JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يصف هذا البروتوكول طريقة شائعة وممكنة للحث على إصابة الكبد الحادة (ALI) عبر التعرض CCl4 من خلال أنبوب أموالمعدة. CCl4 التعرض يحفز ALI من خلال تشكيل أنواع الأكسجين التفاعلي خلال تحولها الحيوي في الكبد. وتستخدم هذه الطريقة لتحليل الفيزيولوجيا المرضية من ALI وفحص استراتيجيات الكبد المختلفة.

Abstract

إصابة الكبد الحادة (ALI) تلعب دورا حاسما في تطور الفشل الكبدي، الذي يتميز بضعف الكبد الشديد بما في ذلك مضاعفات مثل اعتلال الدماغ الكبدي وضعف تخليق البروتين. النماذج الحيوانية المناسبة حيوية لاختبار آلية والفيزيولوجيا المرضية لALI والتحقيق في استراتيجيات الكبد المختلفة. نظرا لقدرته على إجراء التحولات الكيميائية، ويستخدم على نطاق واسع رباعي كلوريد الكربون (CCl4)في الكبد للحث علي من خلال تشكيل أنواع الأكسجين التفاعلي. يمكن إجراء التعرض CCl4 داخل perperitoneally ، عن طريق الاستنشاق ، أو من خلال أنبوب الأنفي ة أو الأوروالمعدة. هنا ، نصف نموذج القوارض ، حيث يتم حث ALI من قبل التعرض CCl4 من خلال أنبوب أموالمعدة. هذه الطريقة غير مكلفة ، ويسهل تنفيذها ، ولها الحد الأدنى من خطر الخطر. النموذج قابل للاستنساخ للغاية ويمكن استخدامه على نطاق واسع لتحديد فعالية الاستراتيجيات المحتملة للوقاية الكبدية وتقييم علامات إصابة الكبد.

Introduction

ويتزايد تواتر الإهانات السامة للكبد، لا سيما بسبب تعاطي الكحول والمخدرات. ترتبط إصابة الكبد الحادة (ALI) بارتفاع معدلات الوفيات وتسببت في مخاوف سريرية1,2. تؤدي الإصابة السامة إلى مسارات تشير إلى الموت في الكبد ، مما يؤدي إلى موت الخلايا العضوية في الكبد ، أو النخر ، أو البيروبات. يلعب ALI دورًا حاسمًا في تطور الفشل الكبدي ، والذي يتميز بخلل حاد في الكبد بما في ذلك مضاعفات مثل اعتلال الدماغ الكبدي وضعف تخليق البروتين3،4. على الرغم من أن الأبحاث الحديثة قد زادت معرفتنا حول التغيرات الفسيولوجية والمرضية المصاحبة للفشل الكبدي ، إلا أنها لم تشرح تمامًا السمات الجزيئية المرضية التي تؤثر على آليات موت الخلايا. وعلاوة على ذلك، لا توجد أدوية متاحة حاليا لعكس التدهور التدريجي في المرضى ALI. حاليا، والعلاج الوحيد الفعال بشكل ملحوظ هو زرع الكبد5،6.

من أجل التحقيق في آلية والفيزيولوجيا المرضية من ALI واختبار استراتيجيات مختلفة للوقاية الكبدية، وتستخدم نماذج الحيوانات المختلفة للحث علي. يجب أن يحاكي النموذج الحيواني المفضل لـ ALI العملية المرضية للمرض عن طريق طريقة موثوقة ومعتمدة وغير مكلفة وسهلة التطبيق. ومن أمثلة النماذج التجريبية العوامل السامة للكبد، والعمليات الجراحية مثل استئصال الكبد الكلي أو الجزئي، وإزالة الأوعية الدموية بشكل كامل أو عابر، والإجراءات المعدية7،8،9. وتشمل المواد السامة للكبد المعروفة الجالاكتوزين والأسيتامينوفين والثيواسيتاميد والأزوكروميثان وCCl4. من هذه، يستخدم CCl4 على نطاق واسع على الرغم من أنه لم يتم حتى الآن وصف جيد10،11،12،13.

CCl4 هو مركب سائل عضوي عديم اللون مع رائحة حلوة ولا يكاد يكون قابلية للاشتعال في درجات حرارة أقل. التعرض لتركيزات عالية من CCl4 يمكن أن يسبب ضررا للجهاز العصبي المركزي، بما في ذلك تدهور الكبد والكلى. CCl4 يحفز ALI من خلال التحول الحيوي في الكبد، والذي يشكل أنواع الأكسجين التفاعلي. يحدث هذا عن طريق إنزيم السيتوكروم P450 2E1 ، مما يشكل المستقلب النشط ويؤدي إلى تلف الخلايا عن طريق ربط جزيء الماكرو ، وتعزيز بيروكسيد الدهون واضطراب التوازن الكالسيوم داخل الخلايا14. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام نموذج CCl4 لتحفيز الخلايا الفلكية على مستوى تخليق الحمض النووي الريبي15. وقد تم إعطاء هذا البذين الكبد بواسطة الطرق داخل perperitoneal، داخل البوابة، عن طريق الفم، وداخل المعدة16.

في هذا البروتوكول، ونحن نصف4بالتفصيل CCl 4-المستحثة ALI في الفئران عبر أنبوب orogastric. هذا الأسلوب يحفز قوية وقابلة للاستنساخ ALI التي يمكن استخدامها للتحقيق في الإمراض من ALI. يتم رصد تحديد شدة مرض الكبد عن طريق قياس الغلوتامات في الدم في الدم الترانساميناز (GPT) ، وإنزيمات الغلوتاماسيمية الغلوتازية الترانساميناز (GOT) ومجموع البيليروبين (السل) وكذلك التشخيص النسيجي النهائي بواسطة الهيماتوكسيلين والإيوسين (H & E) أنسجة الكبد الملطخة. التعرض لCCl4 من خلال الوصول داخل المعدة يسمح لطريقة عملية وغير مكلفة وطفيفة التوغل مع الحد الأدنى من خطر الخطر.

Protocol

وأجريت التجارب وفقا لتوصيات إعلاني هلسنكي وطوكيو والمبادئ التوجيهية لاستخدام الحيوانات التجريبية للجماعة الأوروبية. وقد وافقت لجنة رعاية الحيوانات التابعة لجامعة بن غوريون في النقب على هذه التجارب.

ملاحظة: تم إنشاء نموذج CCl4 واستخدامه في دراسة سابقة17. يتم عرض الجدول الزمني للبروتوكول في الجدول 1.

1. إعداد الفئران للإجراء التجريبي

ملاحظة: اختر فئران سبراغ داولي الذكور البالغين التي تزن 300-350 غرام.

  1. الحصول على الموافقة على التجارب من اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوان واستخدامه (IACUC).
  2. الحفاظ على الفئران في درجة حرارة الغرفة (22 درجة مئوية ± 1 درجة مئوية)، مع ضوء 12 ساعة و 12 ساعة دورات مظلمة. توفير تشاو الفئران والمياه الإعلانية libitum.
  3. إجراء جميع التجارب بين الساعة 6:00 صباحاً و12:00 ظهراً.
  4. قم بسلخ الفئران وتطهير الجلد بالكحول.

2. تحديد مستويات خط الأساس للمصل GOT و GPT والسل

  1. التخدير
    1. إعداد نظام إدارة الإيزوفدران المستمر للحث على التخدير. تأكد من أن نظام المبخّر مليء بالإيزوفدران.
    2. قم بأشيذ الجرذ مع 2% من الإيزوفيران تأكد من أن الفئران هو مُسطّح بالكامل من خلال مراقبة الحركة وانعكاس الدواسة استجابة للمحفزات الخارجية.
      ملاحظة: استخدم 1-5% إيلوفوران لتحريض التخدير وصيانته.
  2. Cannulate الوريد الذيل مع قسطرة 22 G.
  3. جمع عينة دم 0.5 مل عند خط الأساس. تأكد من أن حجم الدم الذي تم استرداده لا يتجاوز إرشادات IACUC.
  4. إجراء تحليل كيميائي حيوي للدم بما في ذلك قياسات المصل GOT، GPT والسل، كما وصف سابقا18.
    ملاحظة: أجريت فحوص لإنزيمات الكبد ومستوى السل في المختبر الكيميائي الحيوي التابع لمركز سوروكا الطبي. تم تحليل عينات الدم باستخدام طريقة الفلورسينس على محلل الكيمياء(جدول المواد).

3. تحريض إصابات الكبد الحادة في الفئران

تنبيه: التعرض لتركيزات عالية من CCl4، بما في ذلك الامتصاص من خلال البخار أو الجلد ، يمكن أن يكون له آثار سلبية على الجهاز العصبي المركزي ويسبب انحطاط الكبد والكلى. التعرض لفترات طويلة يمكن أن يسبب غيبوبة أو الموت.

  1. إعداد حل 50٪ من CCl4 (جدول المواد)عن طريق خلط CCl4 مع زيت الزيتون كسيارة بنسبة 1:1.
    ملاحظة: يجب إعداد الحل وفقًا لإرشادات IACUC للمركبات غير الصيدلانية.
  2. حث سمية الكبد في الجسم الحي من قبل إدارة CCl4 عبر أنبوب الأوروالمعدة.
    1. إدراج أنبوب 16 غ orogastric (3 بوصات عميقة) من خلال تجويف الفم من الفئران.
    2. تعريض الجرذ لجرعات مختلفة من CCl4 عن طريق حقن حقنة مع واحدة من الحلول المخففة التالية في معدة الفئران: 1 مل / كجم (ALI خفيفة) ، 2.5 مل / كجم (ALI معتدلة) ، أو 5 مل / كجم (ALI شديدة) من محلول 50٪. بالنسبة لمجموعة التحكم التي تعمل بشام، اعرض الجرذ لزيت الزيتون 5 مل/كغ فقط.

4. تحديد المصل GOT، GPT، ومستويات السل بعد 24 ساعة

  1. التخدير
    1. إعداد نظام إدارة الإيزوفدران المستمر للحث على التخدير. تأكد من أن نظام المبخّر مليء بالإيزوفدران.
    2. قم بأضاة الفئران بـ 2% من الإيزوفيران تأكد من أن الفئران هو مُسطّح بالكامل من خلال مراقبة الحركة وانعكاس الدواسة استجابة للمحفزات الخارجية.
  2. جمع عينات الدم في 24 ساعة من التعرض CCl4.
  3. إجراء تحليل كيميائي حيوي للدم بما في ذلك قياسات المصل GOT و GPT والسل.

5. جمع الكبد للفحص النسيجي

  1. القتل الرحيم للفأر عن طريق استبدال خليط الغاز المستوحى بنسبة 20٪ O2/80٪ CO2. تأكد من تسليمثاني أكسيد الكربون بمعدل محدد مسبقًا وفقًا للمبادئ التوجيهية لـ IACUC.
  2. ضمان الوفاة عن طريق التحقق من عدم وجود ضربات القلب وتأكيد من خلال طريقة ثانوية وفقا للمبادئ التوجيهية IACUC.
  3. ضع الجرذ على لوحة تشريح مع سطحه الظهري الذي يواجه أسفل والبطن التي تواجه. اقطع بطن الفأر
  4. مع مشرط، وقاطعة طول كامل من الجلد تنفيس من فتحة للشقإلى الذقن. فصل الجلد. اقطع جدار البطن بمشرط من الياب إلى الغضروف الإكسيفود، مما يعرض لزوجة البطن.
  5. باستخدام مقص وملقط، وعزل الكبد عن طريق تشريح ه من الأربطة والمرفقات. بدءا من هيلم الكبد، وإجراء بعناية استئصال الكبد عن طريق الإفراج عن جميع فصوص الكبد من المرفقات. تشريح وقطع جميع الأربطة والأوعية الدموية.
  6. نقل الكبد إلى طبق بيتري. إصلاح الكبد في محلول الفورمالديهايد المخزنة مؤقتا 4٪(جدول المواد)لمدة لا تقل عن 24 ساعة.

6- الفحص النسيجي

  1. إعداد العينة
    1. بعد التثبيت، قم بقص العينة إلى سلسلة شرائح سميكة بـ 5 ميكرومتر عن طريق المقاطع المجهرية.
    2. ضع الشرائح برفق على شرائح زجاجية مع فرشاة ناعمة، شريحة واحدة لكل شريحة.
    3. أداء H & E تلطيخ كما وصف سابقا19.
  2. فحص الشرائح تحت المجهر في التكبير 200x باستخدام عدسة موضوعية 20 ملم(جدول المواد).
    ملاحظة: يجب تصنيف أقسام الكبد من قبل أخصائي أمراض متخصص أعمى إلى بروتوكول العلاج. درجة 0 يشير إلى عدم وجود تشوهات في الكبد, 1-2 يشير إلى إصابة الكبد خفيفة, 3-4 يشير إلى إصابة الكبد معتدلة, و 5-6 يشير إلى إصابة شديدة في الكبد20,,21,,22.

النتائج

مستويات السل، GOT، وGPT زيادة كبيرة 24 ساعة بعد حث ALI (أكثر في جرعات CCl4 أعلى) مقارنة مع الضوابط التي تعمل بصور (ع < 0.001)(الشكل 1). وكانت مستويات السل، وGOT، وGPT عند خط الأساس طبيعية ولم تكن مختلفة بشكل كبير عن الضوابط التي تعمل بصورية. في 24 ساعة، جميع المجموعات التدخلية الثلاث، 1 ?...

Discussion

في هذا البروتوكول، يستخدم CCl4 كسم كبد يُحث على الحث على الـ ALI في الفئران. يتميز ALI بفقدان parenchyma الكبدي وdysregulation اللاحق لوظائف الكبد الأيضية والاصطناعية. الأدوية والفيروسات والسموم وأمراض المناعة الذاتية وأمراض التمثيل الغذائي واضطرابات الأوعية الدموية كلها تحفز موت الكبد ، والاستج?...

Disclosures

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

ويشكر المؤلفان بامتنان بيرثا دلغادو، قسم علم الأمراض، مركز سوروكا الطبي، كلية العلوم الصحية، جامعة بن غوريون في النقب، لمساعدتها في المختبر وكذلك في تحليل علم الأنسجة.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
22 G catheter BD Neoflon TMBecton Dickinson Infusion Therapy AB
4% buffered formaldehyde solutionSigma - Aldrich lab materials technologies
BD Microtainer SST TM TubesBecton Dickinson and Company
Carbone tetrachlorideSigma - Aldrich lab materials technologiesCAS 56-23-5
Isofluran, USP 100%Piramamal Critical Care, Inc
Olympus AU2700 Chemistry-Immuno AnalyzerOlympus (MN, USA)Analysis of blood samples was done by the fluorescence method
Olympus BX 40 microscopeOlympus
RAT Feeding NeedlesORCHID SCIENTIFICS
SYRINGE SET 1 and 2 ml MEDI -PLUSShandong Zibo Shanchuan Medical Instruments Co., Ltd

References

  1. Hoofnagle, J. H., Carithers, R. L., Shapiro, C., Ascher, N. Fulminant hepatic failure: Summary of a workshop. Hepatology. 21 (1), 240-252 (1995).
  2. Rakela, J., Lange, S. M., Ludwig, J., Baldus, W. P. Fulminant hepatitis: Mayo clinic experience with 34 cases. Mayo Clinic Proceedings. 60 (5), 289-292 (1985).
  3. Riordan, S. M., Williams, R. Treatment of hepatic encephalopathy. New England Journal of Medicine. 337, 473-479 (1997).
  4. Bernuau, J., Rueff, B., Benhamou, J. Fulminant and subfulminant liver failure: Definitions and causes. Seminars in Liver Disease. 6 (2), 97-106 (1986).
  5. Lidofsky, S. D. Liver transplantation for fulminant hepatic failure. Gastroenterology Clinics of North America. 22 (2), 257-269 (1993).
  6. Auzinger, G., Wendon, J. Intensive care management of acute liver failure. Current opinion in critical care. 14 (2), 179-188 (2008).
  7. Wu, Q., et al. Protection of regenerating liver after partial hepatectomy from carbon tetrachloride hepatotoxicity in rats: Roles of mitochondrial uncoupling protein 2 and ATP stores. Digestive Diseases and Sciences. 54 (9), 1918-1925 (2009).
  8. Tuñón, M. J., Alvarez, M., Culebras, J. M., González-Gallego, J. An overview of animal models for investigating the pathogenesis and therapeutic strategies in acute hepatic failure. World Journal of Gastroenterologyl. 15 (25), 3086-3098 (2009).
  9. van de Kerkhove, M. P., Hoekstra, R., van Gulik, T. M., Chamuleau, R. A. Large animal models of fulminant hepatic failure in artificial and bioartificial liver support research. Biomaterials. 25 (9), 1613-1625 (2004).
  10. Butterworth, R. F., et al. Experimental models of hepatic encephalopathy: ISHEN guidelines. Liver International. 29 (6), 783-788 (2009).
  11. Zhang, B., Gong, D., Mei, M. Protection of regenerating liver after partial hepatectomy from carbon tetrachloride hepatotoxicity in rats: Role of hepatic stimulator substance. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 14 (10), 1010-1017 (1999).
  12. Ugazio, G., Danni, O., Milillo, P., Burdino, E., Congiu, A. M. Mechanism of protection against carbon tetrachloride toxicity. I. prevention of lethal effects by partial surgical hepatectomy. Drug and Chemical Toxicology. 5 (2), 115-124 (1982).
  13. Taniguchi, M., Takeuchi, T., Nakatsuka, R., Watanabe, T., Sato, K. Molecular process in acute liver injury and regeneration induced by carbon tetrachloride. Life Science. 75 (13), 1539-1549 (2004).
  14. Gordis, E. Lipid metabolites of carbon tetrachloride. Journal of Clinical Investigation. 48 (1), 203-209 (1969).
  15. Albrecht, J. Cerebral RNA synthesis in experimental hepatogenic encephalopathy. Journal of Neuroscience Research. 6 (4), 553-558 (1981).
  16. Terblanche, J., Hickman, R. Animal models of fulminant hepatic failure. Digestive Diseases and Sciences. 36 (6), 770-774 (1991).
  17. Gruenbaum, B. F., et al. Cell-free DNA as a potential marker to predict carbon tetrachloride-induced acute liver injury in rats. Hepatology International. 7 (2), 721-727 (2013).
  18. Juricek, J., et al. Analytical evaluation of the clinical chemistry analyzer Olympus AU2700 plus. Biochemia Medica. 20 (3), 334-340 (2010).
  19. Feldman, A. T., Wolfe, D. Tissue processing and hematoxylin and eosin staining. Methods in Molecular Biology. 1180, 31-43 (2014).
  20. Wang, T., et al. Protective effects of dehydrocavidine on carbon tetrachloride-induced acute hepatotoxicity in rats. Journal of Ethnopharmacology. 117 (2), 300-308 (2008).
  21. Ye, X., et al. Hepatoprotective effects of coptidis rhizoma aqueous extract on carbon tetrachloride-induced acute liver hepatotoxicity in rats. Journal of Ethnopharmacology. 124 (1), 130-136 (2009).
  22. Wills, P. J., Asha, V. V. Protective effect of lygodium flexuosum (L.) sw. extract against carbon tetrachloride-induced acute liver injury in rats. Journal of Ethnopharmacology. 108 (3), 320-326 (2006).
  23. Senior, J. R. Monitoring for hepatotoxicity: What is the predictive value of liver "function" tests. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 85 (3), 331-334 (2009).
  24. Karmen, A. A note on the spectrometric assay of glutamic-oxalacetic transaminase in human blood serum. Journal of Clinical Investigation. 34 (1), 131-133 (1955).
  25. Hubner, G. Ultrastructural liver damage caused by direct action of carbon tetrachloride in vivo and in vitro. Virchows Archiv fur Pathologische Anatomie und Physiologie und fur Klinische Medizin. 339 (3), 187-197 (1965).
  26. Newsome, P. N., Plevris, J. N., Nelson, L. J., Hayes, P. C. Animal models of fulminant hepatic failure: A critical evaluation. Liver Transplantation. 6 (1), 21-31 (2000).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

158 ALI CCl4

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved