Induzindo lesão hepática aguda em ratos via tetracloreto de carbono (CCl4) exposição através de um tubo orogástrico

Resumo

Este protocolo descreve um método comum e viável de induzir lesão hepática aguda (ALI) através da exposição ao ClC₄ através de uma sonda orogástrica. A exposição ao CCl₄ induz ali através da formação de espécies reativas de oxigênio durante sua biotransformação no fígado. Este método é utilizado para analisar a fisiopatologia da ALI e examinar diferentes estratégias hepatoprotetoras.

Resumo

A lesão hepática aguda (ALI) desempenha um papel crucial no desenvolvimento da insuficiência hepática, que é caracterizada por disfunção hepática grave, incluindo complicações como encefalopatia hepática e síntese proteica prejudicada. Modelos animais adequados são vitais para testar o mecanismo e a fisiopatologia da ALI e investigar diferentes estratégias hepatoprotetoras. Devido à sua capacidade de realizar transformações químicas, o tetracloreto de carbono (CCl₄) é amplamente utilizado no fígado para induzir ali através da formação de espécies reativas de oxigênio. A exposição do_{ClC 4} pode ser realizada intraperitonicamente, por inalação ou por sonda nasogástrica ou orogástrica. Aqui, descrevemos um modelo de roedor, no qual ali é induzido pela exposição ccl₄ através de uma sonda orogástrica. Este método é barato, facilmente realizado e tem risco mínimo. O modelo é altamente reproduzível e pode ser amplamente utilizado para determinar a eficácia de potenciais estratégias hepatoprotetoras e avaliar marcadores de lesão hepática.

Introdução

A frequência de insultos tóxicos ao fígado, especialmente devido ao abuso de álcool e drogas, está aumentando. A lesão hepática aguda (ALI) está associada a altas taxas de mortalidade e tem causado preocupações clínicas^1,2. Lesões tóxicas levam à morte sinalizando caminhos no fígado, resultando em apoptose hepatocito, necrose ou piropose. A ALI desempenha um papel crucial no desenvolvimento da insuficiência hepática, caracterizada por disfunção hepática grave, incluindo complicações como encefalopatia hepática e síntese proteica prejudicada^3,4. Embora pesquisas recentes tenham aumentado nosso conhecimento sobre as mudanças fisiológicas e patológicas que acompanham a insuficiência hepática, ela não explicou completamente as características patomoleculares que afetam os mecanismos da morte celular. Além disso, não há medicamentos disponíveis atualmente para reverter a deterioração progressiva em pacientes ali. Atualmente, o único tratamento significativamente eficaz é o transplante hepático^5,6.

A fim de investigar o mecanismo e fisiopatologia da ALI e testar diferentes estratégias hepatoprotetoras, diferentes modelos animais são usados para induzir ali. Um modelo animal preferencial da ALI deve imitar o processo patológico da doença por meio de um método confiável, validado, barato e fácil de aplicar. Exemplos de modelos experimentais incluem agentes hepatotóxicos, procedimentos cirúrgicos como hepatectomia total ou parcial, devascularização completa ou transitória e procedimentos infecciosos^7,8,9. Substâncias hepatotóxicas conhecidas incluem galactosamina, acetaminofeno, thioacetamina, azoxymetano e ClC₄. Destes, o CCl₄ é amplamente utilizado, embora ainda não tenha sido bem caracterizado^10,11,12,13.

CCl₄ é um composto líquido incolor orgânico com um cheiro doce e quase nenhuma inflamabilidade em temperaturas mais baixas. A exposição a altas concentrações de ClC₄ pode causar danos ao sistema nervoso central, incluindo deterioração do fígado e rins. CCl₄ induz ALI através de sua biotransformação no fígado, que forma espécies reativas de oxigênio. Isso ocorre através da enzima citocromo P450 2E1, formando um metabólito ativo e resultando em dano celular por ligação de macromoléculas, aumento da peroxidação lipídica e perturbação da homeostase de cálcio intracelular¹⁴. Além disso, o modelo CCl₄ pode ser usado para estimular os astrócitos ao nível da síntese de RNA¹⁵. Esta hepatotoxina tem sido administrada pelas rotas intraperitoneal, intraportal, oral e intratragastrica¹⁶.

Neste protocolo, descrevemos em detalhes ccl₄-induzido ALI em ratos através de uma sonda orogástrica. Este método induz ali robusto e reprodutível que pode ser usado para investigar a patogênese de ALI. A determinação da gravidade da doença hepática é monitorada pela medição do soro glutamato-piruvato transaminase (GPT), enzimas transaminase oxaloacticais glutamicas (GOT) e bilirrubina total (TB), bem como diagnóstico histológico definitivo por hematoxilina e eosina (H&E) tecidos hepáticos manchados. A exposição ao CCl₄ através de um acesso intragastric permite um método prático, barato e minimamente invasivo com risco mínimo de risco.

Protocolo

Os experimentos foram realizados de acordo com as recomendações das Declarações de Helsinque e Tóquio e das Diretrizes para o Uso de Animais Experimentais da Comunidade Europeia. Os experimentos foram aprovados pelo Comitê de Cuidados Animais da Universidade Ben-Gurion do Negev.

NOTA: O modelo CCL₄ foi gerado e utilizado em um estudo anterior¹⁷. O cronograma do protocolo é demonstrado na Tabela 1.

1. Preparar ratos para o procedimento experimental

NOTA: Selecione ratos machos adultos sprague Dawley pesando 300-350 g.

1. Obter aprovação para experimentos do Comitê de Cuidado e Uso de Animais Institucionais (IACUC).
2. Mantenha os ratos em temperatura ambiente (22 °C ± 1 °C), com 12 h de luz e 12 h de ciclos escuros. Forneça comida de rato e água ad libitum.
3. Realize todos os experimentos entre 6:00 e 12:00.
4. Raspe o rato e desinfete a pele com álcool.

2. Determinação dos níveis de linha de base do soro GOT, GPT e TB

1. Anestesia
   1. Prepare um sistema de administração isoflurano contínuo para induzir anestesia. Certifique-se de que o sistema de vaporizador está cheio de isoflurano.
   2. Anestesiar o rato com 2% de isoflurano. Confirme que o rato está totalmente anestesiado observando o movimento e o reflexo do pedal em resposta a estímulos externos.
      NOTA: Use isoflurano de 1 a 5% para indução e manutenção de anestesia.
2. Cannulate a veia traseira com um cateter de 22 G.
3. Coletar uma amostra de sangue de 0,5 mL na linha de base. Certifique-se de que o volume sanguíneo recuperado não exceda as diretrizes da IACUC.
4. Realizar análises bioquímicas sanguíneas incluindo as medidas do soro GOT, GPT e TB, conforme descrito anteriormente¹⁸.
   NOTA: Os exames de enzimas hepáticas e nível de TB foram realizados no laboratório bioquímico do Soroka Medical Center. As amostras de sangue foram analisadas utilizando-se um método de fluorescência em um analisador de química (Tabela de Materiais).

3. Indução de lesão hepática aguda em ratos

ATENÇÃO: A exposição a altas concentrações de ClC₄, incluindo absorção através de vapor ou pele, pode ter efeitos negativos no sistema nervoso central e causar degeneração do fígado e rins. Exposição prolongada pode causar coma ou morte.

1. Prepare uma solução de 50% de CCl₄ (Tabela de Materiais) misturando CCl₄ com azeite como veículo em uma proporção 1:1.
   NOTA: A solução deve ser preparada de acordo com as diretrizes da IACUC para compostos não farmacêuticos.
2. Induzir hepatotoxicidade in vivo pela administração do CCL₄ através de uma sonda orogástrica.
   1. Insira uma sonda orogástrica de 16 G (3 polegadas de profundidade) através da cavidade oral do rato.
   2. Exponha o rato a diferentes doses de CCl₄ injetando uma seringa com uma das seguintes soluções diluídas no estômago do rato: 1 mL/kg (ALI leve), 2,5 mL/kg (ALI moderado) ou 5 mL/kg (ALI grave) da solução de 50%. Para o grupo de controle falso, exponha o rato apenas a 5 mL/kg de azeite.

4. Determinação dos níveis de soro GOT, GPT e TB após 24 h

1. Anestesia
   1. Prepare um sistema de administração isoflurano contínuo para induzir anestesia. Certifique-se de que o sistema de vaporizador está cheio de isoflurano.
   2. Anestesiar os ratos com 2% de isoflurano. Confirme que o rato está totalmente anestesiado observando o movimento e o reflexo do pedal em resposta a estímulos externos.
2. Coletar amostras de sangue às 24h da exposição ao ClC_4.
3. Realizar análisebioquímica sanguínea, incluindo medidas de soro GOT, GPT e TB.

5. Coleta de fígado para exame histológico

1. Eutanie o rato substituindo a mistura de gás inspirada por 20% O₂/80% CO₂. Certifique-se de que o CO₂ seja entregue a uma taxa pré-determinada de acordo com as diretrizes da IACUC.
2. Certifique-se de morte verificando a falta de batimentos cardíacos e confirme por um método secundário de acordo com as diretrizes da IACUC.
3. Coloque o rato sobre uma tábua de dissecação com sua superfície dorsal voltada para baixo e abdômen voltado para cima. Raspe o abdômen do rato.
4. Com um bisturi, incida o comprimento total da pele ventrum do ânus até o queixo. Separe a pele. Incise a parede abdominal com um bisturi do ânus até a cartilagem xilóide, expondo as vísceras abdominais.
5. Usando tesouras e fórceps, isole o fígado dissecando-o de seus ligamentos e fixações. Começando pelo hilum do fígado, realize cuidadosamente uma hepatectomia liberando todos os lóbulos do fígado de anexos. Dissecar e cortar todos os ligamentos e vasos sanguíneos.
6. Transfira o fígado para uma placa de Petri. Fixar o fígado em uma solução de formaldeído tampão de 4%(Tabela de Materiais)por pelo menos 24 h.

6. Exame histológico

1. Preparação da amostra
   1. Após a fixação, corte a amostra em uma série de fatias de 5 μm de espessura por secção de microtomes.
   2. Coloque delicadamente as fatias em lâminas de vidro com um pincel macio, 1 fatia por slide.
   3. Realizar a coloração de H&E como descrito anteriormente¹⁹.
2. Examine as fatias sob um microscópio a uma ampliação de 200x usando uma lente objetiva de 20 mm(Tabela de Materiais).
   NOTA: As seções hepáticas devem ser classificadas por um patologista especializado cego ao protocolo de tratamento. Um escore de 0 não indica anormalidades hepáticas, 1-2 indica lesão hepática leve, 3-4 indica lesão hepática moderada, e 5-6 indica lesão hepática grave^20,21,22.

Resultados

Os níveis de TB, GOT e GPT aumentaram significativamente 24 h após induzirem ALI (mais doses de CCl₄₎ em comparação com controles falsos (p < 0,001) (Figura 1). Os níveis de TB, GOT e GPT na linha de base eram normais e não eram significativamente diferentes dos controles operados por fraude. Às 24 horas, todos os três grupos intervencionais, 1 mL/kg CCl₄ (1, 1−2), 2,5 mL/kg CCl₄ (3, 3−4) e 5 mL/kg CCl₄ (4, 4-5,75), apresentaram um esco...

Discussão

Neste protocolo, CCl₄ é usado como uma toxina hepática para induzir ALI em ratos. Ali é caracterizada pela perda de parenchyma hepático e subsequente desregulação das funções metabólicas e sintéticas do fígado. Drogas, vírus, toxinas, doenças autoimunes, doenças metabólicas e doenças vasculares induzem a morte hepatocito, e a resposta inflamatória subsequente contribui para a patogênese da ALI.

O insulto inicial ao fígado leva à produção de citocina, liberaçã...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
22 G catheter BD Neoflon TM	Becton Dickinson Infusion Therapy AB
4% buffered formaldehyde solution	Sigma - Aldrich lab materials technologies
BD Microtainer SST TM Tubes	Becton Dickinson and Company
Carbone tetrachloride	Sigma - Aldrich lab materials technologies	CAS 56-23-5
Isofluran, USP 100%	Piramamal Critical Care, Inc
Olympus AU2700 Chemistry-Immuno Analyzer	Olympus (MN, USA)		Analysis of blood samples was done by the fluorescence method
Olympus BX 40 microscope	Olympus
RAT Feeding Needles	ORCHID SCIENTIFICS
SYRINGE SET 1 and 2 ml MEDI -PLUS	Shandong Zibo Shanchuan Medical Instruments Co., Ltd