탄소 테트라 클로라이드를 통해 쥐에 급성 간 상해를 유도 (CCl4)오로 위관을 통해 노출

요약

이 프로토콜은 오로 위관을 통해 CCl₄ 노출을 통해 급성 간 손상 (ALI)을 유도하는 일반적이고 실행 가능한 방법을 설명합니다. CCl₄ 노출은 간에서의 생체 변환 동안 반응성 산소 종의 형성을 통해 ALI를 유도합니다. 이 방법은 ALI의 병리생리학을 분석하고 다른 간 보호 전략을 검사하는 데 사용됩니다.

초록

급성 간 손상 (ALI) 간 실패의 개발에 중요 한 역, 간 뇌 증 및 장애인된 단백질 합성 등 합병증을 포함 하 여 심한 간 기능 장애를 특징으로 하는. 적절한 동물 모델은 ALI의 메커니즘과 병리생리학을 테스트하고 다른 간 보호 전략을 조사하는 데 필수적입니다. 화학적 변형을 수행하는 능력으로 인해 탄소 사염소산화물 (CCl_4)은반응성 산소 종의 형성을 통해 ALI를 유도하기 위해 간에서 널리 사용됩니다. CCl₄ 노출은 복강 내, 흡입, 또는 비위 관 또는 오로 위관을 통해 수행 될 수 있습니다. 여기에서, 우리는 ALI가 oro위관을 통해CCl₄ 노출에 의해 유도되는 설치류 모형을 기술합니다. 이 방법은 저렴하고 쉽게 수행되며 위험 위험이 최소화됩니다. 이 모델은 매우 재현 가능하며 잠재적 인 간 보호 전략의 효능을 확인하고 간 손상의 마커를 평가하는 데 널리 사용할 수 있습니다.

서문

특히 알코올 및 약물 남용으로 인해 간에서 독성 모욕의 빈도가 증가하고 있습니다. 급성 간 손상 (ALI)은 높은 사망률과 관련이 있으며 임상 적 우려를 일으켰습니다^1,,2. 독성 상해는 간세포 세포 사멸, 괴사 증, 또는 pyroptosis의 결과로 간에서 죽음 신호 통로로 이끌어 냅니다. ALI는 간뇌병증 및 단백질 합성 장애 등의 합병증을 포함하는 중증 간 기능 장애를 특징으로 하는 간 부전의 발달에 중요한 역할을 한다^3,,4. 최근 연구는 간 실패를 동반하는 생리적 및 병리학적 변화에 대한 우리의 지식을 증가시켰지만, 세포 사멸의 메커니즘에 영향을 미치는 병리 분자 특징을 완전히 설명하지는 못했습니다. 게다가, 어떤 약물은 현재 ALI 환자에 있는 진보적인 악화를 반전하기 위하여 유효하지 않습니다. 현재, 유일하게 유의하고 효과적인 치료법은 간 이식^5,,6.

ALI의 메커니즘 및 병리생리학을 조사하고 상이한 간보호 전략을 테스트하기 위해, 다른 동물 모델이 ALI를 유도하는 데 사용된다. ALI의 바람직한 동물 모델은 신뢰할 수 있고, 검증되고, 저렴하고 적용하기 쉬운 방법을 통해 질병의 병리학 적 과정을 모방해야합니다. 실험 모델의 예로는 간독성 제제, 전체 또는 부분 간절제술과 같은 외과 적 시술, 완전 또는 일시적인 편환성 및 감염 시술^7,,8,,9가포함된다. 알려진 간독성 물질에는 갈락토사민, 아세트아미노펜, 티오아세타미드, 아조시메탄 및 CCl_4가포함된다. 이들 중, CCl_4는 아직^{잘 10,11,,,12,,13을}특징으로하지 않았지만 널리 사용된다.

CCl_4는 달콤한 냄새가 나고 낮은 온도에서 가연성이 거의 없는 유기 무색 액체 화합물입니다. CCl_4의 고농도에 노출은 간 및 신장의 악화를 포함하여 중추 신경계에 손상을 일으킬 수 있습니다. CCl_4는 반응성 산소 종을 형성하는 간에서의 생체 변환을 통해 ALI를 유도합니다. 이는 P450 시토크롬 효소 2E1을 통해 발생하며, 활성 대사 산물을 형성하고 거대 분자 결합에 의한 세포 손상을 초래하고, 지질 과산화의 향상 및 세포 내 칼슘 항상성의^{교란을 초래한다 14.} 또한, CCl₄ 모델은 RNA 합성^15의수준에서 성상 세포체를 자극하는데 사용될 수 있다. 이 간독소는 복강 내, 인트라포탈, 구강 및 위내 경로^16에의해 투여되고 있다.

이 프로토콜에서, 우리는 오로위관을 통해 쥐에서 CCl_4-유도ALI를 상세히 기술한다. 이 방법은 ALI의 병인을 조사하는 데 사용할 수 있는 강력하고 재현 가능한 ALI를 유도합니다. 간 질환 중증도의 결정은 혈청 글루타메이트 피루베이트 트랜스아미나제(GPT), 글루타믹 옥살로아세틱 트랜스아미나제(GOT) 효소 및 총 빌리루빈(TB)의 측정뿐만 아니라 헤마톡실린과 에오신(H&E)의 스테인드 간 조직에 의한 확실한 조직학적 진단을 통해 모니터링됩니다. 위내 접근을 통해 CCl_4에 노출되면 위험 위험을 최소화하면서 실용적이고 저렴하며 최소침습적인 방법을 사용할 수 있습니다.

프로토콜

실험은 헬싱키와 도쿄 선언의 권고와 유럽 공동체의 실험 동물 사용에 대한 지침에 따라 수행되었습니다. 실험은 네게브의 벤 구리온 대학의 동물 관리위원회에 의해 승인되었다.

참고: CCl₄ 모델은 이전 연구^17에서생성되고 사용되었습니다. 프로토콜 타임라인은 표 1에서설명됩니다.

1. 실험 절차에 대한 쥐 준비

참고 : 300−350g의 무게성인 남성 스프라그 Dawley 쥐를 선택합니다.

1. 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에서 실험에 대한 승인을 얻습니다.
2. 12 시간 빛과 12 시간 어두운 주기와 실온 (22 ° C ± 1 ° C)에서 쥐를 유지합니다. 쥐 차우와 물 광고 리비텀을 제공합니다.
3. 오전 6:00에서 오후 12:00 사이에 모든 실험을 수행합니다.
4. 쥐를 면도하고 알코올로 피부를 소독하십시오.

2. 혈청 GOT, GPT 및 결핵 기준선 수준의 결정

1. 마 취
   1. 마취를 유도하는 연속 이소플루란 투여 시스템을 준비한다. 기화기 시스템이 이소플루란으로 채워져 있는지 확인하십시오.
   2. 2 % 이소플루란으로 쥐를 마취시. 쥐가 외부 자극에 반응하여 움직임과 페달 반사를 관찰하여 완전히 마취되어 있는지 확인하십시오.
      참고: 마취 유도 및 유지 보수를 위해 1-5% 이소플루란을 사용하십시오.
2. 꼬리 정맥을 22 G 카테터로 통조합니다.
3. 기준선에서 0.5 mL 혈액 샘플을 수집합니다. 검색된 혈액 량이 IACUC 지침을 초과하지 않는지 확인합니다.
4. 앞서 설명한 바와 같이 혈청 GOT, GPT 및 TB의 측정을 포함하는 혈액 생화확적인 분석을^{수행한다.}
   참고: 소로카 메디컬 센터의 생화학 실험실에서 간 효소와 결핵 수준의 검사가 수행되었습니다. 혈액 샘플을 화학분석기(물자 표)에서형광 방법을 사용하여 분석하였다.

3. 쥐에 있는 심각한 간 상해의 유도

주의: CCl_4의고농도에 노출, 증기 또는 피부를 통해 흡수를 포함 하 여, 중추 신 경계에 부정적인 영향을 미칠 수 있으며 간 및 신장의 변성을 일으킬. 장기간 노출되면 혼수 상태에 빠질 수 있습니다.

1. CCl_4와 올리브 오일을 1:1 비율로 혼합하여 CCl_4(재료 표)의50% 용액을 준비합니다.
   참고: 용액은 비 제약 등급 화합물에 대한 IACUC 지침에 따라 준비되어야 합니다.
2. 오로위관을 통해 CCl₄ 투여에 의해 생체 내 간독성을 유도한다.
   1. 쥐의 구강을 통해 16G oro위관 (3 인치 깊이)을 삽입하십시오.
   2. 1 mL/kg (온화한 ALI), 2.5 mL/kg (온건한 ALI), 또는 5 mL/kg (심한 ALI) 50% 용액의 : 쥐의 위장에 다음과 같은 희석 된 용액 중 하나와 주사기를 주입하여 CCl_4의 다른 용량에 쥐를 노출. 가짜 조작 대조군의 경우, 쥐를 5 mL/kg 올리브 오일에만 노출시다.

4. 24 시간 후에 혈청 GOT, GPT 및 결핵 수준의 결정

1. 마 취
   1. 마취를 유도하는 연속 이소플루란 투여 시스템을 준비한다. 기화기 시스템이 이소플루란으로 채워져 있는지 확인하십시오.
   2. 2% 이소플루란으로 쥐를 마취시다. 쥐가 외부 자극에 반응하여 움직임과 페달 반사를 관찰하여 완전히 마취되어 있는지 확인하십시오.
2. CCl₄ 노출에서 24 시간에서 혈액 샘플을 수집합니다.
3. 혈청 GOT, GPT 및 결핵의 측정을 포함하여 혈액 생화확적인 분석을 수행합니다.

5. 조직학적 검사를 위한 간 수집

1. 영감 받은 가스 혼합물을 20% O 2/80%_CO2로대체하여 쥐를 안락사시한다.₂ IACUC 지침에 따라_CO2가 소정의 속도로 전달되도록 합니다.
2. 심장 박동의 부족을 확인 하 여 죽음을 보장 하 고 IACUC 지침에 따라 보조 방법으로 확인.
3. 쥐를 해부 보드에 놓고 등지 표면이 아래를 향하고 복부를 위로 향합니다. 쥐의 복부를 면도하십시오.
4. 메스로 항문에서 턱까지 뇌 피부 전체를 절개합니다. 피부를 분리합니다. 항문에서 자이포이드 연골까지 메스로 복벽을 절개하여 복부 내장을 노출시하십시오.
5. 가위와 집게를 사용하여 인대와 부착부에서 해부하여 간을 분리하십시오. 간 hilum에서 시작하여 부착에서 모든 간 엽을 방출하여 간 절제술을 신중하게 수행하십시오. 해부하고 모든 인대와 혈관을 잘라.
6. 간을 페트리 접시에 옮김을 넣습니다. 적어도 24 시간 동안 4 % 버퍼링 된 포름알데히드 용액(재료 표)에간을 고정시.

6. 조직학 검사

1. 샘플 준비
   1. 고정 후 샘플을 마이크로토메 단면으로 5 μm 두께의 슬라이스 시리즈로 자른다.
   2. 부드러운 브러쉬로 슬라이스를 슬라이드당 1슬라이스로 유리 슬라이드에 부드럽게 놓습니다.
   3. 앞에서 설명한 대로 H&E^{염색을 수행합니다 19.}
2. 20mm 대물 렌즈(재료 표)를 사용하여 200배 배율로 현미경으로슬라이스를검사합니다.
   참고 : 간 절은 치료 프로토콜에 눈을 멀게 한 전문 병리학자에 의해 등급이 매겨져야합니다. 점수0은 간 이상이 없음을 나타내고, 1-2는 경미한 간 손상을 나타내고, 3-4는 중간 간 손상을 나타내고, 5-6은 심각한 간 손상을 나타냅니다^20,,21,,22.

결과

TB, GOT 및 GPT 수준은 SHAM-조작 대조군(p&0.001)에 비해 ALI(더 높은 CCl₄ 투여량에서 더 많은)를 유도한 후 24시간 크게 증가하였다(그림1). 기준선에서 결핵, GOT 및 GPT의 수준은 정상이었고, sham-operate 컨트롤과 크게 다르지 않았습니다. 24 시간에서, 모든 3개의 개입 군, 1 mL/kg CCl₄ (1, 1−2), 2.5 mL/kg CCl₄ (3, 3−4), 및 5 mL/kg CCl₄ (4, 4−5.75) sham-operate 대조군(0,...

토론

이 프로토콜에서, CCl_4는 쥐에서 ALI를 유도하기 위해 간 독소로서 사용된다. ALI는 간 자렌치의 손실과 간 대사 및 합성 기능의 후속 dysregulation특징입니다. 약물, 바이러스, 독소, 자가 면역 질환, 대사 성 질환 및 혈관 장애는 모두 간세포 사망을 유발하며, 후속 염증 반응은 ALI의 발병기전에 기여합니다.

간으로의 초기 모욕은 사이토카인 생산, 케모카인 방출 및 염증 성...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
22 G catheter BD Neoflon TM	Becton Dickinson Infusion Therapy AB
4% buffered formaldehyde solution	Sigma - Aldrich lab materials technologies
BD Microtainer SST TM Tubes	Becton Dickinson and Company
Carbone tetrachloride	Sigma - Aldrich lab materials technologies	CAS 56-23-5
Isofluran, USP 100%	Piramamal Critical Care, Inc
Olympus AU2700 Chemistry-Immuno Analyzer	Olympus (MN, USA)		Analysis of blood samples was done by the fluorescence method
Olympus BX 40 microscope	Olympus
RAT Feeding Needles	ORCHID SCIENTIFICS
SYRINGE SET 1 and 2 ml MEDI -PLUS	Shandong Zibo Shanchuan Medical Instruments Co., Ltd