JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

وقد تم وضع عدة طرق مختلفة لتلطيخ المناعة المتعددة باستخدام الأجسام المضادة الأولية من نفس الأنواع المضيفة. هنا ، نصف استخدام تجريد الأجسام المضادة بوساطة الميكروويف وفلوروفور -التياراميد لمنع تفاعل الأجسام المضادة أثناء تلطيخ المناعة المتعدد على أقسام الغدة الكظرية للفئران الثابتة من البارافين الثابتة.

Abstract

يستخدم تلطيخ المناعة على نطاق واسع في البحوث الطبية الحيوية لإظهار نمط التعبير الخلوي لبروتين معين. يسمح تلطيخ المناعة المتعدد بالوسم باستخدام أجسام مضادة أولية متعددة. لتقليل التفاعل عبر الأجسام المضادة، يتطلب تلطيخ المناعة المتعدد باستخدام تلطيخ غير مباشر أجسامًا مضادة أولية غير محددة من أنواع مضيفة مختلفة. ومع ذلك ، فإن المزيج المناسب من الأجسام المضادة الأنواع المختلفة ليست متاحة دائما. هنا، نصف طريقة استخدام الأجسام المضادة الأولية غير المسماة من نفس الأنواع المضيفة (على سبيل المثال، في هذه الحالة كلا الأجسام المضادة هي من أرنب) لمثبطات المناعة المتعددة على الفورلين الثابتة البارافين جزءا لا يتجزأ (FFPE) أقسام الأدرينالين الماوس. تستخدم هذه الطريقة نفس الإجراء والكواشف المستخدمة في خطوة استرجاع المستضد لتجريد نشاط مجمع الأجسام المضادة الأولية الملطخ سابقًا. كانت الشرائح ملطخة بالأجسام المضادة الأولية الأولى باستخدام بروتوكول تلطيخ مناعي عام متبوع بخطوة ملزمة بجسم مضاد ثانوي حيوي. ثم، تم استخدام طريقة تطوير إشارة avidin-biotin-peroxidase مع فلوروفور-تيراميد كركيزة. تم تجريد النشاط المناعي لأول مجمع الأجسام المضادة الأولية من خلال الغمر في محلول سيترات الصوديوم المغلي بالموجات الدقيقة لمدة 8 دقيقة. وبقي ترسب الفلوروفور-التيراميد غير القابل للذوبان على العينة، مما سمح بتلطيخ الشريحة بالأجسام المضادة الأولية الأخرى. على الرغم من أن هذا الأسلوب يلغي معظم الإشارات الإيجابية الكاذبة، قد تبقى بعض الخلفية من تفاعل الأجسام المضادة. إذا تم إثراء العينات بالبيوتين الذاتي، يمكن استخدام جسم ثانوي مترافق مع البيروكسيديز ليحل محل الجسم المضاد الثانوي الحيوي لتجنب الإيجابية الكاذبة من البيوتين الذاتي ة المنتفية.

Introduction

في التلطخ المناعي المتعدد، يمكن أن يوفر تلطيخ مباشر باستخدام الأجسام المضادة الأولية المترافقة نتائج مفيدة. دون استخدام الأجسام المضادة الثانوية، وطريقة تلطيخ المباشر لديه خطر منخفض من إشارات توطين كاذبة من التفاعل عبر الأجسام المضادة. ومع ذلك ، فإن المراسلين المترافقين (الفلوروفور ، الإنزيمات) أو البيوتين على الأجسام المضادة الأولية يحدون من استخدامه في المستقبل. بدلاً من ذلك، عادة ما يوفر تلطيخ المناعة غير المباشر إشارات أقوى باستخدام جسم مضاد أولي غير مُجرَّد بجسم مضاد ثانوي مُلصق. من الناحية المثالية ، يجب أن تأتي الأجسام المضادة الأولية غير المنقطعة المنتية المستخدمة في تلطيخ المناعة المتعدد من أنواع مضيفة مختلفة لتجنب تفاعل الأجسام المضادة. ومع ذلك ، فإن المزيج المناسب من الأجسام المضادة الأولية من الأنواع المضيفة المختلفة غير متاح دائمًا.

وقد وضعت عدة طرق للقضاء على خطر الجسم المضاد الثانوي تتفاعل مع الأجسام المضادة الأولية غير المرغوب فيها. طريقة واحدة شائعة هي استخدام الأجسام المضادة أحادية F (ab) لمنع أي epitopes ملزمة المتبقية على أول مجمع الأجسام المضادة الأولية قبل تلطيخ مع الأجسام المضادة الأولية الثانية1. تجريد الأجسام المضادة ، والتي تشبه الشريط وإعادة سبر من ورقة لطخة الغربية ، يزيل مجمع الأجسام المضادة الملطخة سابقا دون تجريد ترسب جزيئات المراسل ة القابلة للكشف مثل 3،3'diaminobenzidine رباعي هيدروكلوريد (DAB)2 وترسب التيراميد الفلورسنت3. مع هذه الطريقة، يمكن أن تظهر جزيئات المراسل بألوان مختلفة نتيجة متعددة على نفس الشريحة. يمكن أيضًا تحقيق تلطيخ تعدد الأجسام من خلال الإزالة الكاملة للطبقات المودعة سابقًا من الأجسام المضادة ومحاذاة الصور التي تم الحصول عليها لاحقًا من الأجسام المضادة الأخرى4،5. هذه الأساليب تعطي جميع نتائج موثوق بها، على الرغم من أن كل طريقة لها حدودها وتتطلب إما إجراءات معقدة أو نظام تصوير خاص.

يُظهر البروتوكول الحالي تطبيق طريقة تجريد الأجسام المضادة باستخدام المخازن المؤقتة المتاحة بشكل شائع. يمكن استخدام هذا البروتوكول لإجراء تلطيخ الفلورسنت المناعي المتعدد على أقسام الغدة الكظرية للفأرة (FFPE) الثابتة البارافين (FFPE) مع اثنين من الأجسام المضادة الأولية غير المسماة من نفس النوع المضيف.

Protocol

1. تلطيخ مع الأجسام المضادة الأولى

  1. إزالة الشمع وإعادة ترطيب شرائح FFPE مع 5 دقيقة مخصصة لكل من الخطوات التالية: xylene أو الكواشف المكافئة 3x ، 100٪ الإيثانول 2x ، 95٪ الإيثانول 1x ، 70٪ الإيثانول 1x ، 50٪ الإيثانول 1x ، والمياه المقطرة 2x.
    ملاحظة: يجب أن تظل الشرائح رطبة بدءًا من خطوة الإماهة هذه حتى تتصاعد في الخطوة الأخيرة.
  2. لاسترجاع المستضد الاختياري، ضع الشرائح في 275 مل من محلول سترات الصوديوم المغلي (10 مM، درجة الحموضة = 6.0) لمدة 8 دقيقة. للحفاظ على غليان الحل، ضع الشرائح مسطحة على الجزء السفلي من 14 × 9.5 × 9 سم3 (W x L x H) صندوق طرف ماصة مع غطاء وميكروويف الحل على طاقة 70٪ في فرن ميكروويف 700 W لمدة 8 دقيقة. ثم قم بإزالة صندوق الماصة من فرن الميكروويف، وافتح الغطاء، واترك الحل يبرد في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 20 دقيقة على الأقل.
  3. نقل الشرائح إلى جرة كوبلين تحتوي على PBST (الفوسفات العازلة المالحة مع 0.1٪ polysorbate 20/80). يغسل مع PBST لمدة 5 دقيقة 3x. إذا لم تتحرك على الفور إلى الخطوة التالية، تخزين الشرائح في هذه الخطوة مع PBST في جرة كوبلين في RT لبضع ساعات أو في 4 درجة مئوية لمدة 1-2 أيام إذا لم تتحرك على الفور إلى الخطوة التالية.
  4. لإعداد محلول الحجب استخدم المصل العادي للأنواع المضيفة للأجسام المضادة الثانوية ككاشف مانع. كما يمكن استخدام كواشف حظر تجارية أخرى. إذا كان استخدام المصل العادي المستخدمة للدراسة المقدمة في هذه الدراسة، إضافة 100 ميكرولتر من مصل حمار عادي إلى 4.9 مل من PBST. يمكن تخزين حل الحظر عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 3 أيام.
  5. للحظر، تخلص من PBST من الشرائح وتغطيتها بسرعة بحل حظر كافٍ. احتضان الشرائح في RT في غرفة رطبة لمدة 30 دقيقة.
  6. إعداد المحلول الأساسي للأجسام المضادة (500 ميكرولتر لشريحتين) باستخدام محلول الحجب لتمييع الجسم المضاد الأساسي إلى التركيز المطلوب. يجب تخزين الحل على الجليد حتى الاستخدام.
    1. بالنسبة لـ 3αHSD، أضف 2 ميكرولتر من 3αHSD إلى 498 ميكرولتر من محلول الحجب.
    2. لTH، إضافة 0.5 ميكرولتر من الأجسام المضادة TH إلى 499 ميكرولتر من محلول الحجب.
    3. بالنسبة لـ α-catenin، أضف 1 ميكرولتر من الأجسام المضادة α-catenin إلى 499 ميكرولتر من محلول الحجب.
    4. بالنسبة لـ 20αHSD، أضف 1 ميكرولتر من الجسم المضاد 20αHSD إلى 499 ميكرولتر من محلول الحجب.
    5. بالنسبة لـ CYP2F2، أضف 2 ميكرولتر من الأجسام المضادة CYP2F2 إلى 498 ميكرولتر من محلول الحجب.
  7. احتضان مع الأجسام المضادة الأولية عن طريق التخلص من حل الحجب من الشرائح ، وتغطيتها بسرعة مع ما يكفي من محلول الأجسام المضادة الأولية. احتضان الشرائح في غرفة رطبة بين عشية وضحاها عند 4 درجة مئوية. أثناء الحضانة يمكن تغطية الشرائح بقطعة صغيرة من فيلم البارافين لمنع الجفاف.
  8. في صباح اليوم التالي غسل الشرائح مع PBST لمدة 5 دقيقة 3x.
  9. إعداد محلول الأجسام المضادة الثانوي (500 ميكرولتر لشريحتين) باستخدام محلول الحجب لتمييع الجسم المضاد الثانوي biotinylated إلى التركيز المطلوب (على سبيل المثال، 1 μL من الأجسام المضادة للفأرة الحمار أو الأجسام المضادة للأرنب الحمار إلى 499 ميكرولتر من الحجب الحل). يجب تخزين الحل على الجليد حتى الاستخدام.
  10. احتضان مع الجسم المضاد الثاني عن طريق التخلص من PBST من الشرائح وتغطيتها بسرعة مع ما يكفي من محلول الأجسام المضادة الثانوية. احتضان الشرائح في غرفة رطبة لمدة 1 ساعة في RT.
    ملاحظة: إذا كان البيوتين الذاتي هو مصدر قلق، استخدم الأجسام المضادة الثانوية المعتمية البيروكسيديز بدلاً من الجسم المضاد الثانوي biotinylated. الانتقال إلى الخطوة 1.14 إذا كان استخدام الأجسام المضادة الثانوية بيروكسيديز مترافق في الخطوة 1.10.
  11. غسل الشرائح مع PBST لمدة 5 دقيقة 3x.
  12. إعداد حل البيربوسيداز الفجل المترافق (SA-HRP) (500 ميكرولتر لشريحتين) عن طريق إضافة 0.5 ميكرولتر من SA-HRP إلى 499 ميكرولتر من PBS. التركيز النهائي هو 1 ميكروغرام / مل.
  13. احتضان مع حل SA-HRP. تخلص من PBST من الشرائح وتغطية الشرائح بسرعة مع حل SA-HRP كافية. احتضان الشرائح في غرفة رطبة لمدة 0.5 ساعة في RT.
  14. غسل الشرائح مع PBST لمدة 5 دقيقة 3x.
  15. إعداد محلول فلوروفور-تيراميد عن طريق تخفيف الفلوروفور-التيراميد مع عازل التخفيف وفقا لتعليمات الشركة المصنعة (على سبيل المثال، 5 ميكرولتر من الفلوروفور-التيراميد إلى 496 ميكرولتر من العازلة المخفف).
  16. تنفيذ تطوير إشارة مع فلوروفور-التيراميد عن طريق التخلص من PBST من الشرائح وتغطي بسرعة الشرائح مع كمية كافية من محلول فلوروفور-تيراميد. احتضان في غرفة رطبة لمدة 1 دقيقة في RT. يمكن تعديل وقت الحضانة للحصول على كثافة الفلورية المطلوبة. وقف رد الفعل عن طريق نقل الشرائح إلى جرة كوبلين تحتوي على PBST. غسل الشرائح مع PBST لمدة 3 دقيقة 2x.
  17. قد يتم فحص الإشارات بسرعة تحت مجهر مضان لتأكيد النتيجة في هذه المرحلة. إذا لم يتم استخدام القسائم، وتطبيق قطرة من الجلسرين: PBS (1:1) على كل قسم للحفاظ على عينات رطبة. غسل الشرائح مع PBST لمدة 3 دقيقة 2x. يمكن تخزين الشرائح في PBST عند 4 درجة مئوية لبضعة أيام قبل الانتقال إلى الخطوة التالية.

2. تجريد الأجسام المضادة الأولى

  1. ضع الشرائح في 275 مل من محلول سيترات الصوديوم المغلي (10 ملي، درجة الحموضة = 6.0) لمدة 8 دقيقة على الأقل. إذا كان الوقت أطول تجريد المفضل، قد يكون مطلوباً لأعلى قبالة المخزن المؤقت باستخدام محلول الغليان السُليوم للحفاظ على الشرائح مغمورة في حل العازلة في جميع الأوقات. أزل صندوق الماصة من فرن الميكروويف، وافتح الغطاء، واترك الحل يبرد في RT لمدة 20 دقيقة على الأقل.
  2. نقل الشرائح إلى جرة كوبلين تحتوي على PBST. يغسل مع PBST لمدة 5 دقيقة 3x. إذا لم يتم تنفيذ الخطوة التالية على الفور، قم بتخزين الشرائح في جرة كوبلين مع PBST في RT لبضع ساعات أو عند 4 درجات مئوية لمدة 1-2 أيام.

3. وصمة عار مع الجسم المضاد الثاني

  1. ابدأ من خطوة الحظر واتبع نفس الإجراءات في الخطوة 1.5 حتى الخطوة 1.14. في خطوات تطوير الإشارة (الخطوة 1.15 والخطوة 1.16)، استخدم الفلوروفور-التيراميد في طيف فلوري مختلف.
    ملاحظة: يمكن تجريد الشرائح باستخدام هذا الأسلوب عدة مرات للسماح تلطيخ تعدد. الأجسام المضادة الأخيرة لا تتطلب فلوروفور-تيراميد كمراسل. يمكن استخدام الأجسام المضادة الثانوية المترافقة بالفلور لإظهار إشارات من آخر جسم مضاد أولي.
  2. الشرائح التضاء مع 2 ميكروغرام / مل 4'، 6-ديامدينو-2-فينيليندول (DAPI) أو محلول Hoechst لمدة 1 دقيقة في RT إذا كانت هناك حاجة تلطيخ مضاد نووي. ثم غسل الشرائح مع PBST لمدة 3 دقيقة 2x.

4. التصوير باستخدام المجهر الفلوري للكشف عن الإشارات

  1. قم بتركيب قسيمة تغطية مع قطرة من متوسط التركيب المناسب للفلورية المناعية.
  2. للتصوير، استخدم مجهر الفلورسينس للكشف عن إشارات كل قناة فلورية. تبدأ مع قناة تلطيخ النووية (DAPI) وعدسة 4x لتحديد موقع الأنسجة على الشريحة.
  3. التبديل إلى عدسة 10x للتصوير. ضبط وقت التعرض (300 مللي ثانية) وشدة مصدر الضوء (كثافة 80٪). ضبط هذه الإعدادات إذا كانت الإشارة ساطعة جداً أو داكنة جداً. التقاط صور لكل قناة دون تحريك المرحلة. قد تكون هناك حاجة إلى إعادة التركيز لكل قناة. دمج الصور من كل قناة باستخدام برنامج المجهر أو ImageJ (imagej.nih.gov/ij/).

النتائج

تم الحصول على النتائج من عينات عولجت بجميع الخطوات الموصوفة بما في ذلك خطوة استرجاع المستضد 1.2. جميع الأجسام المضادة الثانوية المستخدمة هنا كانت biotinylated. تم استخدام فلوروفور-تيراميد لتطوير إشارات من الأجسام المضادة الأولية الأولى والثانية. تم التقاط الصور باستخدام مجهر ?...

Discussion

يعد التلطخ المناعي المتعدد مفيدًا لفحص التوطين الخلوي لمستضدين أو أكثر. هذه التقنية المستخدمة على نطاق واسع تعطي نتائج مقنعة للتوطين عندما تكون الأجسام المضادة الأولية مترافقة مع مراسلين مختلفين (تلطيخ مباشر). ومع ذلك ، فإن تلطيخ مباشر عادة ما يوفر إشارات أضعف مقارنة بتلطيخ غير مباشر ، وا...

Disclosures

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

Acknowledgements

ويدعم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة R00 HD032636.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Antifade Mounting MediumVector LaboratoriesH-1000
Biotinylated donkey anti-mouseJacksonImmuno715-066-1511:500 dilution
Biotinylated donkey anti-rabbitJacksonImmuno711-066-1521:500 dilution
DAPIBioLegend4228012 μg/mL in distilled water
Fluorescence microscopeECHORevolve 4
Horseradish peroxidase-conjugated streptavidinJacksonImmuno016-030-0841:1,000 dilution
Microwave oven, 700 WGeneral ElectricJEM3072DH1BB
Mouse anti-CYP2F2Santa CruzSC-3745401:250 dilution
Mouse anti-THSanta CruzSC-252691:1,000 dilution
Normal donkey serumJacksonImmuno017-000-1212% serum in PBST
Rabbit anti-20αHSDKerafastEB40021:500 dilution
Rabbit anti-3βHSDTransGenicKO6071:250 dilution
Rabbit anti-THNOVUSNB300-1091:1,000 dilution
Rabbit anti-β-cateninAbcamab325721:500 dilution
Streptavidin Horseradish Peroxidase (SA-HRP)JacksonImmuno016-303-0841:1,000 dilution
TSA Cy3 TyramidePerkinElmerSAT704B001EA1:100 dilution
TSA Fluorescein TyramidePerkinElmerSAT701001EA1:100 dilution

References

  1. Lewis Carl, S. A., Gillete-Ferguson, I., Ferguson, D. G. An indirect immunofluorescence procedure for staining the same cryosection with two mouse monoclonal primary antibodies. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 41 (8), 1273-1278 (1993).
  2. Lan, H. Y., Mu, W., Nikolic-Paterson, D. J., Atkins, R. C. A novel, simple, reliable, and sensitive method for multiple immunoenzyme staining: use of microwave oven heating to block antibody crossreactivity and retrieve antigens. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 43 (1), 97-102 (1995).
  3. Tornehave, D., Hougaard, D. M., Larsson, L. Microwaving for double indirect immunofluorescence with primary antibodies from the same species and for staining of mouse tissues with mouse monoclonal antibodies. Histochemistry and Cell Biology. 113 (1), 19-23 (2000).
  4. Kim, M., Soontornniyomkij, V., Ji, B., Zhou, X. System-wide immunohistochemical analysis of protein co-localization. PLoS One. 7 (2), e32043 (2012).
  5. Bolognesi, M. M., et al. Multiplex Staining by Sequential Immunostaining and Antibody Removal on Routine Tissue Sections. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 65 (8), 431-444 (2017).
  6. Toth, Z. E., Mezey, E. Simultaneous visualization of multiple antigens with tyramide signal amplification using antibodies from the same species. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 55 (6), 545-554 (2007).
  7. Buchwalow, I., Samoilova, V., Boecker, W., Tiemann, M. Multiple immunolabeling with antibodies from the same host species in combination with tyramide signal amplification. Acta Histochemica. 120 (5), 405-411 (2018).
  8. Bauer, M., Schilling, N., Spanel-Borowski, K. Limitation of microwave treatment for double immunolabelling with antibodies of the same species and isotype. Histochemistry and Cell Biology. 116 (3), 227-232 (2001).
  9. Pirici, D., et al. Antibody elution method for multiple immunohistochemistry on primary antibodies raised in the same species and of the same subtype. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 57 (6), 567-575 (2009).
  10. Glass, G., Papin, J. A., Mandell, J. W. SIMPLE: a sequential immunoperoxidase labeling and erasing method. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 57 (10), 899-905 (2009).
  11. Zhang, W., et al. Fully automated 5-plex fluorescent immunohistochemistry with tyramide signal amplification and same species antibodies. Laboratory Investigation. 97 (7), 873-885 (2017).
  12. Paul, A., Laufer, E. Endogenous biotin as a marker of adrenocortical cells with steroidogenic potential. Molecular and Cellular Endocrinology. 336 (1-2), 133-140 (2011).
  13. Bussolati, G., Gugliotta, P., Volante, M., Pace, M., Papotti, M. Retrieved endogenous biotin: a novel marker and a potential pitfall in diagnostic immunohistochemistry. Histopathology. 31 (5), 400-407 (1997).
  14. Wang, H., Pevsner, J. Detection of endogenous biotin in various tissues: novel functions in the hippocampus and implications for its use in avidin-biotin technology. Cell and Tissue Research. 296 (3), 511-516 (1999).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

156

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved