Microwaving e Fluorophore-Tyramide per l'immunostainizzazione multiplex sulle intendire del mouse - Utilizzo di anticorpi primari non conformi della stessa specie ospite

Riepilogo

Sono stati stabiliti diversi metodi per l'immunostaining multiplex utilizzando anticorpi primari della stessa specie ospite. Qui, descriviamo l'uso di anticorpi mediati a microonde e di fluoroforo-tiramide per bloccare la reattività incrociata dell'anticorpo durante l'immunostaining multiplex su sezioni adrenali del topo con paraffina fissata in formalina.

Abstract

L'immunostazione è ampiamente utilizzata nella ricerca biomedica per mostrare il modello di espressione cellulare di una data proteina. L'immunostaining multiplex consente l'etichettatura utilizzando più anticorpi primari. Per ridurre al minimo la reattività incrociata degli anticorpi, l'immunostaining multiplex che utilizza la colorazione indiretta richiede anticorpi primari senza etichetta provenienti da diverse specie ospiti. Tuttavia, la combinazione appropriata di diversi anticorpi di specie non è sempre disponibile. Qui, descriviamo un metodo di utilizzo di anticorpi primari non etichettati provenienti dalla stessa specie ospite (ad esempio, in questo caso entrambi gli anticorpi provengono dal coniglio) per l'immunofluorescenza multiplex sulle sezioni surrenali con paraffina fissata a formalina (FFPE). Questo metodo utilizza la stessa procedura e reagenti utilizzati nella fase di recupero dell'antigene per rimuovere l'attività del complesso anticorpale primario precedentemente macchiato. I vetrini sono stati macchiati con il primo anticorpo primario utilizzando un protocollo di immunostaining generale seguito da un passo di legame con un anticorpo secondario biotinylato. Poi, un metodo di sviluppo del segnale avidina-biotina-perossidasi è stato utilizzato con fluoroforo-tiramide come substrato. L'immunoattività del primo complesso di anticorpi primari è stata ridotta attraverso l'immersione in una soluzione di citrato di sodio bollente a microonde per 8 min. La deposizione insolubile fluoroforo-tiramide è rimasta sul campione, il che ha permesso di colorare la diapositiva con altri anticorpi primari. Anche se questo metodo elimina la maggior parte dei segnali falsi positivi, alcuni sfondi da anticorpo reattività incrociata può rimanere. Se i campioni sono arricchiti con biotina endogena, un anticorpo secondario coniugato perossidia può essere utilizzato per sostituire l'anticorpo secondario biotinylato per evitare il falso positivo dalla biotina endogena recuperata.

Introduzione

Nell'immunostaining multiplex, la colorazione diretta che utilizza anticorpi primari coniugati può fornire risultati informativi. Senza l'uso di anticorpi secondari, il metodo di colorazione diretta ha un basso rischio di falsi segnali di co-localizzazione da reattività incrociata degli anticorpi. Tuttavia, i reporter coniugati (fluoroforo, enzimi) o biotina sull'anticorpo primario ne limitano l'uso futuro. In alternativa, l'immunostaining indiretto di solito fornisce segnali più forti utilizzando un anticorpo primario non coniugato con un anticorpo secondario etichettato. Idealmente, gli anticorpi primari non coniugati utilizzati nell'immunostaining multiplex dovrebbero provenire da diverse specie ospiti per evitare la reattività incrociata degli anticorpi. Tuttavia, l'appropriata combinazione di anticorpi primari di diverse specie ospiti non è sempre disponibile.

Sono stati stabiliti diversi metodi per eliminare il rischio che l'anticorpo secondario reagisca con un anticorpo primario indesiderato. Un metodo comune è l'uso di un anticorpo monomerico F(ab) per bloccare eventuali epitopi leganti rimanenti sul primo complesso anticorpo primario prima della colorazione con il secondo anticorpo primario¹. Lo stripping anticorpale, che è simile alla striscia e resonera di un foglio di macchia occidentale, rimuove il complesso anticorpale precedentemente macchiato senza spogliare la deposizione di molecole di reporter rilevabili come 3,3'-diaminobenzidine tetraidrocloruro (DAB)² e la deposizione di tyramide fluorescente^{3 .} Con questo metodo, le molecole reporter in colori diversi possono mostrare un risultato multiplex sulla stessa diapositiva. La colorazione multiplex è anche realizzabile con la completa rimozione degli strati precedentemente depositati di anticorpi e l'allineamento di immagini successivamente acquisite da altri anticorpi^4,5. Tutti questi metodi danno risultati affidabili, anche se ogni metodo ha i suoi limiti e richiede procedure complicate o un sistema di imaging speciale.

Il presente protocollo mostra l'applicazione di un metodo di rimozione degli anticorpi con l'uso di buffer comunemente disponibili. Questo protocollo può essere utilizzato per eseguire una colorazione multiplex immunofluorescente su sezioni surrenali con paraffina fissata in forma di forma (FFPE) con due anticorpi primari non etichettati della stessa specie ospite.

Protocollo

1. Colorazione con il primo anticorpo

1. Dewax e reidratato FFPE vetrini con 5 min assegnati a ciascuno dei seguenti passaggi: xilene o reagenti equivalenti 3x, 100% etanolo 2x, 95% etanolo 1x, 70% etanolo 1x, 50% etanolo 1x, e acqua distillata 2x.
   NOTA: I vetrini devono rimanere umidi a partire da questa fase di reidratazione fino al montaggio nella fase finale.
2. Per il recupero dell'antigene opzionale, posizionare i vetrini in 275 mL di soluzione di citrato di sodio bollente (10 mM, pH e 6,0) per 8 min. Per mantenere la soluzione bollente, posizionare i vetrini piatti sul fondo di una scatola di punta pipetta 14 x 9 x 9 cm³ (W x L x H) con un coperchio e un forno a microonde la soluzione è del 70% di potenza in un forno a microonde 700 W per 8 min. Quindi rimuovere la scatola di punta pipetta dal forno a microonde, aprire il coperchio e lasciare raffreddare la soluzione a temperatura ambiente (RT) per almeno 20 minuti.
3. Trasferire i vetrini in un barattolo Coplin contenente PBST (fosfato-buffered salina con 0.1% polisorbate 20/80). Lavare con PBST per 5 min 3x. Se non si sposta immediatamente al passaggio successivo, conservare i vetrini in questo passaggio con PBST in un barattolo Coplin a RT per alcune ore o a 4 gradi centigradi per 1-2 giorni, se non si passa immediatamente al passaggio successivo.
4. Per preparare la soluzione di blocco utilizzare il siero normale delle specie ospiti dell'anticorpo secondario come reagente di blocco. Possono essere utilizzati anche altri reagenti di blocco commerciali. Se si utilizza il siero normale impiegato per lo studio presentato in questo studio, aggiungere 100 l di siero d'asino normale a 4,9 mL di PBST. La soluzione di blocco può essere conservata a 4 gradi centigradi per un massimo di 3 giorni.
5. Per il blocco, scrollarsi di dosso il PBST dalle diapositive e coprirli rapidamente con una soluzione di blocco sufficiente. Incubare gli scivoli a RT in una camera umidificata per 30 min.
6. Preparare la soluzione anticorpale primaria (500 -L per due vetrini) utilizzando la soluzione di blocco per diluire l'anticorpo primario alla concentrazione desiderata. La soluzione deve essere conservata sul ghiaccio fino all'uso.
   1. Per 3-HSD, aggiungere 2 - L L di 3 -HSD in 498 - L di soluzione di blocco.
   2. Per TH, aggiungere 0,5 l'anticorpo TH in 499 - L di soluzione di blocco.
   3. Per la soluzione di blocco di z-catenina, aggiungere 1 L-L di anti-catenina in 499 l di soluzione di blocco.
   4. Per 20 o HSD, aggiungere 1 OL di 20 -HSD anticorpo in 499 - L di soluzione di blocco.
   5. Per CYP2F2, aggiungere 2 -L dell'anticorpo CYP2F2 in 498 - L di soluzione di blocco.
7. Incubare con l'anticorpo primario scrollando si scrolla la soluzione di blocco dai vetrini e coprendoli rapidamente con una soluzione di anticorpi primari sufficiente. Incubare gli scivoli in una camera umidificata durante la notte a 4 gradi centigradi. Durante l'incubazione i vetrini possono essere coperti da un piccolo pezzo di pellicola di paraffina per evitare l'essiccazione.
8. La mattina dopo lavare i vetrini con PBST per 5 min 3x.
9. Preparare la soluzione anticorpale secondaria (500 o L per due vetrini) utilizzando la soluzione di blocco per diluire l'anticorpo secondario biotinylato alla concentrazione desiderata (ad es., 1 l di anticorpi anti-topi anti-tono o anti-coniglio asino in 499 soluzione). La soluzione deve essere conservata sul ghiaccio fino all'uso.
10. Incubare con il secondo anticorpo scrollando si strappa il PBST dai vetrini e coprendoli rapidamente con una soluzione di anticorpi secondari sufficiente. Incubare i vetrini in una camera umidificata per 1 h a RT.
    NOTA: Se la biotina endogena è una preoccupazione, utilizzare un anticorpo secondario coniugato perossidasi invece dell'anticorpo secondario biotinylato. Passare al passaggio 1.14 se si utilizza un anticorpo secondario coniugato perossidasi nel passaggio 1.10.
11. Lavare i vetrini con PBST per 5 min 3x.
12. Preparare la soluzione di streptavidina coniugata a rafano (SA-HRP) (500 -L per due vetrini) aggiungendo 0,5 l di SA-HRP in 499 L di PBS. La concentrazione finale è di 1 g/mL.
13. Incubare con la soluzione SA-HRP. Agitare PBST dalle diapositive e coprire rapidamente le diapositive con una soluzione SA-HRP sufficiente. Incubare i vetrini in una camera umidificata per 0,5 h a RT.
14. Lavare i vetrini con PBST per 5 min 3x.
15. Preparare la soluzione fluoroforo-tiramide diluindo fluoroforo-tyramide con il suo tampone di diluizione secondo le istruzioni del produttore (ad es., 5 l di fluoroforo-tyramide in 496 - L di tampone di diluizione).
16. Eseguire lo sviluppo del segnale con fluoroforo-tiramide scrollandosi di dosso il PBST dai vetrini e coprendo rapidamente i vetrini con sufficiente soluzione fluoroforo-tiramide. Incubare in una camera umidificata per 1 min a RT. Il tempo di incubazione può essere regolato per ottenere l'intensità di fluorescenza desiderata. Interrompere la reazione trasferendo le diapositive in un barattolo Coplin contenente PBST. Lavare i vetrini con PBST per 3 min 2x.
17. I segnali possono essere controllati rapidamente al microscopio a fluorescenza per confermare il risultato in questa fase. Se non vengono utilizzati copricopertine, applicare una goccia di glicerol:PBS (1:1) su ogni sezione per mantenere i campioni umidi. Lavare i vetrini con PBST per 3 min 2x. Le diapositive possono essere conservate in PBST a 4 gradi centigradi per alcuni giorni prima di passare alla fase successiva.

2. Spoglia il primo anticorpo

1. Posizionare i vetrini in 275 mL di soluzione di citrato di sodio bollente (10 mM, pH - 6,0) per almeno 8 min. Se si preferisce un tempo di stripping più lungo, potrebbe essere necessario ricaricare il buffer utilizzando una soluzione di citrato di sodio bollente per mantenere sempre i vetrini immersi in una soluzione tampone. Togliere la scatola di punta della pipetta dal forno a microonde, aprire il coperchio e lasciare raffreddare la soluzione a RT per almeno 20 minuti.
2. Trasferire le diapositive in un barattolo Coplin contenente PBST. Lavare con PBST per 5 min 3x. Se il passaggio successivo se non viene eseguito immediatamente, conservare i vetrini in un barattolo Coplin con PBST a RT per alcune ore o a 4 gradi centigradi per 1-2 giorni.

3. Macchia con il secondo anticorpo

1. Iniziare dal passaggio di blocco e seguire le stesse procedure nel passaggio da 1.5 a 1.14. Nelle fasi di sviluppo del segnale (passaggio 1.15 e 1.16), utilizzare il fluoroforo-tyramide in un spettro di fluorescenza diverso.
   NOTA: Le diapositive possono essere rimosse utilizzando questo metodo più volte per consentire la colorazione multiplex. L'ultimo anticorpo non richiede fluoroforo-tiramide come reporter. Un anticorpo secondario coniugato a fluoroforo potrebbe essere usato per mostrare segnali dall'ultimo anticorpo primario.
2. Incubare i vetrini con soluzione DAPI (DaPI) o Hoechst per 1 min a RT se è necessario il contro-macchia nucleare. Quindi lavare i vetrini con PBST per 3 min 2x.

4. Imaging utilizzando un microscopio a fluorescenza per rilevare i segnali

1. Montare un coperchio con una goccia di mezzo di montaggio adatto per l'immunofluorescenza.
2. Per l'imaging, utilizzare un microscopio a fluorescenza per rilevare i segnali di ogni canale di fluorescenza. Iniziare con il canale di colorazione nucleare (DAPI) e la lente 4x per individuare il tessuto sul vetrino.
3. Passare all'obiettivo 10x per l'imaging. Regolare il tempo di esposizione (300 ms) e l'intensità della sorgente luminosa (80% di intensità). Regolare queste impostazioni se il segnale è troppo luminoso o troppo scuro. Scatta foto di ogni canale senza spostare il palco. Per ogni canale potrebbe essere necessaria una rifocalizzazione. Unire le immagini di ogni canale utilizzando il software del microscopio o ImageJ (imagej.nih.gov/ij/).

Risultati

I risultati sono stati ottenuti da campioni trattati con tutti i passaggi descritti, incluso il passaggio 1.2 di recupero dell'antigene. Tutti gli anticorpi secondari utilizzati qui sono stati biotinylati. Fluorophore-tyramide è stato utilizzato per sviluppare segnali dal primo e dal secondo anticorpo primario. Le immagini sono state catturate utilizzando un microscopio a fluescenza dotato di cubo FITC (per la fluorescenza verde), un cubo TxRED (per Cy3) e un cubo DAPI (per DAPI).

Discussione

L'immunostaining multiplex è utile per esaminare la co-localizzazione cellulare di due o più antigeni. Questa tecnica ampiamente utilizzata fornisce risultati convincenti di co-localizzazione quando gli anticorpi primari sono coniugati con diversi reporter (colorazione diretta). Tuttavia, la colorazione diretta di solito fornisce segnali più deboli rispetto alla colorazione indiretta, che coinvolge anticorpi secondari coniugati per rilevare gli anticorpi primari. Nella colorazione indiretta, un risultato immunostainin...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antifade Mounting Medium	Vector Laboratories	H-1000
Biotinylated donkey anti-mouse	JacksonImmuno	715-066-151	1:500 dilution
Biotinylated donkey anti-rabbit	JacksonImmuno	711-066-152	1:500 dilution
DAPI	BioLegend	422801	2 μg/mL in distilled water
Fluorescence microscope	ECHO	Revolve 4
Horseradish peroxidase-conjugated streptavidin	JacksonImmuno	016-030-084	1:1,000 dilution
Microwave oven, 700 W	General Electric	JEM3072DH1BB
Mouse anti-CYP2F2	Santa Cruz	SC-374540	1:250 dilution
Mouse anti-TH	Santa Cruz	SC-25269	1:1,000 dilution
Normal donkey serum	JacksonImmuno	017-000-121	2% serum in PBST
Rabbit anti-20αHSD	Kerafast	EB4002	1:500 dilution
Rabbit anti-3βHSD	TransGenic	KO607	1:250 dilution
Rabbit anti-TH	NOVUS	NB300-109	1:1,000 dilution
Rabbit anti-β-catenin	Abcam	ab32572	1:500 dilution
Streptavidin Horseradish Peroxidase (SA-HRP)	JacksonImmuno	016-303-084	1:1,000 dilution
TSA Cy3 Tyramide	PerkinElmer	SAT704B001EA	1:100 dilution
TSA Fluorescein Tyramide	PerkinElmer	SAT701001EA	1:100 dilution