JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Перепрограммирование клеток требует введения ключевых генов, которые регулируют и поддерживают плюрипотентное клеточное состояние. Описанный протокол позволяет формировать индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPSCs) колонии из человеческих кожных фибробластов без вирусных/интеграционных методов, но с использованием немодифицированных РНК (NM-RNA) в сочетании с факторами иммунного уклонения, уменьшающими механизмы клеточной защиты.

Аннотация

Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (IПС) можно считать на сегодняшний день перспективным источником плюрипотентных клеток для лечения неизлечимых в настоящее время заболеваний, для восстановления и регенерации поврежденных тканей и для разработки новых препаратов. Несмотря на все преимущества, связанные с использованием iPSCs, такие как низкий риск отторжения, снижение этических вопросов, а также возможность получить их от молодых и старых пациентов без каких-либо различий в их перепрограммировании потенциал, проблемы для преодоления по-прежнему многочисленны. В самом деле, перепрограммирование клеток проводится с вирусными и интеграции вирусов может вызвать инфекции и введение необходимых генов может вызвать геномную нестабильность клетки-реципиента, ухудшая их использование в клинике. В частности, существует много опасений по поводу использования гена c-Myc, известного по нескольким исследованиям, для его мутационной активности. Фибробласты стали подходящей популяцией клеток для клеточного перепрограммирования, поскольку они легко изолируются и культуре и собирают сявречноинбиоцией пунша кожи. Описанный здесь протокол содержит подробное пошаговое описание всей процедуры, от обработки образцов до получения клеточных культур, выбора реагентов и принадлежностей, очистки и подготовки, перепрограммирования клеток с помощью коммерческого немодифицированные РНК (NM-RNA) на основе перепрограммирования комплекта. Выбранный набор перепрограммирования позволяет эффективно перепрограммировать человека дермальной фибробластов для iPSCs и небольших колоний можно увидеть уже в 24 ч после первого трансфекции, даже с изменениями в отношении стандартного листа данных. Процедура перепрограммирования, используемая в этом протоколе, предлагает преимущество безопасного перепрограммирования, без риска инфекций, вызванных вирусными векторными методами, уменьшает механизмы клеточной защиты, и позволяет генерации ксено-свободных iPSCs, все критические особенности, которые являются обязательными для дальнейшего клинического применения.

Введение

Перепрограммирование клеток представляет собой новую технологию для преобразования каждой соматической клетки тела в плюрипотентную стволовую клетку, известную как iPSC1. Возможность перепрограммирования взрослых соматических клеток обратно в плюрипотентное и недифференцированное состояние преодолела пределы, налагаемые плохой доступностью и этические вопросы, связанные с использованием плюрипотентных клеток, ранее только вытекающих из человеческих эмбрионов (эмбриональные стволовые клетки или ESC)2,3,4. В 2006 году Кадзутоси Такахаси и Синья Яманака провели новаторское исследование, в ходе чего было проведено первое преобразование взрослых соматических клеток из кожи в плюрипотентные клетки путем искусственного добавления четырех специфических генов (Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc)5. Год спустя, работа, проведенная в лаборатории Томсона, привела к успешному перепрограммированию соматических клеток в iPSCs путем трансдукции другой комбинации из четырех генов (Oct4, Sox2, Nanog, Lin28)6.

iPSCs предлагают ряд возможностей для ученых и исследователей в различных областях, таких как регенеративная медицина и фармакология, являясь отличной платформой для изучения и лечения различных заболеваний наряду с генотипическим отражением характеристик пациента, из которых они получены. Использование iPSCs обеспечивает ряд преимуществ, включая: снижение риска иммунного ответа из-за полностью аутологичных происхождения клеток; возможность создания клеточной библиотеки, важного инструмента для прогнозирования реакции на новые лекарства и их побочные эффекты, поскольку они способны непрерывно самостоятельно обновлять и генерировать различные типы клеток; и возможность разработать индивидуальный подход к лекарственным препаратам7,8,9.

Различные методы известны в настоящее время, чтобы вызвать выражение факторов перепрограммирования, и они включены в две основные категории: невирусные и вирусные векторные методы10,11,12,13. Невирусные методы включают трансфекцию мРНК, инфекцию/трансфекцию миРНК, PiggyBac, переносчики мини-круга и эпизомальные плазмиды и экзосомы10,11,12,13. Вирусные методы включают неинтегрирующие вирусы, такие как аденовирус, вирус Сендай и белки, а также интеграцию вирусов, таких как ретровирус и лентивирус10,11,12,13.

По данным нескольких исследований, никаких существенных различий среди этих методов с точки зрения эффективности перепрограммирования клеток не было замечено, следовательно, выбор подходящего метода строго зависит от используемого типа клеток и от последующих применений iPSCs, полученных14,15. Все упомянутые методы показывают недостатки, например, вирус Сендай эффективен на всех типах клеток, но требует много проходов для получения iPSCs; перепрограммирование эписомами отлично подходит для клеток крови, но нуждается в изменении стандартных условий культуры фибробластов; метод PiggyBac может представлять собой привлекательную альтернативу, но исследования в клетках человека по-прежнему ограничены ислабые 10,11,12,13. Экзосомы являются нано-пузырьками физиологически выделяется во все жидкости организма клетками. Согласно последним исследованиям, они отвечают за межклеточную коммуникацию и могут играть определенную роль в важных биологических процессах, таких как пролиферация клеток, миграция и дифференциация. Экзосомы могут транспортировать и передавать мРНК и миРНК в клетки-реципиенты с полностью естественным механизмом, так как они имеют один и тот же состав клеточной мембраны16. Таким образом, экзосомы являются перспективным методом нового поколения для перепрограммирования, но их потенциал для перепрограммирования соматических клеток по их содержанию все еще находится под следствием. Вирусные векторные методы используют вирусы, модифицированные для передачи генов перепрограммирования клеткам-реципиентам. Этот метод, несмотря на высокую эффективность перепрограммирования, не считается безопасным, так как интеграция вируса в клетку может быть ответственна за инфекцию, тератомы и геномную нестабильность17.

Следующий протокол для генерации колоний iPSCs сочетает в себе коктейль перепрограммирования Яманаки и Томпсона и основан на использовании метода, требующего NM-РНК и факторов уклонения от иммунитета с возможностью выполнения его в условиях, свободных от ксено. Обоснование использования этого метода заключается в распространении в рамках научного сообщества протокола, позволяющего быстрое, простое и высокоэффективное перепрограммирование фибробластов взрослого человека из брюшной кожи в iPSCs18.

Сильные стороны предлагаемого метода, по сути, простота работоспособности и короткое время, необходимое для получения iPSCs. Кроме того, метод позволяет избежать механизмов клеточной защиты и использования вирусных векторов, ответственных за соответствующие вопросы.

Что касается стандартного протокола, то были внесены следующие изменения: (1) Конфлюентные фибробласты были синхронизированы при прохождении 4, размещая в 0,1% сыворотке 48 ч до трипсиизации; (2) Плотность клеток для культуры и объем реагентов были скорректированы для использования на 24-хорошо многоколодцной пластины вместо 6-колой пластины; (3) Эксперимент перепрограммирования был выполнен с использованием 5% CO2 инкубатор вместо инкубатора с атмосферными (21% O2) или гипоксических (5% O2) условия.

протокол

Образцы из тканей человека были собраны в соответствии с Хельсинкской декларацией при соблюдении руководящих принципов Университетской больницы Федерико II. Все пациенты, участвующие в этом исследовании, дали письменное согласие.

1. Подготовка поставок и культуры СРЕДСТВ массовой информации

  1. Чистые и автоклавные одна большая пара хирургических ножниц, два набора тонких щипцы, две пары микрорассеченных ножниц, 1 л стерильной бутылки, стерильная бутылка 500 мл и стерильная бутылка 250 мл.
  2. Приготовьте 100 мм пластин, 60 мм пластин, 35 мм пластин, одноразовые скальпели, стерильные трубки 50 мл, стерильные трубки 15 мл и стеклянную пластину 100 мм. Храните инструменты в стерильных условиях до готовности к использованию.
  3. Очистите и стерилизуем 22 мм х 22 мм крышки стекла перед использованием. Для этого поместите стаканы в стеклянную тарелку, накройте их 70% этанолом и подождите несколько секунд, прежде чем успокойся над этанолом. Пусть крышка стаканы высохнуть в духовке при температуре 37 градусов по Цельсию, а затем автоклав их.
  4. Приготовьте 1 л сбалансированного солевого раствора Хэнка (HBSS) при рН 7.4 путем растворения коммерчески доступных порошковых солей в двойной дистиллированной стерильной воде и добавления 0,35 г бикарбоната натрия. Стерилизовать путем фильтрации под стерильным капюшоном и хранить при 4 градусах цельсия до использования.
  5. Приготовьте 500 мл стерильного 1x фосфатно-солейного (PBS) путем растворения 0,1 г монобазного фосфата калия, 0,1 г хлорида калия, 4,0 г хлорида натрия и 0,575 г фосфата натрия, диссоциированной в стерильной двойной дистиллированной воде. Проверьте значение pH (7,4) и стерилизовать под стерильным капюшоном путем фильтрации. Хранить при 4 градусах по Цельсию до использования.
  6. Приготовьте 50 мл стоп-раствора трипсина (TSS), добавив 5 мл 10% сыворотки крупного рогатого скота плода (FBS) до 45 мл HBSS под стерильным капотом. Хранить при 4 градусах по Цельсию до использования.
  7. Подготовьте модифицированную среду Орел Dulbecco для фибробластной изоляции (I-DMEM) с использованием 250 мл модифицированной среды Dulbecco Eagle (DMEM) дополнены 10% FBS и 0,5% пенициллином и стрептомицином (перо/стрептом) под стерильным капюшоном. Хранить при 4 градусах по Цельсию до использования.
  8. Подготовьте DMEM для синхронизации фибробластов (S-DMEM) с использованием 250 мл DMEM дополнено 0,1% FBS и 0,5% пера / стрепы под стерильной капюшоном. Хранить при 4 градусах по Цельсию до использования.

2. Изоляция человеческих дермальных фибробластов

ПРИМЕЧАНИЕ: Шаги 2.1 до 2.3, о которых сообщалось ниже, должны выполняться под стерильным капюшоном. Цилиндрический образец диаметром около 0,8 см дает 2 x 106 фибробластов при прохождении 1.

  1. Вымойте свежеполученный образец человеческой кожи из живота в 100-мм блюде с помощью раствора HBSS. Аккуратно встряхните, чтобы удалить кровь и другие биологические жидкости. Повторите шаг три раза, изменив раствор HBSS и пластину при каждой стирке.
  2. Поместите образец в 100 мм пластины, удалить волосы и жир с помощью тонких щипцов и ножниц, и вскрыть его скальпелем, чтобы получить 2 мм х 1 мм фрагментов (в общей сложности 16 фрагментов), избегая шрамы, грязные (например, в результате рисунков с дермографической ручкой) или сожгли области ткани.
  3. Поместите 4 небольших фрагмента в каждую 35-мм тарелку, накройте стерильным стеклом 22 мм x 22 мм. Отрегулируйте с помощью тонких щипцы. Добавьте 1,5 мл I-DMEM.
  4. Инкубировать пластины при 37 градусах Цельсия в 5% CO2 в течение 15 дней или до тех пор, пока клетки не достигнут 85% слияния. Изменение среды культуры каждые 3 дня и проверить рост клеток с помощью перевернутой фазовой контрастной микроскоп ежедневно.

3. Расширение фибробластов кожи человека

ПРИМЕЧАНИЕ: Шаги, о которых сообщалось ниже, должны выполняться под стерильным капюшоном, за исключением ступенек, выполненных в инкубаторе.

  1. Поднимите крышку стаканов с тонкими щипками, поместите их вверх дном в один 100 мм блюдо и мыть с 1x стерильной PBS.
  2. Удалите фрагменты образцов и отбросьте их, вымойте тарелки 1x стерильным PBS.
  3. Удалить 1x PBS и добавить 3 мл и 1 мл трипсина-ЭДТА (этиленденедиаминететраацетическая кислота), чтобы покрыть стаканы помещены в 100 мм блюдо и 35 мм блюда, соответственно. Инкубировать в течение 5 мин при 37 градусах Цельсия с 5% CO2.
  4. Заблокируйте трипсинизацию, добавив 5 мл TSS к 100-мм блюду и 2 мл TSS к каждому 35-мм блюду. Соберите подвеску в 15 мл стерильных труб, центрифуги при 400 х г при 4 кв. м в течение 5 мин.
  5. Приготовьте супернатант и отрепримите гранулы в 12 мл I-DMEM. Разделите подвеску клетки на 3 мл aliquots для каждой пластины 60 мм.
  6. Инкубировать при 37 градусах Цельсия с 5% CO2. Изменение среды ежедневно. Держите клетки в культуре, пока они не достигнут слияния 75%.
  7. Примазать среду из пластин и быстро мыть в 1x PBS.
  8. Повторите трипсинизацию (шаги 3.3 и 3.4) три раза, чтобы получить клетки при прохождении 4. Используйте 1,5 мл трипсина-ЭДТА и 3 мл TSS в каждой тарелке 60 мм. Разделите ячейки 1:3.
  9. Синхронизируйте клетки, заменяя I-DMEM s-DMEM и инкубируя 48 ч при 37 градусах Цельсия с 5% CO2.
  10. Подготовьте следующее (во время синхронизации клеток).
    1. Подготовка фибробластрасширения среды расширения, добавив 5,0 мл FBS и 0,5 мл L-глютамина до 44,5 мл передовых DMEM (A-DMEM), хранить при 4 градусах Цельсия.
    2. Подготовьте общий коктейль NM-RNA-перепрограммирования для перепрограммирования фибробластов, объединив в каждой из 9 стерильных рнк-бесплатных трубок: 32 Зл OSKMNL NM-RNA, 24 Зл ЭКБ НМ-РНК, 5,6 л NM-microRNA (61,6 л окончательного объема для 9 aliquots).
    3. Разделите каждую трубку по 61,6 л от общего количества nM-RNA-перепрограммирования коктейль для фибробластов перепрограммирования на четыре 15,4 л одноразовых аликвот в стерильных, RNase-бесплатных труб и хранить на -80 кВ (15,4 л окончательного объема для 36 aliquots).

4. Перепрограммирование дермальных фибробластов в iPSCs

  1. День 0: Посев ячейки
    ПРИМЕЧАНИЕ: Шаги 4.1.1 до 4.1.3 и 4.1.8 до 4.1.9 должны выполняться под стерильным капюшоном. Подвал мембранной матрицы (BMM) гели быстро при комнатной температуре. Поэтому настоятельно рекомендуется ночью разморозить БММ на льду в холодильнике, разбавить ее ледяной сывороткой и использовать предварительно охлажденные пипеты, кончики и трубки.
    1. Подготовьте 24-колодую пластину, покрыв каждую скважину 100 л БММ и инкубируйтесь не менее 1 ч при 37 градусах Цельсия перед посевом клеток.
    2. Аспирируйте среду из пластин с клетками в культуре и быстро мыть в 1x PBS.
    3. Повторите трипсинизацию (шаги 3.3 и 3.4), чтобы получить клетки при прохождении 5. Усилите супернатант и отдохните гранулы в соответствующем объеме среды расширения фибробластов (см. шаг 3.10).
    4. Приготовьте и очистите гемоцитометр с 70% алкоголя.
    5. Подготовьте раствор, аккуратно перемешивая 10 л трипан синего и 10 л клеточной суспензии в трубке 1,5 мл, и инкубировать в течение 1-2 мин при комнатной температуре. Будьте осторожны, чтобы не инкубировать дольше, чем 5 мин.
    6. Пипетка 10 л раствора в гемоситометр поместите его на стадию перевернутой фазы контрастного микроскопа для подсчета. Нежизнеспособные клетки будут синими, в то время как жизнеспособные клетки будут незапятнанными.
    7. Подсчитайте клетки, по крайней мере, в 2 квадратах гемоцитометрической камеры. Примените следующий расчет, чтобы получить общее количество ячеек:
      общее количество ячеек (общее количество подсчитанных ячеек/квадратное число) x 2 x 10 x общий объем суспензии ячеек
    8. Выполните разбавление, чтобы получить плотность 2,5 х 104 ячейки на 500 л фибробластов расширения среды, на основе общего числа подсчитанных клеток. Приостановите гранулы в соответствующем объеме фибробластов расширения среды.
    9. Пипетка 500 л клеточной подвески в каждой скважине 24-колодца пластины. Инкубировать клетки на ночь при 37 градусах По цельсии и 5% CO2.
  2. День 1: Трансфекция
    ПРИМЕЧАНИЕ: Все рабочие поверхности и материалы (например, перчатки, бутылки, стерильные поверхности капот, трубоукладчики) должны быть очищены с реагентом очистки для удаления RNase перед началом процедуры. Выполните шаги 4.2.2, 4.2.4-4.2.8 под стерильным капюшоном.
    1. Разогрейте ксено-бесплатно, без сыворотки, низкий фактор роста человека ESC/iPSC культуры среды (XF / FF культуры среды) в 37 градусов по Цельсию водяной бане.
    2. Удалите старую среду из каждой скважины и замените его 500 злителем предварительно разогретой среды культуры XF/FF.
    3. Инкубировать при 37 градусах Цельсия под 5% CO2 не менее 6 ч.
    4. Оттепели пять 15,4 л aliquots общего NM-RNA перепрограммирования коктейль при комнатной температуре, то поместите его на лед.
    5. Добавьте 234,6 л средней сыворотки к каждому аликоту, аккуратно пипетку 3-5 раз и пометьте каждый из них как TUBE A (РНК и с пониженной сыворотки среды).
    6. Этикетка 5 стерильных, RNase-свободной 0,5 мл труб, как TUBE B и смешать 6 л синтетического реагента трансфекционного siRNA с 244 л уменьшенной сыворотки среды (РНК-трансфекционный реагент и уменьшенная сыворотка среды).
    7. Добавьте содержимое каждого ТУБ B в dropwise TUBE A (для получения 500 зл. конечного объема раствора трансфекционного комплекса NM-RNA). Смешайте, нажав на дно трубки. Инкубировать при комнатной температуре 15 мин.
    8. Добавьте 125 зЛ трансфекционного раствора NM-RNA из каждого из пяти аликвот овкотов по 500 кл к 4 скважинам (для достижения в общей сложности 20 скважин), наклоняя пластину и скапливаясь в среду. Смешайте, качая осторожно. Используйте оставшиеся 4 скважины в качестве эталона.
    9. Инкубировать 15 ч при 37 градусах Цельсия, 5% CO2.
  3. День 2-4: Завершить трансфекцию
    1. Призадыхайся от среды. Повторите процедуру трансфекции, как на 1 день под стерильным капюшоном.
  4. День 5-10: Медиа изменения
    1. Примажьйте среду и обмен со свежим, предварительно разогретым XF/FF культуры среды под стерильным капотом.
    2. Инкубировать ночь при 37 градусах Цельсия, 5% CO2.
    3. Храните в культуре до наблюдения за образованием колоний iPSC мониторинга ежедневно фазово-контрастный микроскоп.

Результаты

Целью протокола была перепрограммирование дермальных фибробластов, изолированных от брюшной кожи, с использованием неинтегрирующего метода перепрограммирования на основе НМ-РНК, чтобы вызвать выражение конкретных факторов. Для достижения этой цели, человеческие дермальные фибробл?...

Обсуждение

iPSCs быстро становятся наиболее перспективными кандидатами клеток для регенеративной медицины приложений и как чрезвычайно полезный инструмент для моделирования заболеваний и тестирования на наркотики3,8. Протокол, представленный здесь, описывает гене?...

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Авторы не имеют подтверждений.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
10 mL serological pipetFalcon357551Sterile, polystyrene
100 mm platesFalcon351029Treated, sterile cell culture dish
15 mL sterile tubesFalcon352097Centrifuge sterile tubes, polypropylene
24-well platesFalcon353935Clear, flat bottom, treated multiwell cell culture plate, with lid, sterile
25 mL serological pipetFalcon357525Sterile, polystyrene
35 mm platesFalcon353001Treated, sterile cell culture dish
5 mL serological pipetFalcon357543Sterile, polystyrene
50 mL sterile tubesFalcon352098Centrifuge sterile tubes, polypropylene
Advanced DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)Gibco12491-015Store at 2-8 °C; avoid exposure to light
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)Sigma- AldrichD6429-500mlStore at 2-8 °C; avoid exposure to light
Fetal Bovine SerumSigma- AldrichF9665-500mlStore at -20 °C. The serum should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles
Hank's Balanced Salt SolutionSigma- AldrichH1387-1LPowder
L-glutamineLonzaBE17-605EStore at -20 °C. It should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles
Lipofectamine RNAiMAX Transfection ReagentINVITROGEN13778-030Synthetic siRNA Transfection Reagent; store at 2-8 °C
MatrigelCORNING354234Basement Membrane Matrix, store at -20 °C. Avoid multiple freeze-thaws.
Neubauer ChamberVWR631-1116Hemocytometer
NutriStem XF Culture MediumBiological Industries05-100-1A-500mlXeno-free, serum-free, low growth factor human ESC/iPSC culture medium. Store at -20 °C. Upon thawing, the medium may be stored at 2-8 °C for 14 days. Media should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles.
Opti-MEMGibco31985-062-100mlReduced-Serum Medium; store at 2-8 °C; avoid exposure to light
Penicillin and StreptomycinSigma- AldrichP4333-100mlStore at -20 °C. The solution should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles
Potassium ChlorideSigma- AldrichP9333Powder
Potassium Phosphate MonobasicSigma- AldrichP5665Powder
RNase-free 0.5 mL tubesEppendorfH0030124537RNase-free sterile, microfuge tubes, polypropylene
RNase-free 1.5 mL tubesEppendorfH0030120086RNase-free sterile, microfuge tubes, polypropylene
RNaseZAPINVITROGENAM9780Cleaning agent for removing RNase
Sodium BicarbonateSigma- AldrichS5761Powder
Sodium ChlorideSigma- AldrichS7653Powder
Sodium Phosphate DibasicSigma- Aldrich94046Powder
StemRNA 3rd Gen Reprogramming KitReprocell00-0076Third Generation NM-RNAs-based Reprogramming Kit for Cellular Reprogramming of Fibroblasts, Blood, and Urine. Store at or below -70 °C.
Trypsin-EDTASigma- AldrichT4049-100mlStore at -20 °C. It should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles

Ссылки

  1. Lo, B., Parham, L. Ethical Issues in Stem Cell Research. Endocrine Reviews. 30 (3), 204-213 (2009).
  2. Wong, W. T., Sayed, N., Cooke, J. P. Induced Pluripotent Stem Cells: How They Will Change the Practice of Cardiovascular Medicine. Methodist Debakey Cardiovasc Journal. 9 (4), 206-209 (2013).
  3. Singh, V. K., Kalsan, M., Kumar, N., Saini, A., Chandra, R. Induced pluripotent stem cells: applications in regenerative medicine, disease modeling, and drug discovery. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 3, 2 (2015).
  4. Zacharias, D. G., Nelson, T. J., Mueller, P. S., Hook, C. C. The science and ethics of induced pluripotency: what will become of embryonic stem cells. Mayo Clinic Proceedings. 86 (7), 634-640 (2011).
  5. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  6. Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).
  7. Yu, Y., Wang, X., Scott, L., Nyberg, S. L. Application of Induced Pluripotent Stem Cells in Liver Diseases. Journal Cell Medicine. 3 (3), 997-1017 (2014).
  8. Ebert, A. D., Liang, P., Wu, J. C. Induced pluripotent stem cells as a disease modeling and drug screening platform. Journal Cardiovascular Pharmacology. 60 (4), 408-416 (2012).
  9. Gupta, S., Sharma, V., Verma, R. S. Recent advances in induced pluripotent stem cell (ipsc) based therapeutics. Journal of Stem Cell Research and Therapy. 3 (3), 263-270 (2017).
  10. Andargie, A., Tadesse, F., Shibbiru, T. Review on Cell Reprogramming: Methods and Applications. Journal of Medicine, Physiology and Biophysics. 25, 2422 (2016).
  11. Warren, L., et al. Highly efficient reprogramming to pluripotency and directed differentiation of human cells using synthetic modified mRNA. Cell Stem Cell. 7 (5), 618-630 (2010).
  12. Malik, N., Rao, M. R. A Review of the Methods for Human iPSC Derivation. Methods in Molecular Biology. 997, 23-33 (2013).
  13. Poleganov, M. A., et al. Efficient Reprogramming of Human Fibroblasts and Blood-Derived Endothelial Progenitor Cells Using Nonmodified RNA for Reprogramming and Immune Evasion. Human Gene Therapy. 26 (11), 751-766 (2015).
  14. Brouwer, M., Zhou, H., Kasri, N. N. Choices for Induction of Pluripotency: Recent Developments in Human Induced Pluripotent Stem Cell Reprogramming Strategies. Stem Cell Reviews and Reports. 12, 54-72 (2016).
  15. Revilla, A., et al. Current advances in the generation of human iPS cells: implications in cell-based regenerative medicine. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 10, 893-907 (2016).
  16. Lee, Y. S., et al. Exosome-Mediated Ultra-Effective Direct Conversion of Human Fibroblasts into Neural Progenitor-like Cells. ACS Nano. 12 (3), 2531-2538 (2018).
  17. Bayart, E., Cohen-Haguenauer, O. Technological overview of iPS induction from human adult somatic cells. Current Gene Therapy. 13 (2), 73-92 (2013).
  18. Sacco, A. M., et al. Diversity of dermal fibroblasts as major determinant of variability in cell reprogramming. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (6), 4256-4268 (2019).
  19. Shan, Z. Y., et al. Continuous passages accelerate the reprogramming of mouse induced pluripotent stem cells. Cellular Reprogramming. 16 (1), 77-83 (2014).
  20. Schlaeger, T. M., et al. A comparison of non-integrating reprogramming methods. Nature Biotechnology. 33 (1), 58-63 (2015).
  21. Drews, K., Tavernier, G., Demeester, J., et al. The cytotoxic and immunogenic hurdles associated with non-viral mRNA-mediated reprogramming of human fibroblasts. Biomaterials. 33, 4059-4068 (2012).
  22. Beissert, T., et al. Improvement of In Vivo Expression of Genes Delivered by Self-Amplifying RNA Using Vaccinia Virus Immune Evasion Proteins. Human Gene Therapy. 28 (12), 1138-1146 (2017).
  23. Mathieu, J., et al. Hypoxia induces re-entry of committed cells into pluripotency. Stem Cells. 31 (9), 1737-1748 (2013).
  24. Wang, Y., et al. Hypoxia Enhances Direct Reprogramming of Mouse Fibroblasts to Cardiomyocyte-Like Cells. Cellular Reprogramming. 18 (1), 1-7 (2016).
  25. Deng, Y., et al. Hypoxia enhances buffalo adipose-derived mesenchymal stem cells proliferation, stemness, and reprogramming into induced pluripotent stem cells. Journal of Cellular Physiology. 234 (10), 17254-17268 (2019).
  26. Karagiannis, P., et al. Induced Pluripotent Stem Cells and Their Use in Human Models of Disease and Development. Physiological Reviews. 99 (1), 79-114 (2019).
  27. Maherali, N., Hochedlinger, K. Guidelines and techniques for the generation of induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 3 (6), 595-605 (2008).
  28. Asprer, J. S., Lakshmipathy, U. Current methods and challenges in the comprehensive characterization of human pluripotent stem cells. Stem Cell Reviews and Reports. 11 (2), 357-372 (2015).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

155iPSCs

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены