JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu protokol, orogastrik tüp yoluyla CCl4 maruziyeti yoluyla akut karaciğer hasarı (ALI) indükleyen yaygın ve uygulanabilir bir yöntemi tanımlar. CCl4 maruziyeti, karaciğerdeki biyotransformasyonu sırasında reaktif oksijen türlerinin oluşumu yoluyla ALI'yi indükler. Bu yöntem ALI'nin patofizyolojisini analiz etmek ve farklı hepatoprotektif stratejileri incelemek için kullanılır.

Özet

Akut karaciğer hasarı (ALI), hepatik ensefalopati ve bozulmuş protein sentezi gibi komplikasyonlar da dahil olmak üzere ciddi karaciğer disfonksiyonu ile karakterize olan hepatik yetmezlik gelişiminde önemli bir rol oynar. Uygun hayvan modelleri ALI'nin mekanizmasını ve patofizyolojisini test etmek ve farklı hepatoprotektif stratejileri araştırmak için hayati önem taşımaktadır. Kimyasal dönüşümler gerçekleştirebilme yeteneği nden dolayı, karbon tetraklorür (CCl4)karaciğerde reaktif oksijen türlerinin oluşumu yoluyla ALI'yi indüklemek için yaygın olarak kullanılır. CCl4 maruziyeti intraperitoneally yapılabilir, inhalasyon yoluyla, veya bir nazogastrik veya orogastrik tüp yoluyla. Burada, ali bir orogastrik tüp ile CCl4 maruz ilerlediği bir kemirgen modeli, açıklar. Bu yöntem ucuzdur, kolayca gerçekleştirilir ve en az tehlike riski vardır. Model son derece tekrarlanabilir ve yaygın potansiyel hepatoprotektif stratejilerin etkinliğini belirlemek ve karaciğer hasarı belirteçleri değerlendirmek için kullanılabilir.

Giriş

Özellikle alkol ve uyuşturucu kullanımı nedeniyle karaciğere yapılan toksik hakaretlerin sıklığı artmaktadır. Akut karaciğer hasarı (ALI) yüksek mortalite oranları ile ilişkilidir ve klinik kaygılara neden olmuştur1,2. Toksik yaralanma karaciğerde ölüm sinyal yollarını yol açar, hepatosit apoptoz, nekroz veya piroptoz ile sonuçlanan. ALI hepatik ensefalopati ve bozulmuş protein sentezi gibi komplikasyonlar da dahil olmak üzere ciddi karaciğer disfonksiyonu ile karakterize dir hepatik yetmezliği gelişiminde önemli bir rol oynar3,4. Son araştırmalar hepatik yetmezliğe eşlik eden fizyolojik ve patolojik değişiklikler hakkındaki bilgimizi artırmış olsa da, hücre ölüm mekanizmalarını etkileyen patomoleküler özellikleri tam olarak açıklamamıştır. Ayrıca, ali hastalarında ilerleyici bozulmayı tersine çevirmek için şu anda hiçbir ilaç mevcut değildir. Şu anda, tek önemli ölçüde etkili tedavi karaciğer nakli5,6.

ALI'nin mekanizmasını ve patofizyolojisini araştırmak ve farklı hepatoprotektif stratejileri test etmek için, ALI'yi ikna etmek için farklı hayvan modelleri kullanılmaktadır. ALI'nin tercih edilen bir hayvan modeli, güvenilir, doğrulanmış, ucuz ve uygulaması kolay bir yöntemle hastalığın patolojik sürecini taklit etmelidir. Deneysel modellere örnek olarak hepatotoksik ajanlar, total veya parsiyel hepatektomi gibi cerrahi işlemler, tam veya geçici devaskülarizasyon ve enfektif işlemler7,8,9sayılabilir. Bilinen hepatotoksik maddeler galaktosamin, asetaminofen, tiyoasetamid, azoksitanatuar ve CCl4içerir. Bunlardan, CCl4 yaygın olarak henüz iyi karakterize edilmemişolmasına rağmen kullanılır10,11,12,13.

CCl4 tatlı bir koku ve düşük sıcaklıklarda hemen hemen hiç yanıcı organik renksiz sıvı bileşiktir. CCl yüksek konsantrasyonlarda maruzkalma 4 merkezi sinir sistemi hasara neden olabilir, karaciğer ve böbreklerin bozulması da dahil olmak üzere. CCl4 reaktif oksijen türlerini oluşturan karaciğerde biyotransformasyon yoluyla ALI indükler. Bu P450 sitokrom enzim 2E1 yoluyla oluşur, aktif bir metabolit oluşturan ve makromolekül bağlanması ile hücre hasarı ile sonuçlanan, lipid peroksidasyonu geliştirme ve hücre içi kalsiyum homeostaz bozukluğu14. Buna ek olarak, CCl4 modeli RNA sentezi düzeyinde astrosituyarmak için kullanılabilir15. Bu hepatotoksin intraperitoneal, intraportal, oral ve intragastrik yolları tarafından uygulanmıştır16.

Bu protokolde, bir orogastrik tüp ile sıçanlarda CCl4-indüklenen ALI ayrıntılı olarak açıklayın. Bu yöntem, ALI patogenezini araştırmak için kullanılabilecek sağlam ve tekrarlanabilir ALI'yi indükler. Karaciğer hastalığının şiddetinin belirlenmesi serum glutamat-pirüuvaz transaminaz (GPT), glutamik oksaloasetik transaminaz (GOT) enzimleri ve total bilirubin (TB) ölçümü ve hematoksilin ve eozin (H&E) ile kesin histolojik tanı ile izlenir. İntragastrik erişim yoluyla CCl4'e maruz kalmak, en az tehlike riski olan pratik, ucuz, minimal invaziv bir yönteme olanak sağlar.

Protokol

Deneyler Helsinki ve Tokyo Bildirileri'nin tavsiyeleri ve Avrupa Topluluğu'nun Deneysel Hayvanlarının Kullanımına İlişkin Yönergeler'e göre gerçekleştirilmiştir. Deneyler Negev Ben-Gurion Üniversitesi Hayvan Bakım Komitesi tarafından onaylandı.

NOT: CCl4 modeli bir önceki çalışmada oluşturuldu ve17. Protokol zaman çizelgesi Tablo 1'degösterilmiştir.

1. Farelerin deneysel prosedüre hazırlanması

NOT: 300−350 g ağırlığında yetişkin erkek Sprague Dawley sıçanlarını seçin.

  1. Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi'nden (IACUC) deneyler için onay alın.
  2. Sıçanları oda sıcaklığında (22 °C ± 1 °C), 12 saat Açık ve 12 saat karanlık döngülerle koruyun. Sıçan chow ve su reklam libitum sağlayın.
  3. 06:00 ile 12:00 arasında tüm deneyleri gerçekleştirin.
  4. Sıçantıraş ve alkol ile cildi dezenfekte.

2. Serum GOT, GPT ve TB taban çizgisi düzeylerinin belirlenmesi

  1. Anestezi
    1. Anestezi yi tetiklemek için sürekli bir isoflurane yönetim sistemi hazırlayın. Buharlaştırıcı sisteminin isoflurane ile dolu olduğundan emin olun.
    2. Sıçanı %2 isoflurane ile anesteize et. Dışarıdan uyaranlara yanıt olarak hareket ve pedal refleksini gözlemleyerek farenin tamamen anestezi yediğini doğrulayın.
      NOT: Anestezi indüksiyonu ve bakımı için %1−5 isofluran kullanın.
  2. Kuyruk damarını 22 G kateterle kanüle edin.
  3. Taban çizgisinde 0,5 mL kan örneği alın. Alınan kan hacminin IACUC yönergelerini aşmadığından emin olun.
  4. Daha önce açıklandığı gibi serum GOT, GPT ve TB ölçümleri de dahil olmak üzere kan biyokimyasal analiz yapmak18.
    NOT: Karaciğer enzimleri ve tüberküloz düzeyi tetkikleri Soroka Tıp Merkezi'nin biyokimyasal laboratuvarında yapılmıştır. Kan örnekleri bir kimya analizörü(Tablo Malzemeler)üzerinde floresan yöntemi kullanılarak analiz edildi.

3. Sıçanlarda akut karaciğer hasarıin indüksiyonu

DİkKAT: CCl4yüksek konsantrasyonlarda maruz kalma , buhar veya deri yoluyla emilimi de dahil olmak üzere, merkezi sinir sistemi üzerinde olumsuz etkileri olabilir ve karaciğer ve böbreklerin dejenerasyonuna neden olabilir. Uzun süreli maruz kalma koma veya ölüme neden olabilir.

  1. CCl4'ü zeytinyağı ile 1:1 oranında karıştırarak %50 oranında CCl4 (Malzeme Tablosu)çözeltisi hazırlayın.
    NOT: Çözelti, farmasötik olmayan sınıflar için IACUC yönergelerine göre hazırlanmalıdır.
  2. Bir orogastrik tüp ile CCl4 uygulaması ile in vivo hepatotoksisite indüklemek.
    1. Farenin ağız boşluğuna 16 G orogastrik tüp (3 inç derinliğinde) yerleştirin.
    2. Farenin midesine aşağıdaki seyreltilmiş çözeltilerden biriyle bir şırınga enjekte ederek sıçanı Farklı dozlarda CCl4'e maruz bırakın: 1 mL/kg (hafif ALI), 2,5 mL/kg (orta ALI) veya %50 çözeltinin 5 mL/kg (şiddetli ALI). Sham-operated kontrol grubu için, sıçanı sadece 5 mL/kg zeytinyağına maruz bırakın.

4. Serum GOT, GPT ve Tüberküloz düzeylerinin 24 saat sonra belirlenmesi

  1. Anestezi
    1. Anestezi yi tetiklemek için sürekli bir isoflurane yönetim sistemi hazırlayın. Buharlaştırıcı sisteminin isoflurane ile dolu olduğundan emin olun.
    2. Fareleri %2 isoflurane ile anestezi. Dışarıdan uyaranlara yanıt olarak hareket ve pedal refleksini gözlemleyerek farenin tamamen anestezi yediğini doğrulayın.
  2. CCl4 maruziyetinden 24 saat kan örneği alın.
  3. Serum GOT, GPT ve Tüberküloz ölçümleri de dahil olmak üzere kan biyokimyasal analizleri yapın.

5. Histolojik inceleme için karaciğer toplanması

  1. %20 O2/80% CO2ile ilham gaz karışımı değiştirerek sıçan ötenazi. CO2'nin IACUC yönergelerine uygun olarak önceden belirlenmiş bir hızda teslim edilmesini sağlayın.
  2. Kalp atışı eksikliğini kontrol ederek ölümü sağlayın ve IACUC yönergelerine uygun olarak ikincil bir yöntemle onaylayın.
  3. Onun sırt yüzeyi aşağı bakan ve karın yukarı bakan bir diseksiyon tahtası üzerinde sıçan yerleştirin. Farenin karnını tıraş edin.
  4. Bir neşter ile, anüs çene için ventrum deri tam uzunluğu eğim. Deriyi ayırın. Anüsten ksifoid kıkırdak için bir neşter ile karın duvarı incise, karın vissera açığa.
  5. Makas ve forceps kullanarak, onun ligamentler ve ekleri onu keserek karaciğer izole. Karaciğer hilum başlayarak, dikkatle ekleri tüm karaciğer lobları serbest bırakarak bir hepatektomi gerçekleştirin. Tüm bağları ve kan damarlarını kesip kes.
  6. Karaciğeri petri kabına aktar. En az 24 saat boyunca %4 oranında tamponlu formaldehit çözeltisi(Malzeme Tablosu)içinde karaciğeri düzeltin.

6. Histolojik inceleme

  1. Numune hazırlama
    1. Fiksasyondan sonra, mikrotome kesitile numuneyi 5 μm kalınlığında dilim serisine kesin.
    2. Dilimleri yumuşak bir fırçayla, slayt başına 1 dilim le cam slaytlara yavaşça yerleştirin.
    3. Daha önce açıklandığı gibi H & E boyama gerçekleştirin19.
  2. 20 mm objektif lens(Malzeme Tablosu)kullanarak 200x büyütmede bir mikroskop altında dilimleri inceleyin.
    NOT: Karaciğer bölümleri tedavi protokolüne kör olmuş uzman bir patolog tarafından derecelendirilmelidir. 0 skoru karaciğer anormallikleri gösterir, 1-2 hafif karaciğer hasarı gösterir, 3-4 orta karaciğer hasarı gösterir, ve 5-6 ciddi karaciğer hasarı gösterir20,21,22.

Sonuçlar

TB, GOT ve GPT düzeyleri, sahte çalışan kontrollere göre ALI'yi (daha yüksek CCl4 dozlarında daha fazla) indükledikten sonra 24 saat arttı (p < 0.001)(Şekil 1). Taban çizgisindeki Tüberküloz, GOT ve GPT düzeyleri normaldi ve sahte kontrollerden önemli ölçüde farklı değildi. Saat 24'te, her üç girişimsel grup, 1 mL/kg CCl4 (1, 1−2), 2,5 mL/kg CCl4 (3, 3−4) ve 5 mL/kg CCl4 (4, 4−5,75), sahte kontrol grubuna göre anlamlı...

Tartışmalar

Bu protokolde, CCl4 sıçanlarda ALI indüklemek için bir karaciğer toksin olarak kullanılır. ALI karaciğer parankim kaybı ve karaciğermetabolik ve sentetik fonksiyonların sonraki disregülasyon ile karakterizedir. İlaçlar, virüsler, toksinler, otoimmün hastalıklar, metabolik hastalıklar ve vasküler hastalıkların hepsi hepatosit ölümüne neden olur ve sonraki inflamatuar yanıt ALI'nin patogenezine katkıda bulunur.

Karaciğere ilk hakaret sitokin üretimine yol a...

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

Yazarlar minnetle Bertha Delgado, Patoloji Bölümü, Soroka Tıp Merkezi, Sağlık Bilimleri Fakültesi, Ben-Gurion Üniversitesi Necef, laboratuvar yanı sıra histoloji analizi nde yaptığı yardım için kabul.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
22 G catheter BD Neoflon TMBecton Dickinson Infusion Therapy AB
4% buffered formaldehyde solutionSigma - Aldrich lab materials technologies
BD Microtainer SST TM TubesBecton Dickinson and Company
Carbone tetrachlorideSigma - Aldrich lab materials technologiesCAS 56-23-5
Isofluran, USP 100%Piramamal Critical Care, Inc
Olympus AU2700 Chemistry-Immuno AnalyzerOlympus (MN, USA)Analysis of blood samples was done by the fluorescence method
Olympus BX 40 microscopeOlympus
RAT Feeding NeedlesORCHID SCIENTIFICS
SYRINGE SET 1 and 2 ml MEDI -PLUSShandong Zibo Shanchuan Medical Instruments Co., Ltd

Referanslar

  1. Hoofnagle, J. H., Carithers, R. L., Shapiro, C., Ascher, N. Fulminant hepatic failure: Summary of a workshop. Hepatology. 21 (1), 240-252 (1995).
  2. Rakela, J., Lange, S. M., Ludwig, J., Baldus, W. P. Fulminant hepatitis: Mayo clinic experience with 34 cases. Mayo Clinic Proceedings. 60 (5), 289-292 (1985).
  3. Riordan, S. M., Williams, R. Treatment of hepatic encephalopathy. New England Journal of Medicine. 337, 473-479 (1997).
  4. Bernuau, J., Rueff, B., Benhamou, J. Fulminant and subfulminant liver failure: Definitions and causes. Seminars in Liver Disease. 6 (2), 97-106 (1986).
  5. Lidofsky, S. D. Liver transplantation for fulminant hepatic failure. Gastroenterology Clinics of North America. 22 (2), 257-269 (1993).
  6. Auzinger, G., Wendon, J. Intensive care management of acute liver failure. Current opinion in critical care. 14 (2), 179-188 (2008).
  7. Wu, Q., et al. Protection of regenerating liver after partial hepatectomy from carbon tetrachloride hepatotoxicity in rats: Roles of mitochondrial uncoupling protein 2 and ATP stores. Digestive Diseases and Sciences. 54 (9), 1918-1925 (2009).
  8. Tuñón, M. J., Alvarez, M., Culebras, J. M., González-Gallego, J. An overview of animal models for investigating the pathogenesis and therapeutic strategies in acute hepatic failure. World Journal of Gastroenterologyl. 15 (25), 3086-3098 (2009).
  9. van de Kerkhove, M. P., Hoekstra, R., van Gulik, T. M., Chamuleau, R. A. Large animal models of fulminant hepatic failure in artificial and bioartificial liver support research. Biomaterials. 25 (9), 1613-1625 (2004).
  10. Butterworth, R. F., et al. Experimental models of hepatic encephalopathy: ISHEN guidelines. Liver International. 29 (6), 783-788 (2009).
  11. Zhang, B., Gong, D., Mei, M. Protection of regenerating liver after partial hepatectomy from carbon tetrachloride hepatotoxicity in rats: Role of hepatic stimulator substance. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 14 (10), 1010-1017 (1999).
  12. Ugazio, G., Danni, O., Milillo, P., Burdino, E., Congiu, A. M. Mechanism of protection against carbon tetrachloride toxicity. I. prevention of lethal effects by partial surgical hepatectomy. Drug and Chemical Toxicology. 5 (2), 115-124 (1982).
  13. Taniguchi, M., Takeuchi, T., Nakatsuka, R., Watanabe, T., Sato, K. Molecular process in acute liver injury and regeneration induced by carbon tetrachloride. Life Science. 75 (13), 1539-1549 (2004).
  14. Gordis, E. Lipid metabolites of carbon tetrachloride. Journal of Clinical Investigation. 48 (1), 203-209 (1969).
  15. Albrecht, J. Cerebral RNA synthesis in experimental hepatogenic encephalopathy. Journal of Neuroscience Research. 6 (4), 553-558 (1981).
  16. Terblanche, J., Hickman, R. Animal models of fulminant hepatic failure. Digestive Diseases and Sciences. 36 (6), 770-774 (1991).
  17. Gruenbaum, B. F., et al. Cell-free DNA as a potential marker to predict carbon tetrachloride-induced acute liver injury in rats. Hepatology International. 7 (2), 721-727 (2013).
  18. Juricek, J., et al. Analytical evaluation of the clinical chemistry analyzer Olympus AU2700 plus. Biochemia Medica. 20 (3), 334-340 (2010).
  19. Feldman, A. T., Wolfe, D. Tissue processing and hematoxylin and eosin staining. Methods in Molecular Biology. 1180, 31-43 (2014).
  20. Wang, T., et al. Protective effects of dehydrocavidine on carbon tetrachloride-induced acute hepatotoxicity in rats. Journal of Ethnopharmacology. 117 (2), 300-308 (2008).
  21. Ye, X., et al. Hepatoprotective effects of coptidis rhizoma aqueous extract on carbon tetrachloride-induced acute liver hepatotoxicity in rats. Journal of Ethnopharmacology. 124 (1), 130-136 (2009).
  22. Wills, P. J., Asha, V. V. Protective effect of lygodium flexuosum (L.) sw. extract against carbon tetrachloride-induced acute liver injury in rats. Journal of Ethnopharmacology. 108 (3), 320-326 (2006).
  23. Senior, J. R. Monitoring for hepatotoxicity: What is the predictive value of liver "function" tests. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 85 (3), 331-334 (2009).
  24. Karmen, A. A note on the spectrometric assay of glutamic-oxalacetic transaminase in human blood serum. Journal of Clinical Investigation. 34 (1), 131-133 (1955).
  25. Hubner, G. Ultrastructural liver damage caused by direct action of carbon tetrachloride in vivo and in vitro. Virchows Archiv fur Pathologische Anatomie und Physiologie und fur Klinische Medizin. 339 (3), 187-197 (1965).
  26. Newsome, P. N., Plevris, J. N., Nelson, L. J., Hayes, P. C. Animal models of fulminant hepatic failure: A critical evaluation. Liver Transplantation. 6 (1), 21-31 (2000).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

T pSay 158akut karaci er hasar ALIkarbon tetraklor r CCl4hepatik yaralanmakaraci er hasars an modelitoksin

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır