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Résumé

La reprogrammation cellulaire nécessite l'introduction de gènes clés, qui régulent et maintiennent l'état cellulaire pluripotent. Le protocole décrit permet la formation de colonies de cellules souches pluripotentes induites (iPSC) à partir de fibroblastes dermiques humains sans méthodes virales/intégratrices, mais en utilisant des ARN non modifiés (NM-ARN) combinés à des facteurs d'évasion immunitaire réduisant les mécanismes de défense cellulaire.

Résumé

Les cellules souches pluripotentes induites (iPSC) pourraient être considérées, à ce jour, comme une source prometteuse de cellules pluripotentes pour la prise en charge de maladies actuellement incurables, pour la reconstitution et la régénération des tissus blessés et pour le développement de nouveaux médicaments. Malgré tous les avantages liés à l'utilisation des iPSC, tels que le faible risque de rejet, les questions éthiques moins, et la possibilité de les obtenir à la fois des patients jeunes et âgés sans aucune différence dans leur potentiel de reprogrammation, les problèmes à surmonter sont encore nombreux. En fait, la reprogrammation cellulaire menée avec des virus viraux et intégrant peut causer des infections et l'introduction de gènes requis peut induire une instabilité génomique de la cellule receveuse, altérant leur utilisation en clinique. En particulier, l'utilisation du gène c-Myc, bien connu dans plusieurs études pour son activité induisant la mutation, est très préoccupante. Les fibroblastes sont apparus comme la population cellulaire appropriée pour la reprogrammation cellulaire car ils sont faciles à isoler et à la culture et sont récoltés par une biopsie de poinçon de peau mini-invasive. Le protocole décrit ici fournit une description détaillée étape par étape de l'ensemble de la procédure, du traitement de l'échantillon pour obtenir les cultures cellulaires, le choix des réactifs et des fournitures, le nettoyage et la préparation, à la reprogrammation cellulaire au moyen d'une kit de reprogrammation non modifié des ARN (NM-ARN). Le kit de reprogrammation choisi permet une reprogrammation efficace du fibroblaste dermique humain aux iPSC et les petites colonies peuvent être vus dès 24 h après la première transfection, même avec des modifications en ce qui concerne la feuille de données standard. La procédure de reprogrammation utilisée dans ce protocole offre l'avantage d'une reprogrammation sûre, sans risque d'infections causées par des méthodes virales vectorielles, réduit les mécanismes de défense cellulaire, et permet la génération d'iPSC sans xéno, tous les caractéristiques critiques qui sont obligatoires pour d'autres applications cliniques.

Introduction

La reprogrammation cellulaire représente une nouvelle technologie pour transformer chaque cellule somatique du corps en une cellule souche pluripotente, connue sous le nom d'iPSC1. La possibilité de reprogrammer une cellule somatique adulte à un état pluripotent et indifférencié a dépassé les limites imposées par la faible disponibilité et les questions éthiques liées à l'utilisation de cellules pluripotentes, auparavant uniquement dérivées d'embryons humains (cellules souches embryonnaires ou ESC)2,3,4. En 2006, Kazutoshi Takahashi et Shinya Yamanaka ont mené une étude pionnière réalisant la première conversion de cellules somatiques adultes de la peau en cellules pluripotentes en ajoutant artificiellement quatre gènes spécifiques (Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc)5. Un an plus tard, les travaux menés dans le laboratoire de Thomson ont mené à la reprogrammation réussie des cellules somatiques en iPSCs par transduction d'une combinaison différente de quatre gènes (Oct4, Sox2, Nanog, Lin28)6.

IPSCs offrent un certain nombre d'occasions aux scientifiques et aux chercheurs de différents domaines, tels que la médecine régénérative et la pharmacologie, étant une excellente plate-forme pour étudier et traiter différentes maladies avec un reflet génotypique des caractéristiques du patient dont ils sont dérivés. L'utilisation d'iPSC offre plusieurs avantages, y compris: le risque réduit de réponse immunitaire due à une origine complètement autologue des cellules; la possibilité de créer une bibliothèque cellulaire, un outil important pour prédire la réponse aux nouveaux médicaments et à leurs effets secondaires, car ils sont en mesure de se renouveler continuellement et de générer différents types de cellules; et la chance de développer une approche personnalisée pour l'administration de médicaments7,8,9.

Diverses techniques sont connues à l'heure actuelle, pour induire l'expression des facteurs de reprogrammation et elles sont incluses dans deux grandes catégories : méthodes non virales et virales vectorielles10,11,12,13. Les méthodes non virales incluent la transfection d'ARNm, l'infection/transfection de miRNA, PiggyBac, les vecteurs de minicercle et les plasmides épisomiques et exosomes10,11,12,13. Les méthodes virales comprennent les virus non-intégration, tels que l'adénovirus, le virus Sendai et les protéines, et l'intégration de virus comme le rétrovirus et le lentivirus10,11,12,13.

Selon plusieurs études, aucune différence significative n'a été remarquée entre ces méthodes en termes d'efficacité de la reprogrammation cellulaire, par conséquent, le choix de la méthode appropriée dépend strictement du type de cellule utilisée et des applications ultérieures des iPSC obtenus14,15. Toutes les méthodes mentionnées montrent des inconvénients, par exemple, le virus Sendai est efficace sur tous les types de cellules, mais nécessite beaucoup de passages pour obtenir des iPSC; la reprogrammation par épisomes est excellente pour des cellules sanguines mais a besoin de modification des conditions standard de culture pour des fibroblastes ; la méthode PiggyBac pourrait représenter une alternative attrayante, mais les études dans les cellules humaines sont encore limitées et faibles10,11,12,13. Les exosomes sont des nano-vésicules physiologiquement sécrétées dans tous les fluides corporels par les cellules. Selon des études récentes, ils sont responsables de la communication intercellulaire et peuvent jouer un rôle dans d'importants processus biologiques, tels que la prolifération cellulaire, la migration et la différenciation. Les exosomes peuvent transporter et transférer l'ARNm et le miRNA aux cellules recevables avec un mécanisme complètement naturel, car ils partagent la même composition de la membrane cellulaire16. Par conséquent, les exosomes sont une technique prometteuse de nouvelle génération pour la reprogrammation, mais leur potentiel pour reprogrammer des cellules somatiques par leur contenu est toujours à l'étude. Les méthodes basées sur les vecteurs viraux utilisent des virus modifiés afin de transmettre des gènes de reprogrammation aux cellules receveuses. Cette technique, malgré la grande efficacité de la reprogrammation, n'est pas considérée comme sûre, car l'intégration du virus dans la cellule peut être responsable de l'infection, des tératomes et de l'instabilité génomique17.

Le protocole suivant pour générer des colonies iPSC combine le cocktail de reprogrammation de Yamanaka et Thompson et est basé sur l'utilisation d'une méthode exigeant NM-ARN et les facteurs d'évasion immunitaire avec la possibilité de l'exécuter dans des conditions xéno-libres. La raison d'être de cette méthode est de diffuser, au sein de la communauté scientifique, un protocole permettant une reprogrammation rapide, simple et très efficace des fibroblastes humains adultes de la peau abdominale en iPSCs18.

Les points forts de la méthode proposée sont, en fait, la facilité de rendement et le peu de temps nécessaire pour obtenir des iPSC. En outre, la méthode évite les mécanismes de défense cellulaire et l'utilisation de vecteurs viraux, responsables des questions pertinentes.

En ce qui concerne le protocole standard, les modifications suivantes ont été apportées : (1) Les fibroblastes confluents ont été synchronisés au passage 4 en plaçant dans le sérum de 0,1 % pendant 48 h avant la trypsinisation; (2) La densité cellulaire pour la culture et le volume des réactifs ont été ajustés pour l'utilisation sur une plaque multi-puits de 24 puits au lieu d'une plaque de 6 puits; (3) L'expérience de reprogrammation a été réalisée à l'aide d'un incubateur de CO2 de 5 % au lieu d'un incubateur avec des conditions atmosphériques (21 % O2) ou hypoxiques (5 % O2).

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Protocole

Les spécimens de tissus humains ont été prélevés selon la Déclaration d'Helsinki tout en observant les directives de l'hôpital universitaire Federico II. Tous les patients impliqués dans cette étude ont fourni le consentement écrit.

1. Préparation des fournitures et des médias culturels

  1. Nettoyez et autoclavez une grande paire de ciseaux chirurgicaux, deux ensembles de forceps fins, deux paires de ciseaux microdissés, 1 bouteille stérile L, une bouteille stérile de 500 ml et une bouteille stérile de 250 ml.
  2. Préparer des plaques de 100 mm, des plaques de 60 mm, des plaques de 35 mm, des scalpels jetables, des tubes stériles de 50 ml, des tubes stériles de 15 ml et une plaque de verre de 100 mm. Rangez les instruments dans des conditions stériles jusqu'à ce qu'ils soient prêts à l'emploi.
  3. Nettoyer et stériliser les verres de couverture de 22 mm x 22 mm avant utilisation. Pour cela, placez les verres de couverture dans une plaque de verre, couvrez-les de 70 % d'éthanol et attendez quelques secondes avant d'aspirater l'éthanol. Laisser sécher les verres au four à 37 oC, puis les autoclaver.
  4. Préparer 1 L de la solution de sel équilibrée (HBSS) de Hank au pH 7,4 en dissolvant les sels en poudre disponibles dans le commerce dans de l'eau stérile à double distillation et en ajoutant 0,35 g de bicarbonate de sodium. Stériliser par filtration sous une hotte stérile et conserver à 4 oC jusqu'à utilisation.
  5. Préparer 500 ml de saline stérile 1x phosphate-tamponné (PBS) en dissolvant 0,1 g de monobasic de phosphate de potassium, 0,1 g de chlorure de potassium, 4,0 g de chlorure de sodium et 0,575 g de dibasic de phosphate de sodium dans de l'eau stérile à double distillation. Vérifiez la valeur du pH (7,4) et stérilisez sous une hotte stérile par filtration. Conserver à 4 oC jusqu'à utilisation.
  6. Préparer 50 ml de solution d'arrêt de trypsine (TSS) en ajoutant 5 ml de sérum bovin fœtal (FBS) à 45 ml de HBSS sous une hotte stérile. Conserver à 4 oC jusqu'à utilisation.
  7. Préparer le milieu Eagle modifié du Dulbecco pour l'isolement du fibroblaste (I-DMEM) en utilisant 250 ml du milieu Eagle modifié (DMEM) modifié de Dulbecco, complété par 10 % de FBS et 0,5 % de pénicilline et de streptomycine (pen/streptococine) sous une hotte stérile. Conserver à 4 oC jusqu'à utilisation.
  8. Préparer le DMEM pour la synchronisation des fibroblastes (S-DMEM) en utilisant 250 mL de DMEM complétés par 0,1 % de FBS et 0,5 % de stylo/streptocoque sous une hotte stérile. Conserver à 4 oC jusqu'à utilisation.

2. Isolement des fibroblastes dermiques humains

REMARQUE : Les étapes 2.1 à 2.3 signalées ci-dessous doivent être effectuées sous une hotte stérile. Un échantillon cylindrique mesurant environ 0,8 cm de diamètre donne 2 x 106 fibroblastes au passage 1.

  1. Laver l'échantillon fraîchement obtenu de la peau humaine de l'abdomen dans un plat de 100 mm avec la solution HBSS. Secouez doucement pour enlever le sang et d'autres fluides biologiques. Répétez l'étape trois fois, en changeant la solution HBSS et la plaque à chaque lavage.
  2. Placer l'échantillon dans une plaque de 100 mm, enlever les cheveux et les graisses à l'aide de fines forceps et de ciseaux, et le disséquer avec un scalpel pour obtenir des fragments de 2 mm x 1 mm (pour un total de 16 fragments) en évitant les cicatrices sales (p. ex., comme résultant de dessins avec un stylo dermographique) ou des zones brûlées du tissu.
  3. Déposer 4 petits fragments dans chaque plat de 35 mm, couvrir d'un verre stérile de couverture de 22 mm x 22 mm. Ajuster au moyen de forceps fins. Ajouter 1,5 ml d'I-DMEM.
  4. Incuber les plaques à 37 oC dans 5 % de CO2 pendant environ 15 jours ou jusqu'à ce que les cellules atteignent 85 % de confluence. Changez le milieu de culture tous les 3 jours et vérifiez la croissance des cellules à l'aide d'un microscope à contraste de phase inversé tous les jours.

3. Expansion des fibroblastes de la peau humaine

REMARQUE : Les étapes indiquées ci-dessous doivent être effectuées sous une hotte stérile, à l'exception des étapes effectuées dans l'incubateur.

  1. Soulevez les verres de couverture avec des forceps fins, placez-les à l'envers dans un plat de 100 mm et lavez-les avec du PBS 1x stérile.
  2. Enlever les fragments des échantillons et les jeter, laver les plaques avec 1x PBS stérile.
  3. Retirer 1x PBS et ajouter 3 ml et 1 ml de trypsine-EDTA (acide éthylenediaminetetraacetic) pour couvrir les verres placés dans le plat de 100 mm et les plats de 35 mm, respectivement. Incuber 5 min à 37 oC avec 5 % de CO2.
  4. Bloquez la trypsinisation en ajoutant 5 ml de TSS au plat de 100 mm et 2 ml de TSS à chaque plat de 35 mm. Recueillir la suspension en tubes stériles de 15 ml, centrifugeuse à 400 x g à 4 oC pendant 5 min.
  5. Aspirer le supernatant et resuspendre la pastille en 12 ml d'I-DMEM. Diviser la suspension cellulaire en aliquots de 3 ml pour chaque plaque de 60 mm.
  6. Incuber à 37 oC avec 5 % de CO2. Changer le milieu tous les jours. Maintenir les cellules en culture jusqu'à ce qu'elles atteignent une confluence de 75%.
  7. Aspirer le milieu des assiettes et laver rapidement en 1x PBS.
  8. Répéter la trypsinisation (étapes 3.3 et 3.4) trois fois pour obtenir des cellules au passage 4. Utilisez 1,5 ml de trypsine-EDTA et 3 ml de TSS dans chaque plat de 60 mm. Divisez les cellules 1:3.
  9. Synchroniser les cellules en remplaçant l'I-DMEM par S-DMEM et incuber pendant 48 h à 37 oC avec 5% de CO2.
  10. Préparer ce qui suit (pendant la synchronisation cellulaire).
    1. Préparer le milieu d'expansion du fibroblaste en ajoutant 5,0 ml de FBS et 0,5 ml de L-glutamine à 44,5 ml de DMEM avancé (A-DMEM), entreposez à 4 oC.
    2. Préparer le cocktail total de reprogrammation NM-ARN pour la reprogrammation du fibroblaste en combinant les suivants dans chacun des 9 tubes stériles sans RNase : 32 l d'OSKMNL NM-ARN, 24 oL d'EKB NM-RNA, 5,6 l de NM-microRNAs (61,6 euros volume final pour 9 aliquots).
    3. Divisez chaque tube de 61,6 oL du cocktail total de reprogrammation NM-ARN pour la reprogrammation du fibroblaste en quatre aliquots à usage unique de 15,4 L dans des tubes stériles sans RNase et entreposez-les à -80 oC (volume final de 15,4 l pour 36 aliquots).

4. Reprogrammation des fibroblastes dermiques aux iPSC

  1. Jour 0: Ensemencement cellulaire
    REMARQUE : Les étapes 4.1.1 à 4.1.3 et 4.1.8 à 4.1.9 doivent être exécutées sous une hotte stérile. La matrice de membrane de sous-sol (BMM) gélifie rapidement à température ambiante. Par conséquent, il est fortement recommandé de décongeler le BMM toute la nuit sur la glace dans un réfrigérateur, de le diluer avec un milieu sans sérum glacé et d'utiliser des pipets, des pointes et des tubes pré-réfrigérés.
    1. Préparer une plaque de 24 puits en enrobant chaque puits de 100 l de BMM et incuber pendant au moins 1 h à 37 oC avant d'ensemencer les cellules.
    2. Aspirer le milieu des plaques avec des cellules en culture et laver rapidement en 1x PBS.
    3. Répéter la trypsinisation (étapes 3.3 et 3.4) pour obtenir des cellules au passage 5. Aspirez le supernatant et suspendez la pastille dans un volume approprié de fibroblastes support d'expansion (voir l'étape 3.10).
    4. Préparer et nettoyer l'hémocytomètre avec 70% d'alcool.
    5. Préparer une solution en mélangeant doucement 10 oL de bleu trypan et 10 l de suspension cellulaire dans un tube de 1,5 ml, et couver pendant 1 x 2 min à température ambiante. Veillez à ne pas couver plus de 5 min.
    6. Pipette 10 L de la solution dans l'hémocytomètre le placer sur la scène d'un microscope de contraste de phase inversée compter. Les cellules non viables seront bleues, tandis que les cellules viables ne seront pas tachées.
    7. Comptez les cellules dans au moins 2 carrés de la chambre hémocytomètre. Appliquer le calcul suivant pour obtenir le nombre total de cellules :
      nombre total de cellules (nombre total de cellules comptées/nombre carré) x 2 x 10 x volume total de suspension cellulaire
    8. Effectuer une dilution pour obtenir une densité de 2,5 x 104 cellules par 500 'L de fibroblastes milieu d'expansion, basé sur le nombre total de cellules comptées. Resuspendre la pastille dans un volume approprié de fibroblastes milieu d'expansion.
    9. Pipette 500 l de la suspension cellulaire dans chaque puits de la plaque de 24 puits. Incuber les cellules pendant la nuit à 37 oC et 5 % de CO2.
  2. Jour 1: Transfection
    REMARQUE : Toutes les surfaces de travail et les fournitures (p. ex. gants, bouteilles, surfaces de capuchon stériles, pipettors) DOIVENT être nettoyées avec un réactif de nettoyage pour enlever la RNase avant de commencer la procédure. Effectuer les étapes 4.2.2, 4.2.4-4.2.8 sous une hotte stérile.
    1. Réchauffez-vous sans xéno, sans sérum, facteur de faible croissance humain ESC/iPSC milieu de culture (xF/FF culture moyenne) dans un bain d'eau de 37 oC.
    2. Retirez l'ancien support de chaque puits et remplacez-le par 500 l de milieu de culture XF/FF préréchauffé.
    3. Incuber à 37 oC sous 5 % de CO2 pendant au moins 6 h.
    4. Décongeler cinq aliquots de 15,4 L du cocktail total de reprogrammation NM-ARN à température ambiante, puis placez-le sur la glace.
    5. Ajouter 234,6 l de milieu à sérum réduit à chaque aliquot, délicatement pipette 3 à 5 fois et étiqueter chacun comme TUBE A (ARN et milieu à sérum réduit).
    6. Étiqueter 5 tubes stériles, sans RNase de 0,5 ml comme TUBE B et mélanger 6 l de réactif synthétique de transfection de siRNA avec 244 l de milieu à sérum réduit (réagent ARN-transfection et milieu à sérum réduit).
    7. Ajouter le contenu de chaque TUBE B à un TUBE A dropwise (pour obtenir un volume final de 500 lL de solution complexe de transfection NM-ARN). Mélanger en tapant sur le fond du tube. Incuber à température ambiante pendant 15 min.
    8. Ajouter 125 L de solution complexe de transfection NM-ARN de chacun des cinq aliquots de 500 l à 4 puits (pour atteindre un total de 20 puits), inclinant la plaque et la tuyauterie dans le sens de la goutte dans le milieu. Mélanger en berçant doucement. Utilisez les 4 puits restants comme référence.
    9. Incuber pendant 15 h à 37 oC, 5 % CO2.
  3. Jour 2-4: Terminer la transfection
    1. Aspirez le médium. Répétez la procédure de transfection comme le jour 1 sous le capot stérile.
  4. Jour 5-10 : Changements dans les médias
    1. Aspirez le médium et échangez avec un milieu de culture XF/FF frais et préréchauffé sous une capuche stérile.
    2. Incuber toute la nuit à 37 oC, 5 % de CO2.
    3. Maintenir la culture jusqu'à ce qu'il observe la formation de colonies iPSC surveillées quotidiennement par un microscope à contraste de phase.

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Résultats

Le but du protocole était de reprogrammer les fibroblastes dermiques isolés de la peau abdominale en utilisant la méthode de reprogrammation non-intégration basée sur NM-ARN pour induire l'expression de facteurs spécifiques. Pour atteindre cet objectif, les fibroblastes dermiques humains ont été isolés à partir de spécimens de peau de patients subissant une chirurgie abdominale et iPSCs ont été générés introduisant Oct4, Sox2, Klf4, cMyc, Nanog, Lin28 facteurs de reprogrammation et E3, K3, B18 facteurs d'...

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Discussion

IPSCs sont rapidement émerger comme le candidat cellulaire le plus prometteur pour les applications de médecine régénérative et comme un outil extrêmement utile pour la modélisation des maladies et le dépistage des médicaments3,8. Le protocole présenté ici décrit la génération d'iPSC humains à partir d'un échantillon ayant la taille d'une biopsie de poinçon de peau avec une procédure simple et efficace qui ne nécessite aucun équipement spécif...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Remerciements

Les auteurs n'ont pas de reconnaissance.

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matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
10 mL serological pipetFalcon357551Sterile, polystyrene
100 mm platesFalcon351029Treated, sterile cell culture dish
15 mL sterile tubesFalcon352097Centrifuge sterile tubes, polypropylene
24-well platesFalcon353935Clear, flat bottom, treated multiwell cell culture plate, with lid, sterile
25 mL serological pipetFalcon357525Sterile, polystyrene
35 mm platesFalcon353001Treated, sterile cell culture dish
5 mL serological pipetFalcon357543Sterile, polystyrene
50 mL sterile tubesFalcon352098Centrifuge sterile tubes, polypropylene
Advanced DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)Gibco12491-015Store at 2-8 °C; avoid exposure to light
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)Sigma- AldrichD6429-500mlStore at 2-8 °C; avoid exposure to light
Fetal Bovine SerumSigma- AldrichF9665-500mlStore at -20 °C. The serum should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles
Hank's Balanced Salt SolutionSigma- AldrichH1387-1LPowder
L-glutamineLonzaBE17-605EStore at -20 °C. It should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles
Lipofectamine RNAiMAX Transfection ReagentINVITROGEN13778-030Synthetic siRNA Transfection Reagent; store at 2-8 °C
MatrigelCORNING354234Basement Membrane Matrix, store at -20 °C. Avoid multiple freeze-thaws.
Neubauer ChamberVWR631-1116Hemocytometer
NutriStem XF Culture MediumBiological Industries05-100-1A-500mlXeno-free, serum-free, low growth factor human ESC/iPSC culture medium. Store at -20 °C. Upon thawing, the medium may be stored at 2-8 °C for 14 days. Media should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles.
Opti-MEMGibco31985-062-100mlReduced-Serum Medium; store at 2-8 °C; avoid exposure to light
Penicillin and StreptomycinSigma- AldrichP4333-100mlStore at -20 °C. The solution should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles
Potassium ChlorideSigma- AldrichP9333Powder
Potassium Phosphate MonobasicSigma- AldrichP5665Powder
RNase-free 0.5 mL tubesEppendorfH0030124537RNase-free sterile, microfuge tubes, polypropylene
RNase-free 1.5 mL tubesEppendorfH0030120086RNase-free sterile, microfuge tubes, polypropylene
RNaseZAPINVITROGENAM9780Cleaning agent for removing RNase
Sodium BicarbonateSigma- AldrichS5761Powder
Sodium ChlorideSigma- AldrichS7653Powder
Sodium Phosphate DibasicSigma- Aldrich94046Powder
StemRNA 3rd Gen Reprogramming KitReprocell00-0076Third Generation NM-RNAs-based Reprogramming Kit for Cellular Reprogramming of Fibroblasts, Blood, and Urine. Store at or below -70 °C.
Trypsin-EDTASigma- AldrichT4049-100mlStore at -20 °C. It should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles

Références

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