Induzieren akute Leberverletzung bei Ratten über Kohlenstofftetrachlorid (CCl4) Exposition durch eine orogastrische Röhre

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt eine gängige und praktikable Methode zur Induktion akuter Leberverletzungen (ALI) über cCl₄ Exposition durch eine orogastrische Röhre. CCl₄ Exposition induziert ALI durch die Bildung von reaktiven Sauerstoffspezies während seiner Biotransformation in der Leber. Diese Methode wird verwendet, um die Pathophysiologie von ALI zu analysieren und verschiedene hepatoprotektive Strategien zu untersuchen.

Zusammenfassung

Akute Leberverletzung (ALI) spielt eine entscheidende Rolle bei der Entwicklung von Leberversagen, die durch schwere Leberfunktionsstörungen einschließlich Komplikationen wie Leberenzephalopathie und beeinträchtigte Proteinsynthese gekennzeichnet ist. Geeignete Tiermodelle sind entscheidend, um den Mechanismus und die Pathophysiologie von ALI zu testen und verschiedene hepatoprotektive Strategien zu untersuchen. Aufgrund seiner Fähigkeit, chemische Transformationen durchzuführen, ist Tetrachlorkohlenstoff (CCl₄) weit verbreitet in der Leber verwendet, um ALI durch die Bildung von reaktiven Sauerstoffspezies zu induzieren. CCl₄ Exposition kann intraperitoneal, durch Inhalation oder durch eine nasogastrische oder orogastrische Röhre durchgeführt werden. Hier beschreiben wir ein Nagetiermodell, bei dem ALI durch CCl_4-Exposition durch eine orogastrische Röhre induziert wird. Diese Methode ist kostengünstig, leicht durchzuführen und weist ein minimales Gefahrenrisiko auf. Das Modell ist sehr reproduzierbar und kann weit verbreitet verwendet werden, um die Wirksamkeit potenzieller hepatoprotektive Strategien zu bestimmen und Marker von Leberschäden zu bewerten.

Einleitung

Die Häufigkeit toxischer Beleidigungen der Leber, insbesondere aufgrund von Alkohol- und Drogenmissbrauch, nimmt zu. Akute Leberschäden (ALI) sind mit hohen Sterblichkeitsraten verbunden und haben klinische Bedenken verursacht^1,2. Toxische Verletzungen führen zu Todessignalbahnen in der Leber, was zu Hepatozytenapoptose, Nekrose oder Pyroptose führt. ALI spielt eine entscheidende Rolle bei der Entwicklung von Leberversagen, die durch schwere Leberfunktionsstörungen einschließlich Komplikationen wie Leberenzephalopathie und beeinträchtigte Proteinsynthese gekennzeichnet ist^3,4. Obwohl die jüngsten Forschungen unser Wissen über die physiologischen und pathologischen Veränderungen, die leberversagen begleiten, erweitert haben, hat sie die pathomolekularen Merkmale, die die Mechanismen des Zelltodes beeinflussen, nicht vollständig erklärt. Darüber hinaus sind derzeit keine Medikamente verfügbar, um die fortschreitende Verschlechterung bei ALI-Patienten umzukehren. Derzeit ist die einzige signifikant wirksame Behandlung Lebertransplantation^5,6.

Um den Mechanismus und die Pathophysiologie von ALI zu untersuchen und verschiedene hepatoprotektive Strategien zu testen, werden verschiedene Tiermodelle verwendet, um ALI zu induzieren. Ein bevorzugtes Tiermodell von ALI sollte den pathologischen Prozess der Krankheit über eine zuverlässige, validierte, kostengünstige und einfach anzuwendende Methode nachahmen. Beispiele für experimentelle Modelle sind hepatotoxische Wirkstoffe, chirurgische Eingriffe wie die vollständige oder partielle Hepatektomie, eine vollständige oder vorübergehende Dekonvaskularisation und infektiöse Verfahren^7,8,9. Bekannte hepatotoxische Substanzen sind Galactosamin, Acetaminophen, Thioacetamimid, Azoxymethan und CCl₄. Davon ist CCl₄ weit verbreitet, obwohl es noch nicht gut charakterisiert ist^10,11,12,13.

CCl₄ ist eine organische farblose flüssige Verbindung mit einem süßen Geruch und fast keine Entflammbarkeit bei niedrigeren Temperaturen. Die Exposition gegenüber hohen Konzentrationen von CCl₄ kann Schäden am zentralen Nervensystem verursachen, einschließlich einer Verschlechterung der Leber und der Nieren. CCl₄ induziert ALI durch seine Biotransformation in der Leber, die reaktive Sauerstoffspezies bildet. Dies geschieht über das P450-Zytochrom-Enzym 2E1, das einen aktiven Metaboliten bildet und zu einer Zellschädigung durch Makromolekülbindung, Verbesserung der Lipidperoxidation und Störung der intrazellulären Calciumhomöostase¹⁴führt. Darüber hinaus kann das CCl_4-Modell verwendet werden, um die Astrozyten auf der Ebene der RNA-Synthese¹⁵zu stimulieren. Dieses Hepatotoxin wurde von den intraperitonealen, intraportalen, oralen und intragastrischen Routen¹⁶verabreicht.

In diesem Protokoll beschreiben wir detailliert CCl₄-induziertes ALI bei Ratten über eine orogastrische Röhre. Diese Methode induziert robusteund reproduzierbare ALI, die verwendet werden kann, um die Pathogenese von ALI zu untersuchen. Die Bestimmung der Schwere der Lebererkrankung wird durch Messung von Serumglutamat-Pyruvat-Transaminase (GPT), Glutamic Oxaloestik-Transaminase (GOT)-Enzymen und Bilirubin (TB) sowie der definitiven histologischen Diagnose durch Hämatoxylin und Eosin (H&E) gefärbten Lebergeweben überwacht. Die Exposition gegenüber CCl₄ durch einen intragastrischen Zugang ermöglicht eine praktische, kostengünstige, minimalinvasive Methode mit minimalem Risikorisiko.

Protokoll

Die Versuche wurden gemäß den Empfehlungen der Erklärungen von Helsinki und Tokio und den Leitlinien für die Verwendung von Versuchstieren der Europäischen Gemeinschaft durchgeführt. Die Experimente wurden vom Animal Care Committee der Ben-Gurion University of the Negev genehmigt.

HINWEIS: Das CCl_4-Modell wurde in einer früheren Studie¹⁷generiert und verwendet. Die Protokollzeitachse ist in Tabelle 1dargestellt.

1. Vorbereitung von Ratten auf das Experimentelle Verfahren

HINWEIS: Wählen Sie erwachsene männliche Sprague Dawley Ratten mit einem Gewicht von 300 bis 350 g.

1. Zulassung für Experimente vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).
2. Halten Sie Ratten bei Raumtemperatur (22 °C bei 1 °C), mit 12 h Licht und 12 h dunklen Zyklen. Geben Sie Ratte Chow und Wasser ad libitum.
3. Führen Sie alle Experimente zwischen 6:00 Uhr und 12:00 Uhr durch.
4. Rasieren Sie die Ratte und desinfizieren Sie die Haut mit Alkohol.

2. Bestimmung der Serum-GOT-, GPT- und TB-Basiswerte

1. Anästhesie
   1. Bereiten Sie ein kontinuierliches Isofluran-Verabreichungssystem vor, um Anästhesie zu induzieren. Stellen Sie sicher, dass das Verdampfersystem mit Isofluran gefüllt ist.
   2. Anästhesisieren Sie die Ratte mit 2% Isofluran. Bestätigen Sie, dass die Ratte vollständig betäuisiert wird, indem Sie die Bewegung und den Pedalreflex als Reaktion auf äußere Reize beobachten.
      HINWEIS: Verwenden Sie 1-5% Isofluran zur Anästhesieinduktion und Wartung.
2. Die Schwanzvene mit einem 22 G Katheter ankündigen.
3. Sammeln Sie eine 0,5 ml Blutprobe zu Beginn. Stellen Sie sicher, dass das entnommene Blutvolumen die IACUC-Richtlinien nicht überschreitet.
4. Führen Sie eine biochemische Analyse im Blut durch, einschließlich der Messungen von Serum GOT, GPT und TB, wie zuvor beschrieben¹⁸.
   HINWEIS: Untersuchungen von Leberenzymen und TB-Spiegel wurden im biochemischen Labor des Soroka Medical Center durchgeführt. Blutproben wurden mit hilfe einer Fluoreszenzmethode an einem Chemieanalysator (Tabelle der Materialien) analysiert.

3. Induktion akuter Leberschäden bei Ratten

VORSICHT: Die Exposition gegenüber hohen Konzentrationen von CCl₄, einschließlich Absorption durch Dampf oder Haut, kann negative Auswirkungen auf das zentrale Nervensystem haben und zu einer Degeneration der Leber und der Nieren führen. Längere Exposition kann Koma oder Tod verursachen.

1. Bereiten Sie eine 50%-Lösung von CCl₄ (Materialtabelle) vor, indem Sie CCl₄ mit Olivenöl als Fahrzeug im Verhältnis 1:1 mischen.
   HINWEIS: Die Lösung sollte gemäß den IACUC-Richtlinien für nichtpharmazeutische Verbindungen hergestellt werden.
2. Induzieren Hepatotoxizität in vivo durch CCl₄ Verabreichung über eine orogastrische Röhre.
   1. Legen Sie ein 16 G orogastrisches Rohr (3 Zoll tief) durch die Mundhöhle der Ratte.
   2. Setzen Sie die Ratte verschiedenen Dosen von CCl₄ aus, indem Sie eine Spritze mit einer der folgenden verdünnten Lösungen in den Magen der Ratte injizieren: 1 ml/kg (mildes ALI), 2,5 ml/kg (moderates ALI) oder 5 ml/kg (schweres ALI) der 50%-Lösung. Für die scheinbetriebene Kontrollgruppe setzen Sie die Ratte nur 5 ml/kg Olivenöl aus.

4. Bestimmung der Serum-GOT-, GPT- und TB-Spiegel nach 24 h

1. Anästhesie
   1. Bereiten Sie ein kontinuierliches Isofluran-Verabreichungssystem vor, um Anästhesie zu induzieren. Stellen Sie sicher, dass das Verdampfersystem mit Isofluran gefüllt ist.
   2. Anästhesisieren Sie die Ratten mit 2% Isofluran. Bestätigen Sie, dass die Ratte vollständig betäuisiert wird, indem Sie die Bewegung und den Pedalreflex als Reaktion auf äußere Reize beobachten.
2. Sammeln Sie Blutproben bei 24 h von CCl₄ Exposition.
3. Führen Sie biochemische Analysen im Blut durch, einschließlich Messungen von Serum GOT, GPT und TB.

5. Lebersammlung zur histologischen Untersuchung

1. Euthanisieren Sie die Ratte, indem Sie das inspirierte Gasgemisch durch 20% O₂/80% CO₂ersetzen. Stellen Sie sicher, dass CO₂ gemäß den IACUC-Richtlinien zu einem vorgegebenen Preis geliefert wird.
2. Sicherstellen des Todes durch Überprüfung auf Mangel an Herzschlag und Bestätigung durch eine sekundäre Methode in Übereinstimmung mit den IACUC-Richtlinien.
3. Legen Sie die Ratte auf ein Sezierenbrett mit seiner dorsalen Oberfläche nach unten und Bauch nach oben. Rasieren Sie den Bauch der Ratte.
4. Mit einem Skalpell die gesamte Länge der Ventrumhaut vom Anus bis zum Kinn zu prädienen. Trennen Sie die Haut. Incise die Bauchwand mit einem Skalpell aus dem Anus zum xyphoiden Knorpel, die Bauchviszera aussetzen.
5. Mit Schere und Zange, isolieren Sie die Leber, indem Sie sie von seinen Bändern und Anhaftungen sezieren. Beginnend am Leber-Hilum, sorgfältig eine Hepatectomie durchführen, indem Sie alle Leberlappen aus Anhängen. Sezieren und schneiden Sie alle Bänder und Blutgefäße.
6. Übertragen Sie die Leber in eine Petrischale. Fixieren Sie die Leber in einer 4% gepufferten Formaldehyd-Lösung (Materialtabelle) für mindestens 24 h.

6. Histologische Untersuchung

1. Probenvorbereitung
   1. Nach der Fixierung die Probe durch Mikrotome-Schnitt in eine 5'm dicke Scheibenserie schneiden.
   2. Legen Sie die Scheiben vorsichtig auf Glasgweise mit einem weichen Pinsel, 1 Scheibe pro Folie.
   3. Führen Sie H&E-Färbung wie zuvor beschrieben¹⁹durch.
2. Untersuchen Sie die Scheiben unter dem Mikroskop mit einer 200-fachen Vergrößerung mit einer 20 mm Objektivlinse (Materialtabelle).
   HINWEIS: Die Leberabschnitte sollten von einem spezialisierten Pathologen abgestuft werden, der für das Behandlungsprotokoll geblendet ist. Ein Wert von 0 zeigt keine Leberanomalien an, 1–2 zeigt eine leichte Leberverletzung an, 3–4 für eine mittelschwere Leberverletzung und 5–6 für schwere Leberverletzungen^20,,21,22.

Ergebnisse

Der TB-, GOT- und GPT-Spiegel erhöhte sich signifikant um 24 h, nachdem ALI induziert wurde (mehr bei höheren CCl₄ Dosen) im Vergleich zu scheinbetriebenen Kontrollen (p < 0,001) (Abbildung 1). Die Konzentrationen von TB, GOT und GPT zu Beginn waren normal und unterschieden sich nicht signifikant von Scheinkontrollen. Um 24 Uhr, alle drei interventionsförmigen Gruppen, 1 ml/kg CCl₄ (1, 1x2), 2,5 ml/kg CCl₄ (3, 3x4) und 5 ml/kg CCl₄ (4,4-5,75), h...

Diskussion

In diesem Protokoll, CCl₄ wird als Lebergift verwendet, um ALI bei Ratten zu induzieren. ALI ist gekennzeichnet durch den Verlust von Leberparenchym und anschließende Dysregulation der metabolischen und synthetischen Funktionen der Leber. Medikamente, Viren, Toxine, Autoimmunerkrankungen, Stoffwechselerkrankungen und Gefäßerkrankungen induzieren den Lebertod, und die anschließende Entzündungsreaktion trägt zur Pathogenese von ALI bei.

Die anfängliche Beleidigung der Leber fü...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
22 G catheter BD Neoflon TM	Becton Dickinson Infusion Therapy AB
4% buffered formaldehyde solution	Sigma - Aldrich lab materials technologies
BD Microtainer SST TM Tubes	Becton Dickinson and Company
Carbone tetrachloride	Sigma - Aldrich lab materials technologies	CAS 56-23-5
Isofluran, USP 100%	Piramamal Critical Care, Inc
Olympus AU2700 Chemistry-Immuno Analyzer	Olympus (MN, USA)		Analysis of blood samples was done by the fluorescence method
Olympus BX 40 microscope	Olympus
RAT Feeding Needles	ORCHID SCIENTIFICS
SYRINGE SET 1 and 2 ml MEDI -PLUS	Shandong Zibo Shanchuan Medical Instruments Co., Ltd