Isolamento di fibroblasti dermici umani adulti dalla pelle addominale e generazione di cellule staminali pluripotenti indotte utilizzando un metodo non integrato

Riepilogo

La riprogrammazione cellulare richiede l'introduzione di geni chiave, che regolano e mantengono lo stato cellulare pluripotente. Il protocollo descritto consente la formazione di colonie di cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) da fibroblasti dermici umani senza metodi virali/integranti, ma utilizzando RNA non modificati (NM-RNA) combinati con fattori di evasione immunitaria che riducono i meccanismi di difesa cellulare.

Abstract

Le cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) potrebbero essere considerate, ad oggi, una promettente fonte di cellule pluripotenti per la gestione di malattie attualmente non trattabili, per la ricostituzione e la rigenerazione dei tessuti feriti e per lo sviluppo di nuovi farmaci. Nonostante tutti i vantaggi legati all'uso di iPSC, come il basso rischio di rigetto, le questioni etiche meno e la possibilità di ottenerle da pazienti giovani e anziani senza alcuna differenza nel loro potenziale di riprogrammazione, problemi da superare sono ancora numerosi. Infatti, la riprogrammazione cellulare condotta con virus virali e di integrazione può causare infezioni e l'introduzione di geni necessari può indurre un'instabilità genomica della cellula ricevente, comprondone l'uso in clinica. In particolare, ci sono molte preoccupazioni circa l'uso del gene c-Myc, ben noto da diversi studi per la sua attività di mutazione- indurre. I fibroblasti sono emersi come la popolazione cellulare adatta per la riprogrammazione cellulare in quanto sono facili da isolare e coltura e vengono raccolti da una biopsia di punzone della pelle minimamente invasiva. Il protocollo qui descritto fornisce una descrizione dettagliata dell'intera procedura, dall'elaborazione dei campioni all'ottenimento delle colture cellulari, alla scelta dei reagenti e delle forniture, alla pulizia e alla preparazione delle cellule mediante una kit di riprogrammazione basata su RNA non modificati (NM-RNA). Il kit di riprogrammazione scelto consente un'efficace riprogrammazione del fibroblasto dermico umano agli iPSC e alle piccole colonie può essere visto già a 24 ore dopo la prima trasfezione, anche con modifiche rispetto al foglio dati standard. La procedura di riprogrammazione utilizzata in questo protocollo offre il vantaggio di una riprogrammazione sicura, senza il rischio di infezioni causate da metodi virali vettoriali, riduce i meccanismi di difesa cellulare e consente la generazione di iPSC xeno-free, tutti caratteristiche critiche che sono obbligatorie per ulteriori applicazioni cliniche.

Introduzione

La riprogrammazione cellulare rappresenta una nuova tecnologia per trasformare ogni cellula somatica del corpo in una cellula staminali pluripotente, nota come iPSC¹. La possibilità di riprogrammare una cellula somatica adulta a uno stato pluripotente e indifferenziato ha superato i limiti imposti dalla scarsa disponibilità e dalle questioni etiche legate all'uso di cellule pluripotenti, precedentemente solo derivabili da embrioni umani (cellule staminali embrionali o ESC)^2,3,4. Nel 2006, Kazutoshi Takahashi e Shinya Yamanaka hanno condotto uno studio pionieristico ottenendo la prima conversione di cellule somatiche adulte dalla pelle in cellule pluripotenti aggiungendo artificialmente quattro geni specifici (Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc)⁵. Un anno dopo, il lavoro svolto nel laboratorio di Thomson ha portato alla riuscita riprogrammazione di cellule somatiche in iPSC mediante trasduzione di una diversa combinazione di quattro geni (Oct4, Sox2, Nanog, Lin28)⁶.

Gli iPSC offrono una serie di opportunità a scienziati e ricercatori di diversi campi, come la medicina rigenerativa e la farmacologia, essendo un'eccellente piattaforma per studiare e trattare diverse malattie insieme a un riflesso genotipico delle caratteristiche del paziente da cui sono derivati. L'uso di iPSC offre diversi vantaggi tra cui: il ridotto rischio di risposta immunitaria a causa di un'origine completamente autologa delle cellule; la possibilità di creare una biblioteca cellulare, uno strumento importante per prevedere la risposta ai nuovi farmaci e ai loro effetti collaterali, in quanto sono in grado di rinnovarsi continuamente e generare diversi tipi di cellule; e la possibilità di sviluppare un approccio personalizzato per la somministrazione di farmaci^7,8,9.

Attualmente sono note diverse tecniche per indurre l'espressione dei fattori di riprogrammazione e sono incluse in due categorie principali: metodi non virali e virali basati su vettori^10,11,12,13. I metodi non virali includono la trafezione dell'mRNA, l'infezione/trasfezione miRNA, PiggyBac, i vettori minicircle e i plasmidi episomici e gli esosomi^10,11,12,13. I metodi virali includono virus non di integrazione, come adenovirus, virus Sendai e proteine, e l'integrazione di virus come Retrovirus e Lentivirus^10,11,12,13.

Secondo diversi studi, non sono state notate differenze significative tra questi metodi in termini di efficacia della riprogrammazione cellulare, quindi, la scelta del metodo adatto dipende strettamente dal tipo di cellula utilizzata e dalle successive applicazioni degli iPSC ottenuti^14,15. Tutti i metodi menzionati mostrano svantaggi, per esempio, il virus Sendai è efficace su tutti i tipi di cellule, ma richiede un sacco di passaggi per ottenere iPSC; la riprogrammazione mediante episoè è eccellente per le cellule del sangue, ma necessita di modifica delle condizioni di coltura standard per i fibroblasti; il metodo PiggyBac potrebbe rappresentare un'alternativa interessante, ma gli studi sulle cellule umane sono ancora limitati e deboli^10,11,12,13. Gli esosomi sono nano-vescicoli fisiologicamente secreti in tutti i fluidi corporei dalle cellule. Secondo studi recenti, sono responsabili della comunicazione intercellulare e possono avere un ruolo in importanti processi biologici, come la proliferazione cellulare, la migrazione e la differenziazione. Gli esosomi possono trasportare e trasferire mRNA e miRNA alle cellule destinatari con un meccanismo completamente naturale, in quanto condividono la stessa composizione della membrana cellulare¹⁶. Pertanto, gli esosomi sono una promettente tecnica di nuova generazione per la riprogrammazione, ma il loro potenziale per riprogrammare le cellule somatiche dal loro contenuto è ancora in fase di studio. I metodi basati su vettori virali utilizzano virus modificati per trasmettere geni di riprogrammazione alle cellule riceventi. Questa tecnica, nonostante l'alta efficienza della riprogrammazione, non è considerata sicura, in quanto l'integrazione del virus all'interno della cellula può essere responsabile di infezioni, teratomi e instabilità genomica¹⁷.

Il seguente protocollo per generare colonie di iPSC combina il cocktail di riprogrammazione di Yamanaka e Thompson e si basa sull'uso di un metodo che richiede NM-RNA e fattori di evasione immunitaria con la possibilità di eseguirlo in condizioni prive di xeno. La logica alla base dell'uso di questo metodo è quella di diffondere, all'interno della comunità scientifica, un protocollo che consenta una rapida, semplice e altamente efficace riprogrammazione dei fibroblasti umani adulti dalla pelle addominale agli iPSC¹⁸.

I punti di forza del metodo proposto sono, infatti, la facilità di esecuzione e il breve tempo necessario per ottenere iPSC. Inoltre, il metodo evita i meccanismi di difesa cellulare e l'uso di vettori virali, responsabili di questioni rilevanti.

Per quanto riguarda il protocollo standard, sono state apportate le seguenti modifiche: (1) i fibroblasti confluenti sono stati sincronizzati al passaggio 4 collocando in 0.1% siero per 48 h prima della trypsinization; (2) La densità cellulare per la coltura e il volume dei reagenti sono stati regolati per l'utilizzo su una piastra multi-pozzo 24-pozzo invece di una piastra a 6 pozze; (3) L'esperimento di riprogrammazione è stato effettuato utilizzando un incubatore di CO₂ del 5% invece di un'incubatrice con condizioni atmosferiche (21% O₂) o ipossiche (5% O_2).

Protocollo

Gli esemplari del tessuto umano sono stati raccolti secondo la Dichiarazione di Helsinki mentre osservavano le linee guida dell'Ospedale Universitario Federico II. Tutti i pazienti coinvolti in questo studio hanno fornito il consenso scritto.

1. Preparazione delle forniture e dei mezzi di coltura

1. Pulire e autoclave un grande paio di forbici chirurgiche, due set di pinze fini, due coppie di forbici microdisseci, 1 l bottiglia sterile, bottiglia sterile da 500 mL e una bottiglia sterile da 250 mL.
2. Preparare piastre da 100 mm, piastre da 60 mm, piastre da 35 mm, bisturi usa e getta, tubi sterili da 50 mL, tubi sterili da 15 mL e una lastra di vetro da 100 mm. Conservare gli strumenti in condizioni sterili fino a quando non sono pronti per l'uso.
3. Pulire e sterilizzare gli occhiali da copertura da 22 mm x 22 mm prima dell'uso. Per questo, mettere gli occhiali di copertura in una lastra di vetro, coprirli con il 70% di etanolo e attendere alcuni secondi prima di aspirare l'etanolo. Lasciare asciugare i bicchieri in forno a 37 gradi centigradi e poi autoclarli.
4. Preparare 1 L della soluzione di sale bilanciato di Hank (HBSS) a pH 7.4 sciogliendo i sali in polvere disponibili in commercio in acqua sterile a doppia distillazione e aggiungendo 0,35 g di bicarbonato di sodio. Sterilizzare per filtrazione sotto un cappuccio sterile e conservare a 4 gradi centigradi fino all'uso.
5. Preparare 500 mL di sterile 1x fosfato-buffer-salina-salina (PBS) sciogliendo 0,1 g di fosfato di potassio monobasico, 0,1 g di cloruro di potassio, 4,0 g di cloruro di sodio e 0,575 g di dispettofosto dibasic in acqua sterile a doppia distillazione. Controllare il valore del pH (7.4) e sterilizzare sotto un cappuccio sterile filtrando. Conservare a 4 gradi centigradi fino all'uso.
6. Preparare 50 mL di soluzione di stop a prova (TSS) aggiungendo 5 mL di 10% siero bovino fetale (FBS) a 45 mL di HBSS sotto un cofano sterile. Conservare a 4 gradi centigradi fino all'uso.
7. Preparare il mezzo Eagle modificato del Dulbecco per l'isolamento del fibroblasto (I-DMEM) utilizzando 250 mL del mezzo Eagle modificato di Dulbecco (DMEM) integrato con il 10% FBS e lo 0,5% di penicillina e streptomicina (pen/streptop) sotto un cappuccio sterile. Conservare a 4 gradi centigradi fino all'uso.
8. Preparare il DMEM per la sincronizzazione dei fibroblasti (S-DMEM) utilizzando 250 mL di DMEM integrato con lo 0,1% FBS e lo 0,5% di penna/strep sotto una cappa sterile. Conservare a 4 gradi centigradi fino all'uso.

2. Isolamento dei fibroblasti dermici umani

NOTA: i passaggi da 2.1 a 2.3 riportati di seguito devono essere eseguiti sotto un cappuccio sterile. Un campione cilindrico di circa 0,8 cm di diametro produce 2 fibroblasti 1 x 10⁶ al passaggio 1.

1. Lavare il campione appena ottenuto di pelle umana dall'addome in un piatto da 100 mm con soluzione HBSS. Scuotere delicatamente per rimuovere il sangue e altri fluidi biologici. Ripetere il passaggio tre volte, cambiando la soluzione HBSS e la piastra ad ogni lavaggio.
2. Mettere il campione in una piastra da 100 mm, rimuovere capelli e grassi con pinze sottili e forbici, e sezionarlo con un bisturi per ottenere frammenti 2 mm x 1 mm (per un totale di 16 frammenti) evitando cicatrici, sporche (ad esempio, risultanti da disegni con penna dermografica) o aree bruciate del tessuto.
3. Mettere 4 piccoli frammenti in ogni piatto da 35 mm, coprire con uno sterile 22 mm x 22 mm di copertura del vetro. Regolare per mezzo di pinze sottili. Aggiungere 1,5 mL di I-DMEM.
4. Incubare le piastre a 37 gradi centigradi nel 5% di CO₂ per circa 15 giorni o fino a quando le cellule raggiungono l'85% di confluenza. Cambiare il mezzo di coltura ogni 3 giorni e controllare la crescita delle cellule utilizzando un microscopio a contrasto di fase invertito ogni giorno.

3. Espansione dei Fibroblasti della Pelle Umana

NOTA: I passaggi riportati di seguito devono essere eseguiti sotto una cappa sterile, ad eccezione dei passaggi eseguiti nell'incubatrice.

1. Sollevare gli occhiali di copertura con pinze sottili, metterli a testa in giù in un piatto da 100 mm e lavare con 1 x PBS sterile.
2. Rimuovere i frammenti dei campioni e scartarli, lavare le piastre con 1x PBS sterile.
3. Rimuovere 1x PBS e aggiungere 3 mL e 1 mL di trypsin-EDTA (acido etileneamineaminetraacetic) per coprire gli occhiali posizionati rispettivamente nel piatto da 100 mm e nei piatti da 35 mm. Incubare per 5 min a 37 gradi centigradi con 5% DI CO₂.
4. Bloccare la provato aggiungendo 5 mL di TSS al piatto da 100 mm e 2 mL di TSS a ciascun piatto da 35 mm. Raccogliere la sospensione in tubi sterili da 15 mL, centrifugare a 400 x g a 4 gradi centigradi per 5 min.
5. Aspirare il supernatante e respendere il pellet in 12 mL di I-DMEM. Dividere la sospensione cellulare in 3 mL per ogni piastra da 60 mm.
6. Incubare a 37 gradi centigradi con il 5% di CO₂. Cambiare il mezzo giornaliero. Mantenere le cellule in coltura fino a raggiungere una confluenza del 75%.
7. Aspirare il mezzo dalle piastre e lavare rapidamente in 1x PBS.
8. Ripetere la ripetizione (passaggi 3.3 e 3.4) tre volte per ottenere le celle al passaggio 4. Utilizzare 1,5 mL di trypsin-EDTA e 3 mL di TSS in ogni piatto da 60 mm. Dividere le celle 1:3.
9. Sincronizzare le cellule sostituendo l'I-DMEM con S-DMEM e incubare per 48 h a 37 gradi centigradi con 5% CO₂.
10. Preparare quanto segue (durante la sincronizzazione delle celle).
    1. Preparare il supporto di espansione del fibroblasto aggiungendo 5,0 mL di FBS e 0,5 mL di L-glutamine a 44,5 mL di DMEM avanzato (A-DMEM), conservare a 4 gradi centigradi.
    2. Preparare il cocktail di riprogrammazione totale di NM-RNA per la riprogrammazione del fibroblasto combinando quanto segue in ciascuno dei 9 tubi sterili privi di RNase: 32 OSKMNL NM-RNA, 24 L di EKB NM-RNA, 5,6 l di NM-microRNA (61,6 : volume finale per 9-RNA).
    3. Dividete ogni tubo di 61,6 gradi del cocktail totale di riprogrammazione di NM-RNA per la riprogrammazione del fibroblasto in quattro aliquote monouso da 15,4 l' in tubi sterili e privi di RNase e conservate a -80 gradi (15,4 l. volume finale per 36 aliquote).

4. Riprogrammazione dei fibroblasti dermici agli iPSC

1. Giorno 0: semina cellulare
   NOTA: i passaggi da 4.1.1 a 4.1.3 e da 4.1.8 a 4.1.9 devono essere eseguiti sotto un cappuccio sterile. La matrice della membrana del seminterrato (BMM) gel rapidamente a temperatura ambiente. Pertanto, si consiglia vivamente di scongelare BMM durante la notte sul ghiaccio in un frigorifero, diluirlo con un mezzo senza siero ghiacciato e utilizzare pipet pre-raffreddati, punte e tubi.
   1. Preparare una piastra di 24 pozze ricoprendo ogni pozzo con 100 gradi l di BMM e incubare per almeno 1 h a 37 gradi centigradi prima di semiare le cellule.
   2. Aspirare il mezzo da piastre con cellule in coltura e lavare rapidamente in 1x PBS.
   3. Ripetere la ripetizione (passaggi 3.3 e 3.4) per ottenere le celle al passaggio 5. Aspirare il supernatante e risospendere il pellet in un adeguato volume di supporto di espansione dei fibroblasti (vedere il passaggio 3.10).
   4. Preparare e pulire l'emocitometro con il 70% di alcol.
   5. Preparare una soluzione mescolando delicatamente 10 l di blu trypan e 10 -L di sospensione cellulare in tubo da 1,5 mL, e incubare per 1-2 min a temperatura ambiente. Fare attenzione a non incubare più di 5 min.
   6. Pipetta 10 - L della soluzione nell'emocitometro lo posiziona sullo stadio di un microscopio a contrasto di fase invertito da contare. Le cellule non vitali saranno blu, mentre le cellule vitali saranno instaine.
   7. Contare le celle in almeno 2 quadrati della camera emocitometro. Applicare il seguente calcolo per ottenere il numero totale di celle:
      numero totale di celle (numero totale di celle conteggiate/numero quadrato) x 2 x 10 x volume totale della sospensione cellulare
   8. Eseguire una diluizione per ottenere una densità di 2,5 x 10⁴ cellule per 500 - L di fibroblasti mezzo di espansione, in base al numero totale di cellule contate. Risospendere il pellet in un adeguato volume di supporto di espansione dei fibroblasti.
   9. Pipetta 500 -L della sospensione cellulare in ogni pozzo della piastra 24-po. Incubare le cellule durante la notte a 37 e 5% DI CO₂.
2. Giorno 1: trasfezione
   NOTA: tutte le superfici e le forniture di lavoro (ad esempio, guanti, bottiglie, superfici sterili del cofano, pipettori) DEVONO essere pulite con reagente di pulizia per la rimozione di RNase prima di iniziare la procedura. Eseguire i passaggi 4.2.2, 4.2.4–4.2.8 sotto un cappuccio sterile.
   1. Riscaldare senza xeno, senza siero, basso fattore di crescita umano ESC/iPSC medio di coltura (XF / FF medio di coltura) in un bagno d'acqua a 37 gradi centigradi.
   2. Rimuovere il vecchio supporto da ogni pozzo e sostituirlo con 500 gradi l di supporto di coltura XF/FF preriscaldato.
   3. Incubare a 37 gradi centigradi sotto il 5% di CO₂ per almeno 6 h.
   4. Scongelare cinque cocktail di riprogrammazione totale di NM-RNA da 15,4 litri di un cocktail totale di riprogrammazione dell'RNA a temperatura ambiente, quindi posizionarlo sul ghiaccio.
   5. Aggiungere 234,6 luna di mezzo a siero ridotto per ogni aliquota, delicatamente pipetta 3-5 volte ed etichettare ciascuno come TUBE A (RNA - mezzo a siero ridotto).
   6. Etichetta 5 sterile, tubi privi di RNase da 0,5 mL come tubo B e mescolano 6 -L di reagente di trasfezione sintetica di siRNA con 244 l di mezzo a siero ridotto (reagente RNA-transfection - mezzo a siero ridotto).
   7. Aggiungere il contenuto di ogni tube B a un tubo A dropwise (per ottenere un volume finale di 500 -L della soluzione complessa di trasfezione NM-RNA). Mescolare toccando il fondo del tubo. Incubare a temperatura ambiente per 15 min.
   8. Aggiungete 125 l di soluzione complessa di trasfezione nm-RNA da ciascuna delle cinque aliquote da 500 a 4 pozzi (per raggiungere un totale di 20 pozzetti), inclinando la piastra e pipettando gocciolando nel mezzo. Mescolare a dondolo dolcemente. Utilizzare i restanti 4 pozze come riferimento.
   9. Incubare per 15 h a 37 , 5% CO₂.
3. Giorno 2–4: Completare la trasfezione
   1. Aspirare il mezzo. Ripetere la procedura di trasfezione come il giorno 1 sotto il cofano sterile.
4. Giorno 5-10: Cambiamenti multimediali
   1. Aspirare il mezzo e lo scambio con fresco, preriscaldato mezzo di coltura XF / FF sotto una cappa sterile.
   2. Incubare pernottamento a 37 gradi centigradi, 5% CO₂.
   3. Mantenere in coltura fino a osservare la formazione di colonie iPSC monitoraggio quotidiano da un microscopio a contrasto di fase.

Risultati

L'obiettivo del protocollo era quello di riprogrammare i fibroblasti dermici isolati dalla pelle addominale utilizzando un metodo di riprogrammazione non integratore basato su NM-RNA per indurre l'espressione di fattori specifici. Per raggiungere questo obiettivo, i fibroblasti dermici umani sono stati isolati da campioni di pelle di pazienti sottoposti a chirurgia del tuck della tumore e gli iPSC sono stati generati introducendo un kit di riprogrammazione commerciale pronto all'uso che combina la tecnologia di riprogram...

Discussione

Gli iPSC stanno rapidamente emergendo come il candidato cellulare più promettente per le applicazioni di medicina rigenerativa e come uno strumento tremendamente utile per la modellazione della malattia e il test farmacologico^3,8. Il protocollo qui presentato descrive la generazione di iPSC umani da un campione con le dimensioni di una biopsia di punzonatura cutanea con una procedura semplice ed efficiente che non richiede alcuna attrezzatura specifica o esperie...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 mL serological pipet	Falcon	357551	Sterile, polystyrene
100 mm plates	Falcon	351029	Treated, sterile cell culture dish
15 mL sterile tubes	Falcon	352097	Centrifuge sterile tubes, polypropylene
24-well plates	Falcon	353935	Clear, flat bottom, treated multiwell cell culture plate, with lid, sterile
25 mL serological pipet	Falcon	357525	Sterile, polystyrene
35 mm plates	Falcon	353001	Treated, sterile cell culture dish
5 mL serological pipet	Falcon	357543	Sterile, polystyrene
50 mL sterile tubes	Falcon	352098	Centrifuge sterile tubes, polypropylene
Advanced DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)	Gibco	12491-015	Store at 2-8 °C; avoid exposure to light
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)	Sigma- Aldrich	D6429-500ml	Store at 2-8 °C; avoid exposure to light
Fetal Bovine Serum	Sigma- Aldrich	F9665-500ml	Store at -20 °C. The serum should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles
Hank's Balanced Salt Solution	Sigma- Aldrich	H1387-1L	Powder
L-glutamine	Lonza	BE17-605E	Store at -20 °C. It should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles
Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent	INVITROGEN	13778-030	Synthetic siRNA Transfection Reagent; store at 2-8 °C
Matrigel	CORNING	354234	Basement Membrane Matrix, store at -20 °C. Avoid multiple freeze-thaws.
Neubauer Chamber	VWR	631-1116	Hemocytometer
NutriStem XF Culture Medium	Biological Industries	05-100-1A-500ml	Xeno-free, serum-free, low growth factor human ESC/iPSC culture medium. Store at -20 °C. Upon thawing, the medium may be stored at 2-8 °C for 14 days. Media should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles.
Opti-MEM	Gibco	31985-062-100ml	Reduced-Serum Medium; store at 2-8 °C; avoid exposure to light
Penicillin and Streptomycin	Sigma- Aldrich	P4333-100ml	Store at -20 °C. The solution should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles
Potassium Chloride	Sigma- Aldrich	P9333	Powder
Potassium Phosphate Monobasic	Sigma- Aldrich	P5665	Powder
RNase-free 0.5 mL tubes	Eppendorf	H0030124537	RNase-free sterile, microfuge tubes, polypropylene
RNase-free 1.5 mL tubes	Eppendorf	H0030120086	RNase-free sterile, microfuge tubes, polypropylene
RNaseZAP	INVITROGEN	AM9780	Cleaning agent for removing RNase
Sodium Bicarbonate	Sigma- Aldrich	S5761	Powder
Sodium Chloride	Sigma- Aldrich	S7653	Powder
Sodium Phosphate Dibasic	Sigma- Aldrich	94046	Powder
StemRNA 3rd Gen Reprogramming Kit	Reprocell	00-0076	Third Generation NM-RNAs-based Reprogramming Kit for Cellular Reprogramming of Fibroblasts, Blood, and Urine. Store at or below -70 °C.
Trypsin-EDTA	Sigma- Aldrich	T4049-100ml	Store at -20 °C. It should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles