Microwaving y fluorofore-Tyramida para inmunomanchado multiplex en las adrenales del ratón - Uso de anticuerpos primarios no conjugados de la misma especie anfitriona

Resumen

Se han establecido varios métodos diferentes para la inmunomanchación múltiple utilizando anticuerpos primarios de la misma especie huésped. Aquí, describimos el uso de desmontaje de anticuerpos mediados por microondas y de taquimida de fluoróforo para bloquear la reactividad cruzada de anticuerpos durante la inmunomancha multiplex en secciones suprarrenales de ratón incrustadas en parafina fija sin forfina.

Resumen

La inmunomancha es ampliamente utilizada en la investigación biomédica para mostrar el patrón de expresión celular de una proteína dada. La inmunomancha múltiple permite el etiquetado con múltiples anticuerpos primarios. Para minimizar la reactividad cruzada de anticuerpos, la inmunomancha múltiple mediante tinción indirecta requiere anticuerpos primarios sin etiquetar de diferentes especies huésped. Sin embargo, la combinación adecuada de diferentes especies de anticuerpos no siempre está disponible. Aquí, describimos un método de uso de anticuerpos primarios sin etiquetar de la misma especie huésped (por ejemplo, en este caso, ambos anticuerpos son de conejo) para la inmunofluorescencia múltiplex en secciones suprarrenales de ratón con incrustación de parafina fijada en formalina (FFPE). Este método utiliza el mismo procedimiento y reactivos utilizados en el paso de recuperación de antígenos para eliminar la actividad del complejo de anticuerpos primarios previamente manchado. Las diapositivas se teñieron con el primer anticuerpo primario utilizando un protocolo general de inmunomanchado seguido de un paso de unión con un anticuerpo secundario biotinilado. Luego, se utilizó un método de desarrollo de señal de avidina-biotina-peroxidasa con fluoróforo-tiramida como sustrato. La inmunoactividad del primer complejo de anticuerpos primarios se desprendía a través de la inmersión en una solución de citrato de sodio hirviendo por microondas durante 8 min. La deposición insoluble de fluoróforo-tiramida permaneció en la muestra, lo que permitió que la diapositiva se manchase con otros anticuerpos primarios. Aunque este método elimina la mayoría de las señales falsas positivas, puede quedar algún fondo de la reactividad cruzada de anticuerpos. Si las muestras se enriquecen con biotina endógena, se puede utilizar un anticuerpo secundario conjugado por peroxidasa para reemplazar el anticuerpo secundario biotintilado para evitar el falso positivo de la biotina endógena recuperada.

Introducción

En la inmunomancha múltiple, la tinción directa con anticuerpos primarios conjugados puede proporcionar resultados informativos. Sin el uso de anticuerpos secundarios, el método de tinción directa tiene un bajo riesgo de señales de colocalización falsas debido a la reactividad cruzada de anticuerpos. Sin embargo, los reporteros conjugados (fluoróforo, enzimas) o biotina en el anticuerpo primario limitan su uso futuro. Alternativamente, la inmunomancha indirecta generalmente proporciona señales más fuertes mediante el uso de un anticuerpo primario no conjugado con un anticuerpo secundario etiquetado. Idealmente, los anticuerpos primarios no conjugados utilizados en la inmunomancha múltiple deben provenir de diferentes especies anfitrionas para evitar la reactividad cruzada de anticuerpos. Sin embargo, la combinación adecuada de anticuerpos primarios de diferentes especies anfitrionas no siempre está disponible.

Se han establecido varios métodos para eliminar el riesgo de que el anticuerpo secundario reaccione con un anticuerpo primario no deseado. Un método común es el uso de un anticuerpo monomérico F(ab) para bloquear los epítopos de unión restantes en el primer complejo de anticuerpos primarios antes de manchar con el segundo anticuerpo primario¹. El desmontaje de anticuerpos, que es similar a la tira y resondas de una hoja de manchas occidentales, elimina el complejo de anticuerpos previamente teñidos sin eliminar la deposición de moléculas de reportero detectables como el tetrahidrocloruro de 3,3'-diaminobenzidina (DAB)² y la deposición de tiramida fluorescente³. Con este método, las moléculas de reportero en diferentes colores pueden mostrar un resultado multiplex en la misma diapositiva. La tinción múltiple también se puede lograr mediante la eliminación completa de las capas de anticuerpos previamente depositadas y la alineación de las imágenes adquiridas posteriormente de otros anticuerpos^4,5. Todos estos métodos proporcionan resultados fiables, aunque cada método tiene sus limitaciones y requiere procedimientos complicados o un sistema de imágenes especial.

El presente protocolo muestra la aplicación de un método de desmontaje de anticuerpos con el uso de búferes comúnmente disponibles. Este protocolo se puede utilizar para realizar la tinción inmunofluorescente múltiple x en secciones suprarrenales de ratón con incrustación de parafina fija de formalina (FFPE) con dos anticuerpos primarios sin etiquetar de la misma especie huésped.

Protocolo

1. Manchado con el primer anticuerpo

1. Dewax y rehidratar los portaobjetos FFPE con 5 min asignados a cada uno de los siguientes pasos: xileno o reactivos equivalentes 3x, 100% etanol 2x, 95% etanol 1x, 70% etanol 1x, 50% etanol 1x, y agua destilada 2x.
   NOTA: Las diapositivas deben permanecer húmedas a partir de este paso de rehidratación hasta el montaje en el paso final.
2. Para la recuperación opcional de antígenos, coloque las diapositivas en 275 ml de solución de citrato de sodio hirviendo (10 mM, pH a 6,0) durante 8 min. Para mantener la solución hirviendo, coloque los portaobjetos planos en la parte inferior de una caja de punta de pipeta de 14 x 9,5 x 9 cm³ (Ancho x L x Al) con tapa y microondas la solución con una potencia del 70% en un horno microondas de 700 W durante 8 min. A continuación, retire la caja de punta de pipeta del horno microondas, abra la tapa y deje que la solución se enfríe a temperatura ambiente (RT) durante al menos 20 minutos.
3. Transfiera las diapositivas en un frasco de Coplin que contenga PBST (solución salina con fosfato con polisorbato 20/80). Lavar con PBST durante 5 min 3x. Si no se mueve inmediatamente al siguiente paso, almacene las diapositivas en este paso con PBST en un frasco de Coplin en RT durante unas horas o a 4 oC durante 1-2 días si no se mueve inmediatamente al siguiente paso.
4. Para preparar la solución de bloqueo utilice el suero normal de las especies anfitrionas del anticuerpo secundario como reactivo de bloqueo. También se pueden utilizar otros reactivos de bloqueo comercial. Si utiliza suero normal empleado para el estudio presentado en este estudio, agregue 100 ml de suero de burro normal a 4,9 ml de PBST. La solución de bloqueo se puede almacenar a 4 oC durante un máximo de 3 días.
5. Para el bloqueo, sacuda el PBST de las diapositivas y cúbralos rápidamente con suficiente solución de bloqueo. Incubar los portaobjetos a RT en una cámara humidificada durante 30 min.
6. Preparar la solución de anticuerpos primarios (500 ml para dos diapositivas) utilizando la solución de bloqueo para diluir el anticuerpo primario a la concentración deseada. La solución debe almacenarse en hielo hasta su uso.
   1. Para 3HSD, agregue 2 sde 3sD en 498 ml de solución de bloqueo.
   2. Para TH, agregue 0,5 ml de anticuerpo TH a 499 ml de solución de bloqueo.
   3. Para la -catenina, añadir 1 l de anticuerpo de la catenina en 499 l de solución de bloqueo.
   4. Para 20-HSD, agregue 1 l de anticuerpo de 20-HSD en 499 sdesde bloqueo.
   5. Para CYP2F2, añadir 2 ml de anticuerpo CYP2F2 en 498 ml de solución de bloqueo.
7. Incubar con el anticuerpo primario sacudiendo la solución de bloqueo de las diapositivas y cubriéndolos rápidamente con suficiente solución de anticuerpos primarios. Incubar los portaobjetos en una cámara humidificada durante la noche a 4oC. Durante la incubación, los portaobjetos pueden estar cubiertos por un pequeño trozo de película de parafina para evitar que se sequen.
8. A la mañana siguiente lavar los portatores con PBST durante 5 min 3x.
9. Preparar la solución secundaria de anticuerpos (500 ml para dos diapositivas) utilizando la solución de bloqueo para diluir el anticuerpo secundario biotinylado a la concentración deseada (p. ej., 1 l de anticuerpo anti-ratón de burro o anticuerpo anticonejo de burro en 499 oL de bloqueo solución). La solución debe almacenarse en hielo hasta su uso.
10. Incubar con el segundo anticuerpo sacudiendo PBST de las diapositivas y cubriéndolos rápidamente con suficiente solución secundaria de anticuerpos. Incubar los portaobjetos en una cámara humidificada durante 1 h a RT.
    NOTA: Si la biotina endógena es una preocupación, utilice un anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa en lugar del anticuerpo secundario biotinulado. Vaya al paso 1.14 si utiliza un anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa en el paso 1.10.
11. Lave los portaobjetos con PBST durante 5 min 3x.
12. Preparar la solución de estriptavidina conjugada con peroxidasa de rábano picante (SA-HRP) (500 l para dos diapositivas) añadiendo 0,5 ml de SA-HRP a 499 l de PBS. La concentración final es de 1 g/ml.
13. Incubar con la solución SA-HRP. Agitar PBST de las diapositivas y cubrir rápidamente las diapositivas con suficiente solución SA-HRP. Incubar los portaobjetos en una cámara humidificada durante 0,5 h a RT.
14. Lave los portaobjetos con PBST durante 5 min 3x.
15. Preparar la solución de fluoróforo-tiramida diluyendo la tampaida de fluorofóforo con su tampón de dilución de acuerdo con las instrucciones del fabricante (por ejemplo, 5 l de fluoroforócor-tiramida en 496 ml de tampón de dilución).
16. Realice el desarrollo de la señal con fluoróforo-tiramida sacudiendo PBST de las diapositivas y cubriendo rápidamente las diapositivas con suficiente solución de taquimida de fluoróforo. Incubar en una cámara humidificada durante 1 min a RT. El tiempo de incubación se puede ajustar para obtener la intensidad de fluorescencia deseada. Detenga la reacción transfiriendo las diapositivas a un frasco de Coplin que contenga PBST. Lave los portaobjetos con PBST durante 3 min 2x.
17. Las señales se pueden revisar rápidamente bajo un microscopio de fluorescencia para confirmar el resultado en esta etapa. Si no se utilizan los cubreobjetos, aplique una gota de glicerol:PBS (1:1) en cada sección para mantener las muestras húmedas. Lave los portaobjetos con PBST durante 3 min 2x. Las diapositivas se pueden almacenar en PBST a 4 oC durante unos días antes de pasar al siguiente paso.

2. Strip the First Anticuerpo

1. Coloque los portaobjetos en 275 ml de solución de citrato de sodio hirviendo (10 mM, pH a 6,0) durante al menos 8 minutos. Mantenga la solución hirviendo colocando los portaobjetos planos en la parte inferior de una caja de punta de pipeta de 14 x 9,5 x 9 cm³ (ancho x l x alto) con tapa y microondiendo la solución a una potencia de 700 W en un horno de microondas de 700 W durante 8 min. Si se prefiere un tiempo de desmontaje más largo, puede ser necesario rematar el tampón utilizando una solución de citrato de sodio hirviendo para mantener las diapositivas sumergidas en la solución tampón en todo momento. Retire la caja de punta de pipeta del horno microondas, abra la tapa y deje que la solución se enfríe en RT durante al menos 20 minutos.
2. Transfiera las diapositivas a un frasco de Coplin que contenga PBST. Lavar con PBST durante 5 min 3x. Si el siguiente paso si no se realiza inmediatamente, guarde las diapositivas en un frasco de Coplin con PBST en RT durante unas horas o a 4 oC durante 1-2 días.

3. Mancha con el segundo anticuerpo

1. Comience desde el paso de bloqueo y siga los mismos procedimientos en el paso 1.5 al paso 1.14. En los pasos de desarrollo de la señal (paso 1.15 y paso 1.16), utilice el fluoróforo-tiramida en un espectro de fluorescencia diferente.
   NOTA: Las diapositivas se pueden quitar utilizando este método varias veces para permitir la tinción múltiplex. El último anticuerpo no requiere fluoroforóta-tiramida como reportero. Se podría utilizar un anticuerpo secundario conjugado por fluoróforo para mostrar las señales del último anticuerpo primario.
2. Incubar portaobjetos con 2 g/mL 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) o solución Hoechst durante 1 min a RT si se necesita la tinción de contador nuclear. A continuación, lave los portaobjetos con PBST durante 3 min 2x.

4. Imágenes utilizando un microscopio de fluorescencia para detectar señales

1. Montar un cubreobjetos con una gota de medio de montaje adecuado para la inmunofluorescencia.
2. Para obtener imágenes, utilice un microscopio de fluorescencia para detectar señales de cada canal de fluorescencia. Comience con el canal de tinción nuclear (DAPI) y la lente 4x para localizar el tejido en la diapositiva.
3. Cambie a la lente 10x para la toma de imágenes. Ajuste el tiempo de exposición (300 ms) y la intensidad de la fuente de luz (80% de intensidad). Ajuste estos ajustes si la señal es demasiado brillante o demasiado oscura. Tome fotos de cada canal sin mover el escenario. Es posible que sea necesario reenfocar para cada canal. Combine las imágenes de cada canal utilizando el software del microscopio o ImageJ (imagej.nih.gov/ij/).

Resultados

Los resultados se obtuvieron de muestras tratadas con todos los pasos descritos, incluido el paso 1.2 de recuperación de antígenos. Todos los anticuerpos secundarios utilizados aquí fueron biotinylados. El fluoróforo-tiramida se utilizó para desarrollar señales de los anticuerpos primarios primero y segundo. Las imágenes fueron capturadas utilizando un microscopio de fluorescencia equipado con un cubo FITC (para fluorescencia verde), un cubo TxRED (para Cy3) y un cubo DAPI (para DA...

Discusión

La inmunomancha múltiple es útil para examinar la colocalización celular de dos o más antígenos. Esta técnica ampliamente utilizada da resultados convincentes de colocación cuando los anticuerpos primarios se conjugan con diferentes reporteros (tinción directa). Sin embargo, la tinción directa generalmente proporciona señales más débiles en comparación con la tinción indirecta, que implica anticuerpos secundarios conjugados para detectar los anticuerpos primarios. En la tinción indirecta, un resultado de i...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antifade Mounting Medium	Vector Laboratories	H-1000
Biotinylated donkey anti-mouse	JacksonImmuno	715-066-151	1:500 dilution
Biotinylated donkey anti-rabbit	JacksonImmuno	711-066-152	1:500 dilution
DAPI	BioLegend	422801	2 μg/mL in distilled water
Fluorescence microscope	ECHO	Revolve 4
Horseradish peroxidase-conjugated streptavidin	JacksonImmuno	016-030-084	1:1,000 dilution
Microwave oven, 700 W	General Electric	JEM3072DH1BB
Mouse anti-CYP2F2	Santa Cruz	SC-374540	1:250 dilution
Mouse anti-TH	Santa Cruz	SC-25269	1:1,000 dilution
Normal donkey serum	JacksonImmuno	017-000-121	2% serum in PBST
Rabbit anti-20αHSD	Kerafast	EB4002	1:500 dilution
Rabbit anti-3βHSD	TransGenic	KO607	1:250 dilution
Rabbit anti-TH	NOVUS	NB300-109	1:1,000 dilution
Rabbit anti-β-catenin	Abcam	ab32572	1:500 dilution
Streptavidin Horseradish Peroxidase (SA-HRP)	JacksonImmuno	016-303-084	1:1,000 dilution
TSA Cy3 Tyramide	PerkinElmer	SAT704B001EA	1:100 dilution
TSA Fluorescein Tyramide	PerkinElmer	SAT701001EA	1:100 dilution