Induire des lésions hépatiques aigues chez les rats via le tétrachlorure de carbone (CCl4) Exposition par un tube orogastricrique

Résumé

Ce protocole décrit une méthode commune et faisable d’induire des lésions hépatiques aigues (ALI) par l’intermédiaire de l’exposition CC₄ par un tube orogastricrique. L’exposition CC₄ induit l’ALI par la formation d’espèces réactives d’oxygène pendant sa biotransformation dans le foie. Cette méthode est utilisée pour analyser la pathophysiologie d’ALI et examiner différentes stratégies hépatoprotectives.

Résumé

Les lésions hépatiques aigues (ALI) jouent un rôle crucial dans le développement de l’échec hépatique, qui se caractérise par un grave dysfonctionnement hépatique comprenant des complications telles que l’encéphalopathie hépatique et une synthèse altérée des protéines. Les modèles animaux appropriés sont essentiels pour tester le mécanisme et la pathophysiologie de l’ALI et étudier différentes stratégies hépatoprotectrices. En raison de sa capacité à effectuer des transformations chimiques, le tétrachlorure de carbone (CCl₄) est largement utilisé dans le foie pour induire ALI par la formation d’espèces réactives d’oxygène. L’exposition CC₄ peut être effectuée par inhalation, ou par un tube nasogastrique ou orogastricrique. Ici, nous décrivons un modèle de rongeur, dans lequel ALI est induit par l’exposition CCl₄ par un tube orogastricrique. Cette méthode est peu coûteuse, facile à exécuter, et a un risque minimal. Le modèle est hautement reproductible et peut être largement utilisé pour déterminer l’efficacité des stratégies hépatoprotective potentielles et évaluer les marqueurs des lésions hépatiques.

Introduction

La fréquence des insultes toxiques au foie, en particulier en raison de l’abus d’alcool et de drogues, augmente. Les lésions hépatiques aigues (ALI) sont associées à des taux de mortalité élevés et ont causé des préoccupations cliniques^1,2. Les dommages toxiques mènent aux voies de signalisation de mort dans le foie, ayant comme conséquence l’apoptosis d’hépatocyte, la nécrose, ou la pyroptose. ALI joue un rôle crucial dans le développement de l’échec hépatique, qui se caractérise par un dysfonctionnement hépatique grave, y compris des complications telles que l’encéphalopathie hépatique et la synthèse des protéines altérées^3,4. Bien que la recherche récente ait augmenté nos connaissances sur les changements physiologiques et pathologiques accompagnant l’échec hépatique, elle n’a pas expliqué complètement les dispositifs pathomoléculaires qui affectent les mécanismes de la mort cellulaire. En outre, aucun médicament n’est actuellement disponible pour inverser la détérioration progressive des patients d’ALI. Actuellement, le seul traitement significativement efficace est la transplantation hépatique^5,6.

Afin d’étudier le mécanisme et la pathophysiologie de l’ALI et de tester différentes stratégies hépatoprotective, différents modèles animaux sont utilisés pour induire ALI. Un modèle animal préférable d’ALI devrait imiter le processus pathologique de la maladie par l’intermédiaire d’une méthode fiable, validée, peu coûteuse et facile à appliquer. Des exemples de modèles expérimentaux incluent des agents hépatoxiques, des procédures chirurgicales telles que l’hépatectomie totale ou partielle, la dévascularisation complète ou transitoire, et les procédures infectieuses^7,8,9. Les substances hépatoxiques connues incluent la galactosamine, l’acétaminophène, le thioacetamide, l’azoxymethane et le CC_4. Parmi ceux-ci, CCl₄ est largement utilisé, bien qu’il n’ait pas encore été bien caractérisé^10,11,12,13.

CC₄ est un composé liquide organique incolore avec une odeur sucrée et presque pas d’inflammabilité à des températures plus basses. L’exposition à des concentrations élevées de CC₄ peut endommager le système nerveux central, y compris la détérioration du foie et des reins. CCl₄ induit ALI par sa biotransformation dans le foie, qui forme des espèces réactives d’oxygène. Ceci se produit par l’enzyme cytochrome de P450 2E1, formant un métabolite actif et ayant pour résultat des dommages de cellules par la liaison de macromolécule, l’amélioration de la peroxydation de lipide et la perturbation de l’homéostasie intracellulaire de calcium^14. En outre, le modèle CC₄ peut être utilisé pour stimuler les astrocytes au niveau de la synthèse de l’ARN¹⁵. Cette hépatotoxine a été administrée par les voies intraperitonéales, intraportaires, orales et intragastriques¹⁶.

Dans ce protocole, nous décrivons en détail CCl_4-induitALI chez les rats via un tube orogastric. Cette méthode induit l’ALI robuste et reproductible qui peut être utilisé pour étudier la pathogénie d’ALI. La détermination de la sévérité de maladie de foie est surveillée par mesure du transaminase glutamate-pyruvate de sérum (GPT), des enzymes transaminase oxaloacétiques glutamiques (GOT) et de la bilirubin (TB) totale ainsi que par le diagnostic histologique définitif par des foies de tissu souillé d’hématoxyline et d’éosine (H et E). L’exposition au CCl₄ par un accès intragastrique permet une méthode pratique, peu coûteuse et peu invasive avec un risque minimal.

Protocole

Les expériences ont été menées conformément aux recommandations des Déclarations d’Helsinki et de Tokyo et aux Lignes directrices pour l’utilisation des animaux expérimentaux de la Communauté européenne. Les expériences ont été approuvées par le Comité de soins aux animaux de l’Université Ben-Gourion du Néguev.

REMARQUE : Le modèle CC₄ a été généré et utilisé dans une étude précédente¹⁷. Le calendrier du protocole est démontré dans le tableau 1.

1. Préparation des rats à la procédure expérimentale

REMARQUE : Sélectionnez des rats Sprague Dawley mâles adultes pesant de 300 à 350 g.

1. Obtenir l’approbation des expériences du Comité des soins et de l’utilisation des animaux institutionnels (IACUC).
2. Maintenir les rats à température ambiante (22 oC à 1 oC), avec des cycles légers et 12 h légers et 12 h. Fournir du chow de rat et de l’eau ad libitum.
3. Effectuer toutes les expériences entre 6 h et 12 h.
4. Raser le rat et désinfecter la peau avec de l’alcool.

2. Détermination des niveaux de référence du Sérum GOT, du TPG et de la tuberculose

1. Anesthésie
   1. Préparer un système continu d’administration d’isoflurane pour induire l’anesthésie. Assurez-vous que le système de vaporisateur est rempli d’isoflurane.
   2. Anesthésiez le rat avec 2% d’isoflurane. Confirmez que le rat est entièrement anesthésié en observant le réflexe de mouvement et de pédale en réponse à des stimuli externes.
      REMARQUE : Utilisez 1 à 5 % d’isoflurane pour l’induction et l’entretien de l’anesthésie.
2. Cannulate la veine de queue avec un cathéter de 22 G.
3. Recueillir un échantillon de sang de 0,5 ml à la ligne de base. Assurez-vous que le volume sanguin récupéré ne dépasse pas les lignes directrices de l’IACUC.
4. Effectuer l’analyse biochimique du sang, y compris les mesures du sérum GOT, GPT et TB, comme précédemment décrit¹⁸.
   REMARQUE : Des examens des enzymes hépatiques et du niveau de tuberculose ont été effectués dans le laboratoire biochimique du centre médical de Soroka. Des échantillons de sang ont été analysés à l’aide d’une méthode de fluorescence sur un analyseur de chimie(Tableau des matériaux).

3. Induction d’une lésion hépatique aigue chez les rats

CAUTION: L’exposition à des concentrations élevées de CC₄, y compris l’absorption par la vapeur ou la peau, peut avoir des effets négatifs sur le système nerveux central et provoquer la dégénérescence du foie et des reins. Une exposition prolongée peut causer le coma ou la mort.

1. Préparer une solution de 50% de CC₄ (Tableau des matériaux) en mélangeant CCl₄ avec de l’huile d’olive comme véhicule dans un rapport de 1:1.
   REMARQUE : La solution doit être préparée conformément aux lignes directrices de l’IACUC pour les composés non pharmaceutiques.
2. Induire l’hépatotoxicité in vivo par l’administration CC₄ par l’intermédiaire d’un tube orogastric.
   1. Insérez un tube orogastricrique de 16 G (3 pouces de profondeur) à travers la cavité buccale du rat.
   2. Exposez le rat à différentes doses de CC₄ en injectant une seringue avec l’une des solutions diluées suivantes dans l’estomac du rat : 1 ml/kg (ALI doux), 2,5 mL/kg (ALI modéré), ou 5 ml/kg (ALI sévère) de la solution de 50 %. Pour le groupe témoin à faux- actionnel, exposez le rat à l’huile d’olive de 5 ml/kg seulement.

4. Détermination des niveaux de GOT, GPT et TB après 24 h

1. Anesthésie
   1. Préparer un système continu d’administration d’isoflurane pour induire l’anesthésie. Assurez-vous que le système de vaporisateur est rempli d’isoflurane.
   2. Anesthésiez les rats avec 2% d’isoflurane. Confirmez que le rat est entièrement anesthésié en observant le réflexe de mouvement et de pédale en réponse à des stimuli externes.
2. Recueillir des échantillons de sang à 24 h de l’exposition CC_4.
3. Effectuez l’analyse biochimique du sang comprenant des mesures du sérum GOT, du TPG et de la tuberculose.

5. Collecte de foie pour l’examen histologique

1. Euthanasiez le rat en remplaçant le mélange de gaz inspiré par 20% O₂/80% DE CO₂. Veiller à ce que le CO₂ soit livré à un taux prédéterminé conformément aux lignes directrices de l’IACUC.
2. Assurer la mort en vérifiant l’absence de battements de cœur et confirmer par une méthode secondaire conformément aux lignes directrices de l’IACUC.
3. Placez le rat sur une planche de dissection avec sa surface dorsale face vers le bas et l’abdomen face vers le haut. Rasez l’abdomen du rat.
4. Avec un scalpel, incisez toute la longueur de la peau ventrique de l’anus au menton. Séparez la peau. Incisez la paroi abdominale avec un scalpel de l’anus au cartilage xyphoïde, exposant les viscères abdominales.
5. À l’aide de ciseaux et de forceps, isolez le foie en le disséquant de ses ligaments et de ses attachements. À partir du hilum du foie, effectuer soigneusement une hépatectomie en libérant tous les lobes de foie des pièces jointes. Disséquer et couper tous les ligaments et les vaisseaux sanguins.
6. Transférer le foie dans un plat Petri. Fixer le foie dans une solution de formaldéhyde tampon de 4 %(tableau des matériaux) pendant au moins 24 h.

6. Examen histologique

1. Préparation de l’échantillon
   1. Après fixation, couper l’échantillon en série de tranches de 5 m d’épaisseur par section de microtomes.
   2. Placer délicatement les tranches sur des toboggans en verre avec une brosse molle, 1 tranche par lame.
   3. Effectuer la coloration de H et E comme décrit précédemment¹⁹.
2. Examinez les tranches au microscope au grossissement 200x à l’aide d’une lentille objective de 20 mm(Tableau des matériaux).
   REMARQUE : Les sections hépatiques doivent être notées par un pathologiste spécialisé aveuglé au protocole de traitement. Un score de 0 n’indique aucune anomalie hépatique, 1-2 indique des lésions hépatiques légères, 3-4 indique des lésions hépatiques modérées, et 5-6 indique des lésions hépatiques graves^20,21,22.

Résultats

Les niveaux de tuberculose, de GOT et de TPG ont considérablement augmenté de 24 h après avoir incité l’ALI (plus à des doses plus élevées de CC₄₎ par rapport aux contrôles truqués (p’lt; 0,001)(figure 1). Les niveaux de tuberculose, de GOT et de TPG à la ligne de base étaient normaux et n’étaient pas significativement différents des contrôles truqués. À 24 h, les trois groupes d’intervention, 1 ml/kg CCl₄ (1, 1 à 2), 2,5 ml/kg CC₄ (3...

Discussion

Dans ce protocole, CCl₄ est utilisé comme une toxine hépatique pour induire ALI chez les rats. ALI est caractérisé par la perte de parenchyme hépatique et la dysrégulation subséquente des fonctions métaboliques et synthétiques du foie. Les médicaments, les virus, les toxines, les maladies auto-immunes, les maladies métaboliques et les troubles vasculaires induisent tous la mort hépatocyte, et la réponse inflammatoire suivante contribue à la pathogénie d’ALI.

L’ins...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
22 G catheter BD Neoflon TM	Becton Dickinson Infusion Therapy AB
4% buffered formaldehyde solution	Sigma - Aldrich lab materials technologies
BD Microtainer SST TM Tubes	Becton Dickinson and Company
Carbone tetrachloride	Sigma - Aldrich lab materials technologies	CAS 56-23-5
Isofluran, USP 100%	Piramamal Critical Care, Inc
Olympus AU2700 Chemistry-Immuno Analyzer	Olympus (MN, USA)		Analysis of blood samples was done by the fluorescence method
Olympus BX 40 microscope	Olympus
RAT Feeding Needles	ORCHID SCIENTIFICS
SYRINGE SET 1 and 2 ml MEDI -PLUS	Shandong Zibo Shanchuan Medical Instruments Co., Ltd