JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Было установлено несколько различных методов мультиплексного иммуностоинга с использованием первичных антител одного и того же вида хозяев. Здесь мы описываем использование микроволновой опосредованной антитела зачистки и фторофора-тирамид блокировать антитела поперечной реактивности во время мультиплексиммуностина на формалин фиксированной парафин-встроенных мыши надпочечников разделов.

Аннотация

Иммуностоинг широко используется в биомедицинских исследованиях, чтобы показать клеточное выражение картины данного белка. Мультиплекс иммуностоидает позволяет маркировки с использованием нескольких первичных антител. Чтобы свести к минимуму кросс-реактивность антител, мультиплекс иммуномаркировки с использованием косвенного окрашивания требует немаркированных первичных антител от различных видов хозяина. Однако, соответствующее сочетание различных видов антител не всегда доступна. Здесь мы описываем метод использования немаркированных первичных антител из тех же видов хозяев (например, в данном случае оба антитела от кролика) для мультиплекса иммунофлуоресценции на формалино-фиксированной парафин-встроенных (FFPE) мыши надпочечников разделов. Этот метод использует ту же процедуру и реагенты, используемые в шаге поиска антигена, чтобы лишить активность ранее окрашенных первичного комплекса антител. Слайды были окрашены первым первичным антителом с использованием общего протокола иммуностоинга с последующим связывающим шагом с биотинилатированным вторичным антителом. Затем в качестве субстрата использовался метод развития сигнала авидин-биотин-пероксидаза. Иммуноактивность первого первичного комплекса антител была снята путем погружения в микроволновой кипящей цитрат натрия раствор в течение 8 минут. Нерастворимый фторофор-тирамид осаждения остались на образце, что позволило слайд быть окрашены с другими первичными антителами. Хотя этот метод устраняет большинство ложных положительных сигналов, некоторый фон от перекрестной реактивности антител может остаться. Если образцы обогащены эндогенным биотином, пероксидаза-конъюгированных вторичных антител может быть использована для замены биотинилаповых вторичных антител, чтобы избежать ложного срабатывания от восстановленного эндогенного биотина.

Введение

В мультиплексе иммуносточинов, прямое окрашивание с использованием конъюгированных первичных антител может обеспечить информативные результаты. Без использования вторичных антител, метод прямого окрашивания имеет низкий риск ложных сигналов колокализации от перекрестной реактивности антител. Однако конъюгированные репортеры (фторофор, ферменты) или биотин на первичном антителе ограничивают его использование в будущем. Кроме того, косвенное иммуностоирование обычно обеспечивает более сильные сигналы с помощью неконъюгированных первичных антител с помеченными вторичными антителами. В идеале, неконъюгированные первичные антитела, используемые в мультиплексном иммуностонинге, должны поступать от различных видов хозяев, чтобы избежать перекрестной реактивности антител. Однако, соответствующее сочетание первичных антител от различных видов хозяина не всегда доступны.

Было установлено несколько методов для устранения риска реакции вторичных антител нежелательным первичным антителом. Одним из распространенных методов является использование мономерных антител F (AB) для блокирования любых оставшихся связывающих эпитопов на первом первичном комплексе антител перед окрашиванием второго первичного антитела1. Зачистка антител, которая похожа на полосу и повторное исследование западного листа побот, удаляет ранее окрашенные антитела комплекса без зачистки осаждения обнаруживаемых молекул репортера, таких как 3,3'-диаминобензидин тетрагидрохлорид (DAB)2 и флуоресцентные тирамида осаждения3. С помощью этого метода молекулы репортера в разных цветах могут показывать результат мультиплекса на одном слайде. Мультиплексок окрашивания также достижимо путем полного удаления ранее отложенных слоев антител и выравнивание впоследствии приобретенных изображений из других антител4,5. Все эти методы дают надежные результаты, хотя каждый метод имеет свои ограничения и требует либо сложных процедур, либо специальной системы визуализации.

Настоящий протокол показывает применение метода зачистки антител с использованием широко доступных буферов. Этот протокол может быть использован для выполнения мультиплекс иммунофторных окрашивания на формалина фиксированной парафин-встроенных (FFPE) мыши надпочечников разделы с двумя немаркированных первичных антител из тех же видов хозяина.

протокол

1. Окрашивание первым антителом

  1. Dewax и регидратировать FFPE слайды с 5 мин, выделенных на каждый из следующих шагов: ксилен или эквивалентные реагенты 3x, 100% этанол 2x, 95% этанола 1x, 70% этанола 1x, 50% этанола 1x, и перегоняемая вода 2x.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Слайды должны оставаться влажными, начиная с этого шага регидратации до монтажа в заключительном шаге.
  2. Для дополнительного поиска антигена поместите слайды в 275 мл раствора цитрата натрия (10 мм, рН 6,0) в течение 8 мин. Чтобы сохранить раствор кипения, поместите слайды плашмя на дне 14 х 9,5 х 9 см3 (W х L х H) pipette наконечник поле с крышкой и микроволновой раствор на 70% мощности в микроволновой печи 700 Вт в течение 8 минут. Затем выньте трубчатый ящик из микроволновой печи, откройте крышку и дайте раствору остыть при комнатной температуре (RT) не менее 20 минут.
  3. Передача слайдов в банку Коплин, содержащий PBST (фосфат-буферный солевой раствор с 0,1% полисорбат 20/80). Вымойте с PBST в течение 5 мин 3x. Если не сразу перейти к следующему шагу, хранить слайды на этом шаге с PBST в банку Коплин на RT в течение нескольких часов или при 4 градусов по Цельсию в течение 1-2 дней, если не сразу перейти к следующему шагу.
  4. Для подготовки блокирующего раствора используйте нормальную сыворотку вторичного вида антител в качестве блокирующего реагента. Также могут использоваться другие коммерческие блокирующие реагенты. При использовании нормальной сыворотки, используемой для исследования, представленного в данном исследовании, добавьте 100 qL нормальной сыворотки осла к 4,9 мл PBST. Блокирующее решение может храниться при 4 градусах Цельсия в течение 3 дней.
  5. Для блокирования, стряхните PBST со слайдов и быстро накройте их достаточным блокирующим решением. Инкубировать горки на RT в увлажненной камере в течение 30 минут.
  6. Подготовьте основной раствор антитела (500 л для двух слайдов) с помощью блокирующего раствора, чтобы разбавить первичное антитело до нужной концентрации. Раствор следует хранить на льду до использования.
    1. Для 3'HSD, добавьте 2 зл 3'HSD в 498 л блокирующего раствора.
    2. Для TH добавьте 0,5 л антитела TH в 499 л блокирующего раствора.
    3. Для катенина добавьте 1 qL антитела к-катенина в 499 л блокирующего раствора.
    4. Для 20'HSD, добавить 1 л 20 "HSD антитела в 499 Л блокирующего раствора.
    5. Для CYP2F2 добавьте 2 qL антитела CYP2F2 в 498 л блокирующего раствора.
  7. Инкубировать с первичным антителом, стряхивая блокирующий раствор со слайдов, и быстро покрывая их достаточным первичным антителом раствором. Инкубировать горки в увлажненной камере на ночь при 4 градусах Цельсия. Во время инкубации горки могут быть покрыты небольшим кусочком парафина, чтобы предотвратить высыхание.
  8. На следующее утро мыть слайды с PBST в течение 5 мин 3x.
  9. Подготовьте вторичный раствор антитела (500 л для двух слайдов) с помощью блокирующего раствора для разбавления биотинилапотированных вторичных антител к желаемой концентрации (например, 1 кЛ антимышечного антитела осла или осла анти-кроличьего антитела в 499 л блокирующих раствора). Раствор следует хранить на льду до использования.
  10. Инкубировать со вторым антителом, стряхивая PBST со слайдов и быстро покрывая их достаточным вторичным антителом раствором. Инкубировать горки в увлажненной камере в течение 1 ч на RT.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если эндогенный биотин является проблемой, используйте пероксидаза-конъюгированных вторичных антител вместо биотинилаповых вторичных антител. Перейти к шагу 1.14 при использовании пероксидазы-конъюгированных вторичных антител в шаге 1.10.
  11. Вымойте слайды с PBST в течение 5 мин 3x.
  12. Подготовьте раствор хрена пероксидазы-конъюгированного стрептавидина (SA-HRP) (500 л для двух слайдов), добавив 0,5 л SA-HRP в 499 Л ПБС. Окончательная концентрация составляет 1 мкг/мл.
  13. Инкубировать с решением SA-HRP. Встряхните PBST со слайдов и быстро покройте слайды достаточным решением SA-HRP. Инкубировать горки в увлажненной камере для 0,5 ч на RT.
  14. Вымойте слайды с PBST в течение 5 мин 3x.
  15. Подготовьте раствор фторофор-тирамид путем разбавления флюорофор-тирамид его буфером разбавления в соответствии с инструкциями производителя (например, 5 л флюорофор-тирамида в 496 л буфера разбавления).
  16. Выполните развитие сигнала с помощью фторофора-тирамида, стряхивая PBST со слайдов и быстро покрывая слайды достаточным раствором фторрофора-тирамида. Инкубировать в увлажненной камере в течение 1 мин на RT. Время инкубации может быть скорректировано для получения желаемой интенсивности флуоресценции. Остановите реакцию, переведя слайды в банку Коплина, содержащую PBST. Вымойте слайды с PBST для 3 мин 2x.
  17. Сигналы могут быть быстро проверены под флуоресцентным микроскопом, чтобы подтвердить результат на данном этапе. Если крышки не используются, нанесите каплю глицерола:PBS (1:1) на каждый раздел, чтобы сохранить образцы влажными. Вымойте слайды с PBST для 3 мин 2x. Слайды могут храниться в PBST при 4 градусах по Цельсию в течение нескольких дней, прежде чем перейти к следующему шагу.

2. Стрип первое антитело

  1. Поместите слайды в 275 мл кипящего раствора цитрата натрия (10 мм, рН 6,0) не менее 8 мин. Держите раствор кипения, поместив слайды плоскими на дно 14 х 9,5 х 9 см3 (W x L x H) пипетка наконечник поле с крышкой и микроволновой печи раствор на 70% мощность юаней. Если предпочтение отдает более длительное время зачистки, может потребоваться дополнить буфер с помощью кипящего натриевого цитрата, чтобы слайды постоянно погружались в буферное решение. Снимите трубную коробку из микроволновой печи, откройте крышку и дайте раствору остыть на RT не менее 20 минут.
  2. Перенесите слайды в банку Coplin, содержащую PBST. Вымойте с PBST в течение 5 мин 3x. Если следующий шаг, если не выполняется немедленно, хранить слайды в банку Коплин с PBST на RT в течение нескольких часов или при 4 градусов по Цельсию в течение 1-2 дней.

3. Пятно со вторым антителом

  1. Начните с блокирующего шага и следуйте тем же процедурам в шаге 1.5 через шаг 1.14. На этапах разработки сигнала (шаг 1.15 и шаг 1.16) используйте фторофор-тирамид в другом спектре флуоресценции.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Слайды могут быть лишены с помощью этого метода несколько раз, чтобы мультиплекс окрашивания. Последнее антитело не требует флюорофор-тирамид в качестве репортера. Фторофор-конъюгированные вторичные антитела могут быть использованы для показа сигналов от последнего первичного антитела.
  2. Инкубировать слайды с 2 мкг/мл 4',6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI) или Hoechst решение в течение 1 мин на RT, если ядерная счетчик окрашивания необходимо. Затем мыть слайды с PBST в течение 3 мин 2x.

4. Изображение с помощью флуоресцентного микроскопа для обнаружения сигналов

  1. Установите крышку с каплей монтажа среды подходит для иммунофлуоресценции.
  2. Для визуализации используйте флуоресцентный микроскоп для обнаружения сигналов каждого канала флуоресценции. Начните с ядерного окрашивания (DAPI) канал и 4x объектив, чтобы найти ткани на слайде.
  3. Переключитесь на 10-x объектив для визуализации. Отрегулируйте время экспозиции (300 мс) и интенсивность источника света (интенсивность 80%). Отрегулируйте эти настройки, если сигнал слишком яркий или слишком темный. Сфотографируйте каждый канал, не двигая сцену. Для каждого канала может потребоваться переориентация. Слияние изображений с каждого канала с помощью программного обеспечения микроскопа или ImageJ (imagej.nih.gov/ij/).

Результаты

Результаты были получены из образцов, обработанных со всеми описанными шагами, включая шаг поиска антигена 1.2. Все вторичные антитела, используемые здесь, были биотинителами. Флурофор-тирамид использовался для разработки сигналов от первого и второго первичных антит?...

Обсуждение

Мультиплекс иммуностоинг полезно для изучения клеточной колокализации двух или более антигенов. Этот широко используемый метод дает убедительные результаты colocalization когда главным образом антитела спрягиваются с по-разному репортерами (сразу окрашивание). Тем не менее, прямое окрашив?...

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа поддерживается NIH R00 HD032636.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Antifade Mounting MediumVector LaboratoriesH-1000
Biotinylated donkey anti-mouseJacksonImmuno715-066-1511:500 dilution
Biotinylated donkey anti-rabbitJacksonImmuno711-066-1521:500 dilution
DAPIBioLegend4228012 μg/mL in distilled water
Fluorescence microscopeECHORevolve 4
Horseradish peroxidase-conjugated streptavidinJacksonImmuno016-030-0841:1,000 dilution
Microwave oven, 700 WGeneral ElectricJEM3072DH1BB
Mouse anti-CYP2F2Santa CruzSC-3745401:250 dilution
Mouse anti-THSanta CruzSC-252691:1,000 dilution
Normal donkey serumJacksonImmuno017-000-1212% serum in PBST
Rabbit anti-20αHSDKerafastEB40021:500 dilution
Rabbit anti-3βHSDTransGenicKO6071:250 dilution
Rabbit anti-THNOVUSNB300-1091:1,000 dilution
Rabbit anti-β-cateninAbcamab325721:500 dilution
Streptavidin Horseradish Peroxidase (SA-HRP)JacksonImmuno016-303-0841:1,000 dilution
TSA Cy3 TyramidePerkinElmerSAT704B001EA1:100 dilution
TSA Fluorescein TyramidePerkinElmerSAT701001EA1:100 dilution

Ссылки

  1. Lewis Carl, S. A., Gillete-Ferguson, I., Ferguson, D. G. An indirect immunofluorescence procedure for staining the same cryosection with two mouse monoclonal primary antibodies. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 41 (8), 1273-1278 (1993).
  2. Lan, H. Y., Mu, W., Nikolic-Paterson, D. J., Atkins, R. C. A novel, simple, reliable, and sensitive method for multiple immunoenzyme staining: use of microwave oven heating to block antibody crossreactivity and retrieve antigens. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 43 (1), 97-102 (1995).
  3. Tornehave, D., Hougaard, D. M., Larsson, L. Microwaving for double indirect immunofluorescence with primary antibodies from the same species and for staining of mouse tissues with mouse monoclonal antibodies. Histochemistry and Cell Biology. 113 (1), 19-23 (2000).
  4. Kim, M., Soontornniyomkij, V., Ji, B., Zhou, X. System-wide immunohistochemical analysis of protein co-localization. PLoS One. 7 (2), e32043 (2012).
  5. Bolognesi, M. M., et al. Multiplex Staining by Sequential Immunostaining and Antibody Removal on Routine Tissue Sections. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 65 (8), 431-444 (2017).
  6. Toth, Z. E., Mezey, E. Simultaneous visualization of multiple antigens with tyramide signal amplification using antibodies from the same species. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 55 (6), 545-554 (2007).
  7. Buchwalow, I., Samoilova, V., Boecker, W., Tiemann, M. Multiple immunolabeling with antibodies from the same host species in combination with tyramide signal amplification. Acta Histochemica. 120 (5), 405-411 (2018).
  8. Bauer, M., Schilling, N., Spanel-Borowski, K. Limitation of microwave treatment for double immunolabelling with antibodies of the same species and isotype. Histochemistry and Cell Biology. 116 (3), 227-232 (2001).
  9. Pirici, D., et al. Antibody elution method for multiple immunohistochemistry on primary antibodies raised in the same species and of the same subtype. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 57 (6), 567-575 (2009).
  10. Glass, G., Papin, J. A., Mandell, J. W. SIMPLE: a sequential immunoperoxidase labeling and erasing method. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 57 (10), 899-905 (2009).
  11. Zhang, W., et al. Fully automated 5-plex fluorescent immunohistochemistry with tyramide signal amplification and same species antibodies. Laboratory Investigation. 97 (7), 873-885 (2017).
  12. Paul, A., Laufer, E. Endogenous biotin as a marker of adrenocortical cells with steroidogenic potential. Molecular and Cellular Endocrinology. 336 (1-2), 133-140 (2011).
  13. Bussolati, G., Gugliotta, P., Volante, M., Pace, M., Papotti, M. Retrieved endogenous biotin: a novel marker and a potential pitfall in diagnostic immunohistochemistry. Histopathology. 31 (5), 400-407 (1997).
  14. Wang, H., Pevsner, J. Detection of endogenous biotin in various tissues: novel functions in the hippocampus and implications for its use in avidin-biotin technology. Cell and Tissue Research. 296 (3), 511-516 (1999).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

156

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены