通过四氯化碳诱导大鼠急性肝损伤 （CCl4） 通过奥罗胃管暴露

摘要

该协议描述了通过CCl₄暴露通过奥胃管诱导急性肝损伤（ALI）的一种常见和可行的方法。CCl₄暴露在肝脏生物转化过程中通过活性氧物种的形成诱导 ALI。该方法用于分析ALI的病理生理学，并研究不同的肝保护策略。

摘要

急性肝损伤（ALI）在肝功能衰竭的发展中起着至关重要的作用，肝功能障碍的特点是严重的肝功能障碍，包括肝脑病和蛋白质合成受损等并发症。适当的动物模型对于测试ALI的机制和病理生理学以及研究不同的肝保护策略至关重要。由于其进行化学转化的能力，四氯化碳（CCl_4）在肝脏中被广泛用于通过活性氧物种的形成诱导ALI。CCl₄暴露可以通过腹内、吸入或通过鼻胃或奥胃管进行。在这里，我们描述了一个啮齿动物模型，其中ALI是由CCl₄通过奥胃管暴露诱导的。该方法价格低廉，易于执行，风险最小。该模型具有很高的可重复性，可广泛用于确定潜在的肝保护策略的有效性和评估肝损伤的标记。

引言

对肝脏的毒性侮辱的频率正在增加，特别是由于酗酒和吸毒。急性肝损伤（ALI）与高死亡率相关，并引起临床关注^11，2。2毒性损伤导致肝脏死亡信号通路，导致肝细胞凋亡、坏死或肺气肿。ALI在肝功能衰竭的发展中起着至关重要的作用，其特征是严重的肝功能障碍，包括肝脑病和蛋白质合成受损^{等并发症3、4。4}虽然最近的研究增加了我们对肝衰竭伴随的生理和病理变化的认识，但它并没有完全解释影响细胞死亡机制的病理分子特征。此外，目前尚无药物来扭转ALI患者的逐渐恶化。目前，唯一有效治疗的是肝移植^55、6。6

为了研究ALI的机制和病理生理学，并测试不同的肝保护策略，使用不同的动物模型来诱导ALI。ALI的可取动物模型应该通过可靠、验证、廉价和易于应用的方法模拟疾病的病理过程。实验模型的例子包括肝毒性剂、手术程序，如完全或部分肝切除术，完全或暂时脱血管，以及感染性手术^{77，8，9。8,9}已知的肝毒性物质包括甲酰胺、对乙酰氨基酚、硫酰胺、阿氧西甲烷和CCl_4。其中，CCl₄虽然尚未得到很好的应用，但其特征尚未得到很好的10、11、12、13。^10,11,12,13

CCl₄是一种有机无色液体化合物，气味甜美，在低温下几乎无可燃性。暴露于高浓度的CCl₄可对中枢神经系统造成损伤，包括肝脏和肾脏的恶化。CCl₄通过肝脏的生物转化诱导ALI，形成活性氧物种。这通过P450细胞色素酶2E1发生，形成活性代谢物，通过大分子结合、增强脂质过氧化和细胞内钙平衡扰动¹⁴引起细胞损伤。此外，CCl₄模型可用于刺激在RNA合成¹⁵水平上的星细胞。这种肝毒素由腹腔内、门内、口腔和胃内途径¹⁶管理。

在此协议中，我们详细描述了CCl₄诱导的ALI在大鼠通过奥胃管。该方法诱导健壮和可重复的ALI，可用于研究ALI的发病机制。通过血清谷氨酸-丙酮酶转氨酶（GPT）、谷胱甘肽转氨酶（GOT）酶和总胆红素（TB）的测量，以及通过血氧林和欧辛（H&E）染色肝组织进行明确的组织学诊断，监测肝病严重程度的确定。通过胃内访问接触 CCl_4，可以采用实用、廉价、微创的方法，风险最小。

研究方案

这些实验是根据《赫尔辛基和东京宣言》的建议和欧洲共同体《实验动物使用准则》进行的。这些实验得到了内盖夫本-古里安大学动物护理委员会的批准。

注:CCl₄模型已经生成并用于以前的研究^17。协议时间表在表 1中演示。

1. 为实验程序准备大鼠

注:选择成年雄性斯普拉格道利大鼠体重300~350克。

1. 获得机构动物护理和使用委员会 （IACUC） 的批准实验。
2. 在室温（22 °C ± 1 °C）下保持大鼠，12 小时光线和 12 小时暗循环。提供鼠肉和水的盐水。
3. 在上午 6:00 到下午 12:00 之间执行所有实验。
4. 用酒精对老鼠进行消毒。

2. 确定血清 GOT、GPT 和结核病基线水平

1. 麻醉
   1. 准备连续的麻醉管理系统，诱导麻醉。确保蒸发器系统充满等体。
   2. 用2%的二氧体麻醉大鼠。通过观察运动和踏板反射来响应外部刺激，确认大鼠完全麻醉。
      注:使用1~5%的西沙兰用于麻醉诱导和维护。
2. 用22 G导管对尾静脉进行加核。
3. 在基线处采集 0.5 mL 血液样本。确保检索到的血量不超过 IACUC 指南。
4. 执行血液生化分析，包括血清GOT、GPT和结核病的测量，如前所述^的18。
   注:在索罗卡医疗中心的生化实验室对肝酶和结核病水平进行了检查。在化学分析仪（材料表）上使用荧光方法对血液样本进行了分析。

3. 大鼠急性肝损伤的诱导

注意:暴露于高浓度的CCl_4，包括通过蒸汽或皮肤吸收，可能对中枢神经系统产生负面影响，并导致肝脏和肾脏退化。长时间接触可能导致昏迷或死亡。

1. 准备CCl_4（材料表）的50%溶液，将CCl₄与橄榄油混合为1:1的比例。
   注:应根据IACUC非药物级化合物指南制备该解决方案。
2. 通过CCl₄管理通过奥胃管诱导体内肝毒性。
   1. 通过大鼠的口腔插入一个16 G的胃管（3英寸深）。
   2. 将带有以下稀释溶液之一的注射器注射到大鼠胃中，将大鼠暴露于不同剂量的CCl_4:1 mL/kg（轻度ALI）、2.5 mL/kg（中度ALI）或50%溶液中的5 mL/kg（严重ALI）。对于操作不自明的对照组，仅将大鼠暴露在 5 mL/kg 橄榄油中。

4. 24小时后测定血清GOT、GPT和结核病水平

1. 麻醉
   1. 准备连续的麻醉管理系统，诱导麻醉。确保蒸发器系统充满等体。
   2. 用2%的二分之一类物麻醉大鼠。通过观察运动和踏板反射来响应外部刺激，确认大鼠完全麻醉。
2. 从CCl₄暴露中采集24小时的血液样本。
3. 进行血液生化分析，包括血清GOT、GPT和结核病的测量。

5. 用于组织学检查的肝脏收集

1. 将激发的气体混合物替换为 20% O₂/80% CO_2，使大鼠安乐死。确保 CO₂按照 IACUC 准则以预定速率交付。
2. 通过检查心跳不足，并根据IACUC指南通过辅助方法确认死亡。
3. 将大鼠放在解剖板上，其背面朝下，腹部朝上。把老鼠的腹部都当过。
4. 用手术刀，将腹腔皮肤从anus到下巴的全长切开。分离皮肤。用手术刀从anus到xyphoe软骨切开腹壁，露出腹部内脏。
5. 使用剪刀和钳子，通过解剖肝脏的韧带和附件来分离肝脏。从肝高卢开始，通过释放附件中的所有肝叶，仔细进行肝切除术。切除和切断所有韧带和血管。
6. 将肝脏转移到培养皿中。将肝脏固定在4%缓冲甲醛溶液中（材料表），至少24小时。

6. 组织学考试

1. 样品制备
   1. 固定后，通过微缩切将样品切成5μm厚切片系列。
   2. 用软刷轻轻将切片放在玻璃幻灯片上，每张幻灯片 1 片。
   3. 执行 H&E 染色，如前所述^{的 19}。
2. 使用20毫米客观透镜（材料表）在显微镜下以200倍放大倍率检查切片。
   注:肝脏部分应由对治疗方案视而不见的专门病理学家分级。评分为0表示无肝异常，1⁄2表示轻度肝损伤，3⁄4表示中度肝损伤，5~6表示严重肝损伤^{20、21、22。21,2220}

结果

与假操作对照（p < 0.001）相比，诱导 ALI（在较高CCl 4剂量下更多）后，结核病、GOT 和 GPT 水平显著增加 24小时（更多为较高 CCl₄剂量）。基线的结核病、GOT 和 GPT 水平是正常的，与虚假操作的控制没有显著差异。在24小时时，所有三个介入组，1 mL/kg CCl₄ （1， 1⁄2）， 2.5 mL/kg CCl₄ （3， 3+4） 和 5 mL/kg CCl₄ （4， 4， 4+5.75）， 具有明显高于假操作...

讨论

在此协议中，CCl₄用作肝脏毒素，诱导大鼠体内的ALI。ALI的特点是肝胆痛的丧失以及肝脏代谢和合成功能的后续调节。药物、病毒、毒素、自身免疫性疾病、代谢疾病和血管疾病都诱发肝细胞死亡，随后的炎症反应有助于ALI的发病机制。

对肝脏的最初侮辱导致细胞因子的产生，化学基质释放，以及随后炎症细胞渗入肝脏。用于 ALI 评估的三种常见测试的生物标志物是 GP...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
22 G catheter BD Neoflon TM	Becton Dickinson Infusion Therapy AB
4% buffered formaldehyde solution	Sigma - Aldrich lab materials technologies
BD Microtainer SST TM Tubes	Becton Dickinson and Company
Carbone tetrachloride	Sigma - Aldrich lab materials technologies	CAS 56-23-5
Isofluran, USP 100%	Piramamal Critical Care, Inc
Olympus AU2700 Chemistry-Immuno Analyzer	Olympus (MN, USA)		Analysis of blood samples was done by the fluorescence method
Olympus BX 40 microscope	Olympus
RAT Feeding Needles	ORCHID SCIENTIFICS
SYRINGE SET 1 and 2 ml MEDI -PLUS	Shandong Zibo Shanchuan Medical Instruments Co., Ltd