store at or below -70 °C.
Trypsin-EDTA	Sigma- Aldrich	T4049-100ml	Store at -20 °C. It should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles