Indurre lesioni acute al fegato nei ratti tramite Carbon Tetrachloride (CCl4) Esposizione attraverso un tubo orogastrico

Riepilogo

Questo protocollo descrive un metodo comune e fattibile per indurre lesioni epatiche acute (ALI) tramite l'esposizione di CCl₄ attraverso un tubo orogastrico. L'esposizione a CCl₄ induce ALI attraverso la formazione di specie reattive dell'ossigeno durante la sua biotrasformazione nel fegato. Questo metodo viene utilizzato per analizzare la fisiopatologia di ALI ed esaminare diverse strategie eaptoprotettive.

Abstract

Lesione epatica acuta (ALI) svolge un ruolo cruciale nello sviluppo dell'insufficienza epatica, che è caratterizzata da grave disfunzione epatica tra cui complicazioni come encefalopatia epatica e alterata sintesi proteica. Modelli animali appropriati sono fondamentali per testare il meccanismo e la fisiofisiologia dell'ALI e studiare diverse strategie epatoprotettive. Grazie alla sua capacità di eseguire trasformazioni chimiche, il tetracloruro di carbonio (CCl₄) è ampiamente usato nel fegato per indurre ALI attraverso la formazione di specie reattive dell'ossigeno. L'esposizione al CCl₄ può essere eseguita per via intraperita, per inalazione o attraverso un tubo nasogastrico o orogastrico. Qui, descriviamo un modello di roditore, in cui l'ALI è indotta dall'esposizione cCl₄ attraverso un tubo orogastrico. Questo metodo è economico, facile da eseguire e presenta un rischio minimo. Il modello è altamente riproducibile e può essere ampiamente utilizzato per determinare l'efficacia di potenziali strategie epatiche e valutare i marcatori della lesione epatica.

Introduzione

La frequenza degli insulti tossici al fegato, soprattutto a causa dell'abuso di alcol e droghe, è in aumento. Lesione epatica acuta (ALI) è associato ad alti tassi di mortalità e ha causato preoccupazioni cliniche^1,2. La lesione tossico porta alla morte segnalare vie nel fegato, con conseguente apoptosi epatocite, necrosi, o piroptosi. ALI svolge un ruolo cruciale nello sviluppo dell'insufficienza epatica, che è caratterizzata da grave disfunzione epatica tra cui complicazioni come l'encefalopatia epatica e la alterata sintesi proteica^3,4. Anche se recenti ricerche hanno aumentato le nostre conoscenze sui cambiamenti fisiologici e patologici che accompagnano il fallimento epatico, non ha completamente spiegato le caratteristiche patologiche che influenzano i meccanismi della morte cellulare. Inoltre, nessun farmaco è attualmente disponibile per invertire il progressivo deterioramento nei pazienti con ALI. Attualmente, l'unico trattamento significativamente efficace è il trapianto di fegato^5,6.

Al fine di studiare il meccanismo e la fisiopatologia dell'ALI e per testare diverse strategie epatiche, vengono utilizzati diversi modelli animali per indurre l'ALI. Un modello animale preferito di ALI dovrebbe imitare il processo patologico della malattia attraverso un metodo affidabile, convalidato, poco costoso e facile da applicare. Esempi di modelli sperimentali includono agenti epatotossici, procedure chirurgiche come l'epatitectomia totale o parziale, devascizzazione completa o transitoria e procedure infettive^7,8^,9.⁹ Sostanze epatossiche conosciute includono galactosamina, acetaminofene, tioacetamide, azoxymetano e CCl₄. Di questi, CCl₄ è ampiamente utilizzato anche se non è ancora stato ben caratterizzato^10,11,12,13.

CCl₄ è un composto liquido organico incolore con un odore dolce e quasi nessuna infiammabilità a temperature più basse. L'esposizione ad alte concentrazioni di CCl₄ può causare danni al sistema nervoso centrale, compreso il deterioramento del fegato e dei reni. CCl₄ induce ALI attraverso la sua biotrasformazione nel fegato, che forma specie reattive di ossigeno. Ciò avviene tramite l'enzima citocromatico P450 2E1, formando un metabolita attivo e causando danni alle cellule da legante macromolecola, miglioramento della perossidazione dei lipidi e disturbo dell'omeostasi del calcio intracellulare¹⁴. Inoltre, il modello CCl₄ può essere utilizzato per stimolare gli astrociti a livello di sintesi dell'RNA¹⁵. Questa epatotossina è stata amministrata dalle rotte intraperitoneali, intraportali, orali e intragastrici¹⁶.

In questo protocollo, descriviamo in dettaglio CCl₄-indotto ALI nei ratti tramite un tubo orogastrico. Questo metodo induce ALI robusto e riproducibile che può essere utilizzato per studiare la patogenesi di ALI. La determinazione della gravità della malattia epatica è monitorata dalla misurazione della traminare siero-pyruvate (GPT), degli enzimi glutaloe tranamicici (GOT) e della bilirubina totale (TB) e della diagnosi istologica definitiva da parte di tessuti epatici macchiati di ematossina ed eosina (H&E). L'esposizione a CCl₄ attraverso un accesso intragastrico consente un metodo pratico, economico e minimamente invasivo con un rischio minimo di rischio.

Protocollo

Gli esperimenti sono stati condotti secondo le raccomandazioni delle dichiarazioni di Helsinki e Di Oleuatori e agli orientamenti per l'uso degli animali sperimentali della Comunità europea. Gli esperimenti sono stati approvati dal Comitato per la cura degli animali dell'Università Ben-Gurion del Negev.

NOTA: il modello CCl₄ è stato generato e utilizzato in uno studio precedente¹⁷. La sequenza temporale del protocollo è illustrata nella tabella 1.

1. Preparazione dei ratti per la procedura sperimentale

NOTA: Selezionare i ratti Maschi Adulti Sprague Dawley del peso di 300-350 g.

1. Ottenere l'approvazione per gli esperimenti da Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).
2. Mantenete i ratti a temperatura ambiente (22 gradi centigradi), con 12 h di luce e 12 h di cicli scuri. Fornire ratto chow e acqua ad libitum.
3. Eseguire tutti gli esperimenti tra le 6:00 e le 12:00 p.m.
4. Rasare il topo e disinfettare la pelle con alcol.

2. Determinazione dei livelli di base GOT, GPT e TB del siero

1. Anestesia
   1. Preparare un sistema di amministrazione isoflurano continuo per indurre l'anestesia. Assicurarsi che il sistema vaporizzatore sia riempito con isoflurane.
   2. Anestesizzare il ratto con 2% isoflurane. Confermare che il ratto è completamente anestetizzato osservando il movimento e il riflesso del pedale in risposta agli stimoli esterni.
      NOTA: Utilizzare l'1/5% di isoflurane per l'induzione e la manutenzione dell'anestesia.
2. Cannula la vena posteriore con un catetere da 22 G.
3. Raccogliere un campione di sangue di 0,5 mL al basale. Assicurarsi che il volume sanguigno recuperato non superi le linee guida IACUC.
4. Eseguire analisi biochimiche del sangue, incluse le misurazioni del siero GOT, GPT e TB, come descritto in precedenza¹⁸.
   NOTA: Gli esami degli enzimi epatici e del livello di TB sono stati effettuati nel laboratorio biochimico del Soroka Medical Center. Campioni di sangue sono stati analizzati utilizzando un metodo di fluorescenza su un analizzatore chimico (Tabella dei materiali).

3. Induzione di lesioni epatiche acute nei ratti

AVVISO: l'esposizione ad alte concentrazioni di CCl₄, compreso l'assorbimento attraverso il vapore o la pelle, può avere effetti negativi sul sistema nervoso centrale e causare la degenerazione del fegato e dei reni. L'esposizione prolungata può causare coma o morte.

1. Preparare una soluzione del 50% di CCl₄ (Table of Materials) mescolando CCl₄ con olio d'oliva come veicolo in un rapporto 1:1.
   NOTA: La soluzione deve essere preparata secondo le linee guida IACUC per i composti di grado non farmaceutico.
2. Indurre l'epatotossicità in vivo dalla somministrazione CCl₄ tramite un tubo orogastrico.
   1. Inserire un tubo orogastrico da 16 G (3 pollici di profondità) attraverso la cavità orale del ratto.
   2. Esporre il ratto a diverse dosi di CCl₄ iniettando una siringa con una delle seguenti soluzioni diluite nello stomaco del ratto: 1 mL/kg (MILD ALI), 2,5 mL/kg (ALI moderato), o 5 mL/kg (ALI grave) della soluzione 50%. Per il gruppo di controllo con finta, esporre il ratto a 5 mL/kg di olio d'oliva solo.

4. Determinazione dei livelli di siero GOT, GPT e TB dopo 24 h

1. Anestesia
   1. Preparare un sistema di amministrazione isoflurano continuo per indurre l'anestesia. Assicurarsi che il sistema vaporizzatore sia riempito con isoflurane.
   2. Anestesizzare i ratti con 2% isoflurane. Confermare che il ratto è completamente anestetizzato osservando il movimento e il riflesso del pedale in risposta agli stimoli esterni.
2. Raccogliere campioni di sangue a 24 ore dall'esposizione a CCl_4.
3. Eseguire analisi biochimiche del sangue, incluse le misurazioni del siero GOT, GPT e TB.

5. Raccolta del fegato per l'esame istologico

1. Eutanasia il ratto sostituendo la miscela di gas ispirata con 20% O₂/ 80% CO₂. Assicurarsi che_co2 venga erogata a un tasso predeterminato in conformità alle linee guida IACUC.
2. Garantire la morte controllando la mancanza di battito cardiaco e confermare con un metodo secondario in conformità con le linee guida IACUC.
3. Posizionare il ratto su una tavola di dissezione con la superficie dorsale rivolta verso il basso e l'addome rivolto verso l'alto. Rasare l'addome del topo.
4. Con un bisturi, incisi l'intera lunghezza della pelle di ventrum dall'ano al mento. Separare la pelle. Incise la parete addominale con un bisturi dall'ano alla cartilagine xifoide, esponendo le viscere addominali.
5. Usando forbici e pinze, isolare il fegato sezionandolo dai suoi legamenti e attaccamenti. A partire dall'hilum del fegato, eseguire con attenzione un'epatitectomia rilasciando tutti i lobi epatici dagli attacchi. Dissezionare e tagliare tutti i legamenti e vasi sanguigni.
6. Trasferire il fegato in un piatto Petri. Fissare il fegato in una soluzione di formaldeide tamponella tampolata del 4% (Tabella dei materiali) per almeno 24 h.

6. Esame istologico

1. Preparazione del campione
   1. Dopo la fissazione, tagliare il campione in serie di fette spesse 5 m mediante sezionamento di microtomi.
   2. Posizionare delicatamente le fette su vetrini di vetro con un pennello morbido, 1 fetta per diapositiva.
   3. Eseguire la colorazione H&E come descritto in precedenza¹⁹.
2. Esaminate le fette al microscopio a un ingrandimento di 200 x utilizzando una lente obiettivo di 20 mm (Tabella dei materiali).
   NOTA: Le sezioni epatiche devono essere classificate da un patologo specializzato accecato al protocollo di trattamento. Un punteggio pari a 0 indica nessuna anomalia epatica, 1–2 indica lievi lesioni epatiche, 3-4 indica lesioni epatiche moderate e 5-6 indica gravi lesioni epatiche^20,21,22.

Risultati

I livelli di TB, GOT e GPT sono aumentati in modo significativo di 24 h dopo aver indotto ALI (più a dosi più elevate di CCl₄₎ rispetto ai controlli gestiti da sham (p < 0,001) (Figura 1). I livelli di TB, GOT e GPT al basale erano normali e non erano significativamente diversi rispetto ai controlli di finta. A 24 ore, tutti e tre i gruppi interventistici, 1 mL/kg CCl₄ (1, 1,2), 2,5 mL/kg CCl₄ (3, 3,4) e 5 mL/kg CCl₄ (4, 4,5,75), aveva un puntegg...

Discussione

In questo protocollo, CCl₄ è usato come una tossina epatica per indurre ALI nei ratti. AlI è caratterizzato da perdita di parenchyma epatico e successiva disregolazione delle funzioni metaboliche e sintetiche del fegato. Farmaci, virus, tossine, malattie autoimmuni, malattie metaboliche e disturbi vascolari inducono tutti la morte degli epatociti, e la successiva risposta infiammatoria contribuisce alla patogenesi dell'AlI.

L'insulto iniziale al fegato porta alla produzione di cit...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
22 G catheter BD Neoflon TM	Becton Dickinson Infusion Therapy AB
4% buffered formaldehyde solution	Sigma - Aldrich lab materials technologies
BD Microtainer SST TM Tubes	Becton Dickinson and Company
Carbone tetrachloride	Sigma - Aldrich lab materials technologies	CAS 56-23-5
Isofluran, USP 100%	Piramamal Critical Care, Inc
Olympus AU2700 Chemistry-Immuno Analyzer	Olympus (MN, USA)		Analysis of blood samples was done by the fluorescence method
Olympus BX 40 microscope	Olympus
RAT Feeding Needles	ORCHID SCIENTIFICS
SYRINGE SET 1 and 2 ml MEDI -PLUS	Shandong Zibo Shanchuan Medical Instruments Co., Ltd